鼻內(nèi)滴注與氣管滴注PM2.5建立大鼠急性肺損傷模型的比較研究*

張行行，趙 麓，孫欠欠，趙安東，周甜雨，王 川，劉繼平，王 斌

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西 咸陽 712046）

細(xì)顆粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于2.5 μm的大氣顆粒物，是目前我國(guó)空氣污染物的主要組成。近年來空氣污染成為社會(huì)性熱點(diǎn)。由于PM2.5粒徑極小，可以經(jīng)鼻腔、呼吸道而到達(dá)肺，一部分在上呼吸道和肺泡腔沉積引起肺部損傷和炎癥反應(yīng)［1］，另一部分經(jīng)肺循環(huán)進(jìn)入全身血液，引起嚴(yán)重的心血管疾?。?］。相關(guān)研究表明，大氣中PM2.5水平與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率及死亡率密切相關(guān)，大氣中PM2.5濃度每增加10 μg/m3，哮喘病患者人數(shù)增加1.5%［3］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，急性或慢性暴露于PM2.5均能引發(fā)肺部炎癥［4-5］。因此，PM2.5對(duì)人體健康的危害程度遠(yuǎn)大于其他粒徑較大的顆粒物，也成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，使得高效、簡(jiǎn)易、計(jì)量準(zhǔn)確的造模方法成為研究該領(lǐng)域的迫切需要。

氣道染毒是構(gòu)建肺部損傷模型、研究呼吸系統(tǒng)疾病的重要手段，而目前氣道染毒沒有統(tǒng)一的方式，常用的氣道給藥方式包括暴露式氣管滴注、非暴露式氣管滴注和鼻內(nèi)滴注［6］。通過這3種方式給予PM2.5均能造成肺損傷，但暴露式氣管滴注需暴露組織，且適用于單次染毒，故不在本次實(shí)驗(yàn)研究范圍。非暴露式氣管滴注通過氣管插管將PM2.5混懸液直接注射入肺腔導(dǎo)致肺損傷，而鼻內(nèi)滴注利用重力和大鼠呼吸吸入使PM2.5到達(dá)肺部而引起肺損傷。因此，本課題組擬通過對(duì)比這2種方式給予相同劑量PM2.5混懸液對(duì)大鼠Th2應(yīng)答影響，為研究呼吸系統(tǒng)疾病染毒方式的選擇提供參考。

材料和方法

1 動(dòng)物

24只SPF級(jí)SD大鼠，雄性，（220±20）g，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào)為SCXK（川）2020-030］，飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度23～25℃，相對(duì)濕度45%～55%，自由攝食與飲水，晝夜各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》（GB/T 35892－2018）、《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》及陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)規(guī)定和相關(guān)管理?xiàng)l例。

2 主要試劑和儀器

白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）ELISA試劑盒，以及酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）標(biāo)準(zhǔn)比色試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物科技有限公司；IL-17和TGF-β抗體均購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司；HE染液購(gòu)于南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)于均購(gòu)自TaKaRa；戊巴比妥鈉購(gòu)于天津蘭洪新能源科技有限公司。

DNP-9052恒溫箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；PW-812洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司）；SH01D高速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司）；XH-C漩渦混合器（江蘇大唐醫(yī)療器械有限公司）；Multiskan FC酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）；TH-1000CⅡ智能大流量空氣顆粒采樣器（武漢市天虹儀表有限責(zé)任公司）；Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī)（寧波新藝生物科技股份有限公司）；TKY-TKB攤片烤片機(jī)（湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司）；RM2235石蠟切片機(jī)（Leica）；BX53光學(xué)顯微鏡（Olumpus）；XMP102H型超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器有限公司）；UPHW-Ⅱ-90T超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；Exicycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bioneer）。

