紅三葉草提取物中四種異黃酮的HPLC檢測方法

李彥軍，鄭 楠，王加啟，趙圣國

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

大豆苷元、染料木素、鷹嘴豆素A和刺芒柄花素是異黃酮類植物雌激素，具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物學(xué)功能（Ludmila等，2019）。研究表明，日糧中添加大豆異黃酮可以改善動物的內(nèi)激素水平（肖凡等，2020），提高斷奶仔豬（林廈菁等，2020）、荷斯坦奶牛犢牛（肖凡等，2020）和羊的生長性能（毛玉平等，2019），以及機(jī)體的抗氧化能力（林廈菁等，2020）。大豆苷元和染料木素可以緩解奶牛泌乳后期產(chǎn)奶量的下降趨勢，在一定程度上提高產(chǎn)奶量，乳蛋白質(zhì)含量也明顯增加（沈菲等，2020；Zhu等，2006），這可能是由于大豆苷元和染料木素促進(jìn)了牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖（劉春龍等，2010）。大豆苷元和染料木素還可以提高鳥類的產(chǎn)蛋性能和蛋殼質(zhì)量，提高飼料轉(zhuǎn)化效率（Cai等，2013；Akdemir等，2009）。另外，鷹嘴豆素A能改變瘤胃微生物的菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)纖維素降解，提高日糧中蛋白質(zhì)的利用率和肉牛的平均日增重，以及緩解瘤胃酸中毒（Harlow等，2021，2017a，2017b；Flythe等，2013）。紅三葉草（Lemeziene等，2015）是大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的主要來源。紅三葉草是多年生的豆科植物，營養(yǎng)豐富、蛋白質(zhì)含量高，是我國主要的牧草之一（鞏建峰，1996）。因此紅三葉草也是反芻動物攝入刺芒柄花素和鷹嘴豆素A等異黃酮的主要來源。王凱等（2017）表示紅三葉草和苜蓿提取物可以提高羔羊的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化率，這主要取決于鷹嘴豆素A與刺芒柄花素等其他異黃酮的交互作用（Harlow等，2020），這表明紅三葉草提取物是一種潛在的可以提高動物生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率的天然飼料添加劑。

為了開發(fā)紅三葉草提取物的相關(guān)產(chǎn)品，需要開發(fā)一種能夠快速、全面、準(zhǔn)確地測定產(chǎn)品中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A含量的HPLC方法。目前，異黃酮的檢測方法主要有紫外分光光度法（陳寒青等，2005）、氣相色譜-質(zhì)譜法（Iannone等，2019；Hossain等，2019）和高效液相色譜法/高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS）（Zhou等，2020；李天雪等，2018；張念等，2011；Krenn等，2006；Delmonte等，2006）。HPLC法具有特異性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確性高的特點。雖然檢測異黃酮的HPLC方法較多，但是能夠同時檢測紅三葉草提取物中鷹嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的方法較少。因此，本實驗旨在建立一種可以同時測定紅三葉草提取物中大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A含量的HPLC檢測方法，以期為紅三葉草提取物產(chǎn)品中四種異黃酮的檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Waters 2695高效液相色譜儀（Waters）；2998二極管陣列檢測器（Waters）；KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾利超聲儀器有限公司）。

鷹嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品全部購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度均≥98%；甲醇為色譜純，購自美國Fisher公司；無水磷酸氫二鈉和鹽酸均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為雙蒸水；6號溶劑購自武漢奧萊特生物科技有限公司；紅三葉草來自甘肅省岷縣。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為χBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters）；流動相為甲醇（A）和10 mmol磷酸氫二鈉溶液（B）；柱溫為40℃；檢測波長為270 nm；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；洗脫梯度見表1。

表1 流動相洗脫梯度%

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液儲備液的配制 分別準(zhǔn)確稱取鷹嘴豆素A、染料木素、刺芒柄花素和大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品20 mg（精確至0.01 mg）于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，配制成濃度為200 μg/mL的儲備液，于-20℃以下保存。