3 PM2.5的采集與處理

于陜西中醫(yī)藥大學(xué)四號(hào)教學(xué)樓樓頂，使用天虹大流量采樣器采集大氣PM2.5于玻璃纖維膜上，采樣高度為20 m。將載有PM2.5的玻璃纖維膜剪掉邊緣部分，裁剪為1 cm×1 cm大小，分裝于50 mL離心管中，加入純水至40 mL，低溫超聲震蕩60 min，將PM2.5洗脫，1 800目篩過濾，濾液真空冷凍干燥，4℃保存?zhèn)溆?。臨用前，稱取適量PM2.5溶于生理鹽水，配成50 g/L混懸液，紫外燈下照射30 min。

4 方法

4.1 氣管滴注操作方法將19G號(hào)灌胃器針頭處磨平至圓滑，與1 mL醫(yī)用注射器組成進(jìn)樣器，乙醚麻醉大鼠后（麻醉深度以用有齒鑷捏夾大鼠皮膚或腳趾無收縮反應(yīng)為準(zhǔn)），迅速呈仰臥位固定于自制鼠板上，四肢和上切牙均用橡皮筋固定，直立鼠板，使大鼠頭部朝上垂直于桌面，用組織鑷將大鼠舌頭向嘴角一側(cè)拉出口腔直至感覺阻力，插入可視采耳棒，調(diào)整角度，使大鼠口腔環(huán)境呈現(xiàn)于手機(jī)或其他智能設(shè)備上，再插入進(jìn)樣器，使灌胃器針頭部插入氣管口1 cm左右，緩慢推注所需劑量PM2.5混懸液，滴注完成后立即拔出插管，保持大鼠直立，并輕輕左右晃動(dòng)5 s，使混懸液擴(kuò)散均勻，大鼠呼吸帶有濕啰音說明滴注成功，放回鼠籠內(nèi)待蘇醒。注射器量取所需PM2.5混懸液時(shí)，可額外抽取0.5 mL空氣，然后手指輕堵灌胃針口，將藥液甩至空氣底部，注入空氣可使滴注液向肺組織深處擴(kuò)散。見圖1。

Figure 1.Operation process of unexposed tracheal instillation in rats.A：experimental equipment；B：a fixed rat；C：a view of the throat.圖1大鼠非暴露式氣管滴注操作過程

4.2 動(dòng)物分組及給藥24只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（control）、鼻內(nèi)滴注組（nasal）和氣管滴注組（tracheal），每組8只。其中，nasal組大鼠無需麻醉，抓取固定大鼠后，用10～100 μL移液槍吸取200 μL/kg的PM 2.5混懸液（10 mg/kg），緩慢滴入大鼠鼻腔，使其自然吸入呼吸道進(jìn)行染毒；tracheal組大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，按4.1所述方法滴注200 μL/kg的PM2.5混懸液（10 mg/kg）。滴注每3 d一次，共10次。

4.3 觀察一般情況觀察滴注期間各組大鼠活動(dòng)、毛色、飲食和呼吸狀態(tài)，記錄大鼠體重、滴注量、所需時(shí)間（氣管滴注從開始麻醉算）、一次滴注成功率和終成功率。

4.4 血清中IL-6和TGF-β含量的測(cè)定末次染毒完成后，禁食12 h，大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，收集上清液。采用ELISA檢測(cè)IL-6和TGF-β含量，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算實(shí)際樣品中IL-6和TGFβ水平。

4.5 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中ACP、AKP和LDH活性的測(cè)定取血處死大鼠后，結(jié)扎左側(cè)支氣管，采用5 mL注射器分三次吸取10 mL預(yù)冷的PBS對(duì)大鼠右肺進(jìn)行灌洗（回收率達(dá)80%為合格），4℃、3 000 r/min離心10 min，回收上清液，按照試劑盒操作步驟檢測(cè)各樣本中ACP、AKP和LDH活性。

4.6 肺組織病理學(xué)觀察收集完BALF后，取右上肺組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

4.7 肺組織中TGF-β和IL-17蛋白表達(dá)的檢測(cè)取肺組織蠟塊，在二甲苯溶液中脫蠟，并在梯度遞減的乙醇溶液中水化，然后用檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液處理切片，用0.5% Triton X-100溶液透化20 min，用3%H2O2溶液孵育，5%牛血清白蛋白封閉20 min，再與IL-17和TGF-β抗體（1∶500）37℃下溫育1 h，PBS洗滌后，將切片與羊抗兔IgG（1∶1 000）在37℃溫育20 min，經(jīng)DAB顯色、復(fù)染、脫水、透化、固定后，顯微鏡下觀察，并封片、拍照，以ImageJ軟件測(cè)定平均積分吸光度。

4.8 肺組織中IL-17和叉頭框蛋白P3（forkhead box protein P3，F(xiàn)oxp3）mRNA表達(dá)的測(cè)定取各大鼠余下肺組織，TRIzol試劑提取大鼠肺組織總RNA，紫外分光光度測(cè)定RNA濃度及鑒定純度；PrimeScript RT kit將0.5 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，用Exicycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)mRNA表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-17和Foxp3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1.The primer sequences

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；兩兩比較，數(shù)據(jù)方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane T2法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況

滴注過程中，control組大鼠毛色、飲食和行動(dòng)正常，呼吸順暢平穩(wěn)，無其他明顯異常狀態(tài)；nasal組和tracheal組大鼠在滴注4次后毛色變暗、呼吸急促、變得暴躁，且隨著染毒次數(shù)的增多，上述癥狀逐漸加重，但飲食未見明顯異常。3組大鼠體重增長(zhǎng)情況良好，無顯著差異（P＞0.05）；nasal組和tracheal組大鼠滴注操作時(shí)間、一次成功率和終成功率見表2。滴注過程中，鼻內(nèi)滴注組4號(hào)死亡，解剖發(fā)現(xiàn)肺部病變，但不能確定具體死因。

表2 滴注過程中大鼠一般情況Table 2.General conditions of rats during instillation（Mean±SD）

2 肺組織病理學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，control組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡腔內(nèi)無滲出物，肺間質(zhì)無水腫，肺泡間隔均勻且光滑，未見明顯的病理變化和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與control組相比，nasal組大鼠肺組織部分肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，伴有程度不一的萎縮及擴(kuò)張，腔內(nèi)可見少量炎癥細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)；tracheal組大鼠肺組織可見肺泡結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺水腫、肺出血，以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤(rùn)，肺部正常的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)消失，提示tracheal組大鼠肺部損傷較nasal組更為嚴(yán)重，見圖2。

Figure 2.Histopathological examination of SD rat lungs（HE staining，×100）.A：control group；B：nasal group；C：tracheal group.圖2 SD大鼠肺組織病理學(xué)檢查

3 BALF中ACP、AKP和LDH活性

與control組 比 較，nasal組 和tracheal組 大 鼠BALF中的ACP、AKP和LDH活性均顯著升高（P＜0.05）；兩種不同部位滴注相比，tracheal組大鼠BALF中ACP活性顯著較nasal組高（P＜0.05），但AKP和LDH活性無顯著差異（P＞0.05），見圖3。

4 血清中IL-6和TGF-β含量

與control組比較，nasal組和tracheal組大鼠血清IL-6含量顯著升高，TGF-β含量顯著下降（P＜0.05）；兩組不同部位滴注組相比，tracheal組大鼠血清IL-6含量顯著較nasal組高（P＜0.05），但TGF-β含量無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 3.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the activity of ACP，AKP and LDH in BALF of rats.Mean±SD.n=8 in control and tracheal groups；n=7 in nasal group.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖3鼻內(nèi)滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對(duì)大鼠BALF中ACP、AKP和LDH活性的影響

Figure 4.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the serum levels of IL-6 and TGF-β in rats.Mean±SD.n=8 in control and tracheal groups；n=7 in nasal group.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖4鼻內(nèi)滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對(duì)大鼠血清中IL-6和TGF-β含量的影響

5 肺組織IL-17和TGF-β的蛋白表達(dá)

與control組比較，nasal組和tracheal組大鼠肺組織中IL-17蛋白表達(dá)顯著升高，TGF-β蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.05）；兩組不同部位滴注組相比，IL-17蛋白表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），tracheal組TGF-β蛋白表達(dá)較nasal組顯著下降（P＜0.05），見圖5。