1.2.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制 分別準(zhǔn)確量取10 mL上述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液于50 mL離心管，混勻，然后準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋，配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度分別為50、25、15、10、5、1 μg/mL。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別量取1 mL上述系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液通過0.45 μm濾膜。按照從低濃度到高濃度的順序依次進(jìn)樣，每個樣品連續(xù)進(jìn)樣兩次，取平均值。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程。

1.2.3 紅三葉草提取物的制備 稱取已經(jīng)粉碎的紅三草，加入10倍量80%的乙醇回流提取2次（每次2 h），過濾，合并提取液并減壓濃縮，然后加入5倍量的熱水（85℃以上）攪拌，冷卻至室溫后10000 g離心得到沉淀，加入5倍量的6號溶劑充分?jǐn)嚢杳撝?次（每次2 h），最后10000 g離心，將沉淀物進(jìn)行干燥得到紅三葉草提取物。

1.2.4 檢出限與定量線 將標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液不斷進(jìn)行稀釋，通過上述色譜條件進(jìn)行檢測，以3倍信噪比（S/N=3）時的濃度為最低檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）時的濃度為最低定量限。然后重復(fù)測定5次最低檢出限和最低定量限濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄峰面積和信噪比。

1.2.5 精密度 取5 μg/mL四種異黃酮的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性 取5 μg/mL四種異黃酮的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h按照上述色譜條件進(jìn)樣，測定其峰面積，并計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 加標(biāo)回收率 準(zhǔn)確稱取4份6.25 mg紅三葉草提取物，1份測定本底值，另外3份分別添加25、12.5 mL和7.5 mL濃度為50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每份樣品加鹽酸甲醇溶液（1 mol/L鹽酸）超聲溶解后定容至50 mL容量瓶，每個水平制備5個平行樣品，在上述色譜條件下測定四種異黃酮的含量，計算加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果

2.1 洗脫梯度的確定 本研究采用甲醇（A）和10 mmol的磷酸氫二鈉溶液（B）作為流動相在不同的梯度洗脫下進(jìn)行洗脫。結(jié)果表明，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在表1所述的洗脫梯度下分離效果良好，而且保留時間穩(wěn)定（圖1）。

2.2 檢測波長的選擇 通過對混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在210～400 nm波長進(jìn)行全掃描（圖2）發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆素A和染料木素在270 nm處具有最大吸收峰，281 nm和260 nm處 的吸收峰次 之，254 nm處的吸收峰最小，而大豆苷元和刺芒柄花素的響應(yīng)值則是254 nm＞260 nm＞270 nm＞281 nm。因此，選用270 nm作為檢測波長。

圖2 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的光譜圖和其在不同波長下的HPLC色譜圖

2.3 柱溫的選擇 由圖3可以看出，在上述色譜條件下，柱溫為40℃時保留時間最短，吸收峰最大，35℃時保留時間次之，吸收峰最小，而30℃時保留時間最短，吸收峰僅次于40℃。所以40℃為最佳柱溫。

圖3 大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在不同柱溫下的HPLC色譜圖

2.4 保留時間、最低檢出限與最低定量限 四種紅三葉草異黃酮保留時間、最低檢出限和最低定量限的實驗結(jié)果見表2。大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的保留時間為（7.09±0.01）、（7.97±0.01）、（12.12±0.02）min和 （13.60+0.02）min，色譜峰分離效果良好；最低檢出限分別為0.07、0.08、0.10 μg/mL和0.07 μg/mL；最低定量限分別為0.18、0.26、0.40 μg/mL和0.20 μg/mL。

表2 四種異黃酮的保留時間、最低檢出限和最低定量限

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 由表3可知，在濃度為1～50 μg/mL時，大豆苷元（Y=71654X-30703）、染料木素（Y=71340X+1728）、刺芒柄花素（Y=50078X+29669）和鷹嘴豆素A（Y=75607X+36375）均具有良好的線性關(guān)系，線性方程的R2均大于0.999。