6 肺組織IL-17和Foxp3的mRNA表達(dá)

與control組比較，nasal組和tracheal組大鼠肺組織中IL-17 mRNA表達(dá)量和Th17/Treg比值顯著升高（P＜0.05），F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）；與nasal組相比，tracheal組大鼠肺組織中IL-17和Foxp3的mRNA表達(dá)分別有升高和下降的趨勢(shì)，但無顯著差異（P＞0.05），Th17/Treg比值顯著升高（P＜0.05），見圖6。

討 論

近些年來，多位研究者相繼建立了多種氣道染毒方法，主要包括暴露式氣管滴注、非暴露式氣管滴注和鼻內(nèi)滴注。暴露式氣管滴注需要分離頸部皮肉，利用醫(yī)用注射器直接將藥液注射入氣管，成功率高，劑量準(zhǔn)確，但易造成感染，有少量死亡，且適用于單次染毒；非暴露式氣管滴注需要將大鼠麻醉，通過氣管插管將滴注液輸送到肺部，無需手術(shù)切口暴露氣管，染毒劑量準(zhǔn)確且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物傷害較小，可進(jìn)行多次染毒，但一般需要光纖、喉鏡、頭戴式放大鏡、內(nèi)窺鏡等特殊設(shè)備，部分儀器價(jià)格過高，且對(duì)操作者的技能要求較高；鼻內(nèi)滴注通過采用移液槍或小量程注射器將藥液液滴緩慢滴至鼻腔，利用重力和大鼠呼吸吸入，模擬了正常呼吸途徑染毒，但操作過程耗力，大鼠噴出引起劑量不準(zhǔn)確，且多次染毒后，易造成鼻腔腫脹，大鼠變得脾氣暴躁，操作難度加大。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇能長(zhǎng)期多次滴注的非暴露式氣管滴注和鼻內(nèi)滴注，開展兩種滴注方式構(gòu)建的肺損傷模型的比較研究，對(duì)研究PM2.5損傷呼吸道疾病提供參考。在本次實(shí)驗(yàn)中，隨著滴注時(shí)間的延長(zhǎng)，nasal組大鼠鼻腔開始腫大，性情狂躁，且因體型增大，在只用手抓取固定過程中，大鼠掙扎，難以控制。而tracheal組，待操作人熟練了后，麻醉后從固定到插管滴注只需要十幾秒，大多數(shù)時(shí)間花費(fèi)在大鼠的麻醉上，但麻醉過程乙醚濃度過高，易引起大鼠呼吸衰竭和循環(huán)障礙，造成死亡，需把握好乙醚濃度和麻醉時(shí)間。

多項(xiàng)研究表明，PM2.5隨呼吸進(jìn)入呼吸道和肺部以后，可在呼吸道沉淀積累，通過氧化應(yīng)激或炎癥損傷等機(jī)制破壞肺泡腔血管基底膜和毛細(xì)血管膜結(jié)構(gòu)，改變肺泡細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，增加細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種蛋白酶等內(nèi)容物漏出［7］。通過檢測(cè)BALF中的ACP、AKP和LDH水平，可反映肺組織細(xì)胞膜受損程度［8］。本次實(shí)驗(yàn)中，相較于control組，nasal組和tracheal組BALF中ACP、AKP和LDH活性顯著增加，這表明兩種滴注組大鼠肺部結(jié)構(gòu)破壞，肺組織細(xì)胞膜通透性增加。肺組織病理學(xué)觀察也顯示肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，肺間質(zhì)明顯增厚，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，亦表明該染毒組大鼠肺部出現(xiàn)了嚴(yán)重的病理損傷。但兩種染毒組大鼠肺損傷程度存在一定差異，tracheal組大鼠肺損傷程度較nasal組更為明顯，推測(cè)是鼻內(nèi)滴注過程中，鼻腔內(nèi)黏膜組織吸附了一部分的顆粒物，使實(shí)際進(jìn)入到肺組織的顆粒物減少，這也致使了該組大鼠鼻腔腫脹，但此方法模擬了正常呼吸道發(fā)病過程，而氣管滴注是直接將PM2.5混懸液送至氣道，到達(dá)肺組織，沒有經(jīng)過從鼻、呼吸道到肺的過程，損傷更為顯著。

Figure 5.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the protein expression of IL-17 and TGF-β in rat lung tissues（immunohistochemical staining，scale bar=20 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖5鼻內(nèi)滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對(duì)大鼠肺組織IL-17和TGF-β蛋白表達(dá)的影響

Figure 6.Effects of intranasal and tracheal instillation of PM2.5 suspension on the mRNA expression of IL-17 and Foxp3 in rat lung tissues.A：the mRNA expression of IL-17；B：the mRNA expression of Foxp3；C：the ratio of IL-17（representing Th17 cells）/Foxp3（representing Treg cells）.Mean±SD.n=8 in control and tracheal groups；n=7 in nasal group.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs nasal group.圖6鼻內(nèi)滴注和氣管滴注PM2.5混懸液對(duì)大鼠肺組織IL-17和Foxp3 mRNA表達(dá)的影響

Th17和Treg均由CD4+T淋巴細(xì)胞分化而來，在正常條件下，Th17和Treg的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)體內(nèi)自身免疫，而在肺損傷等呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)現(xiàn)伴隨Th17/Treg平衡的失調(diào)［9］。Th17細(xì)胞可以釋放IL-17，促進(jìn)T細(xì)胞增殖和IL-6等炎癥介質(zhì)的表達(dá)，增強(qiáng)Th2應(yīng)答；而Treg細(xì)胞主要通過分泌抗炎細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制作用，并可與Th17細(xì)胞相互拮抗。Foxp3是識(shí)別Treg細(xì)胞的常規(guī)標(biāo)志物，是Treg細(xì)胞分化和表達(dá)功能的關(guān)鍵因子，可通過分泌TGF-β等抑炎因子，減輕炎癥浸潤(rùn)，促進(jìn)病毒清除，避免過度非特異免疫應(yīng)答，抑制Th2應(yīng)答，在抵抗胞外病原體入侵和抑制自身免疫中起著保護(hù)作用［10-12］。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相較于control組，nasal組和tracheal組大鼠血清中IL-6和TGF-β含量顯著升高；肺組織中IL-17的蛋白和mRNA表達(dá)及Th17/Treg比值顯著升高，TGF-β蛋白和Foxp3 mRNA表達(dá)量顯著下降，提示兩種方式滴注PM2.5混懸液均能引起肺部炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)Th2應(yīng)答；但兩種滴注方式相比，tracheal組大鼠血清中IL-6表達(dá)量和肺組織中Th17/Treg比值較nasal組顯著升高，TGF-β蛋白表達(dá)降低，其余指標(biāo)無顯著差異。

綜上所述，鼻內(nèi)滴注和氣管滴注PM2.5混懸液均能增加肺泡細(xì)胞膜和肺泡上皮-毛細(xì)血管膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)各種蛋白酶等內(nèi)容物漏出，對(duì)肺泡細(xì)胞產(chǎn)生毒作用；此外，還可增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，使Th17/Treg比值升高，加強(qiáng)Th2應(yīng)答，導(dǎo)致肺部炎癥損傷，進(jìn)一步促進(jìn)肺部損傷或肺部乃至多器官的衰竭。兩種滴注方式相比，本研究所采用的利用可視挖耳勺代替內(nèi)窺鏡的氣管內(nèi)滴注法具有劑量準(zhǔn)確、可視等優(yōu)點(diǎn)，所構(gòu)建的模型大鼠肺損傷更加明顯，但忽略了ALI正常發(fā)病過程；鼻內(nèi)滴注法具有無需麻醉、易上手、無需借助其他工具、模擬了ALI正常發(fā)展過程等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)操作者較為耗費(fèi)精力，且劑量不準(zhǔn)確。兩種滴注方式具體在劑量和時(shí)間上對(duì)大鼠肺組織損傷影響的差異，還需進(jìn)一步研究。