表3 四種異黃酮的線性關(guān)系

2.6 精密度 由表4可知，結(jié)果顯示，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A峰面積的RSD分別為1.80%、1.98%、1.35%和1.72%，表明該方法的精密度良好，符合分析方法對精密度的要求（李正邦，2016）。

表4 精密度實驗結(jié)果

2.7 穩(wěn)定性 由表5可知，看出大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A在常溫下24 h時內(nèi)峰面積的RSD分別為1.14%、0.90%、1.16%和1.06%，均小于1.2%，表明紅三葉草提取中的這四種異黃酮在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好，符合分析標(biāo)準(zhǔn)的要求（李正邦，2016）。

表5 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.8 加標(biāo)回收率 由表6可以看出，大豆苷元、染料木素、刺芒柄花素和鷹嘴豆素A的平均加標(biāo)回 收 率 分 別 為96.24%、100.05%、99.51%和100.18%，RSD分 別 為0.66%、0.94%、0.96%和0.95%，表明該方法具有較高的加標(biāo)回收率，滿足加標(biāo)回收率為80%～120%，RSD＜10%的要求（李正邦，2016）。

表6 加標(biāo)回收率的實驗結(jié)果

3 討論

3.1 洗脫梯度的確定 異黃酮在梯度洗脫時的保留時間和分離效果與有機(jī)相的起始比例密切相關(guān)。有機(jī)相起始比例越小，保留時間越長，分離效果越好（劉文靜等，2017；張念等，2011；Krenn等，2002），因此確定甲醇的起始比例為20%。為了在縮短保留時間的同時提高分離效果，本試驗發(fā)現(xiàn)在0～5 min將甲醇的比例從20%提高到40%時大豆苷元和染料木素能夠完美分離，之后在5～20 min內(nèi)將甲醇比例從40%提高到75%時刺芒柄花素和鷹嘴豆素A也能完美分離。因此確定了上述洗脫梯度，保證四種異黃酮分離后在短時間內(nèi)洗脫掉其他干擾物質(zhì)，同時平衡色譜柱，為下一次進(jìn)樣做準(zhǔn)備。

3.2 柱溫的選擇 一般柱溫越高，保留時間越短，但是溫度過高會降低色譜柱的使用壽命，因此文獻(xiàn)中報道最多的柱溫是30、35、40℃（劉文靜等，2017；Gao等，2015；Urpi-Sarda等，2008）。本實驗結(jié)果表明，40℃時保留時間最短，吸收峰最大，35℃時的保留時間次之，30℃時保留時間最長，但是35℃時的吸收峰小于30℃的吸收峰。因此，實驗選擇40℃為最佳柱溫。

3.3 檢測波長的選擇 據(jù)報道，鷹嘴豆素A的最大吸收波長為260 nm（Delmonte等，2006），也有研究以254 nm和281 nm為檢測波長（李天雪等，2018；張念等，2011；Mustonen等，2006；Krenn等，2002）。在210～400 nm對鷹嘴豆素A等進(jìn)行全波長掃描時發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆素A的最大吸收波長為270 nm，且該波長下具有良好的精密度和線性關(guān)系，這與Montero等（2018）報道稱，270 nm處監(jiān)測時線性關(guān)系差有所不同。另外，光譜圖和色譜圖顯示染料木素和鷹嘴豆素A的最大吸收波長均為270 nm，在281 nm和260 nm處具有相同的吸收峰，在254 nm處的吸收峰最小；而大豆苷元和刺芒柄花素的最大吸收波長為255 nm，281 nm處的吸收峰最小，其次是270 nm和260 nm的吸收峰。

4 結(jié)論

本實驗建立了一種同時檢測鷹嘴豆素A、刺芒柄花素、染料木素和大豆苷元的HPLC檢測方法，并通過方法分析學(xué)從線性關(guān)系、檢出限、定量限、穩(wěn)定性、精密度和加標(biāo)回收率等方面對方法進(jìn)行了評價，結(jié)果都符合分析標(biāo)準(zhǔn)的要求，可用于同時檢測紅三葉草提取物中的四種異黃酮。