甘草查爾酮A抑制小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖機(jī)制研究

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甘草查爾酮A抑制小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖機(jī)制研究

王艷明1，劉瑛1，閻新燕1，司玲玲1，高彩霞2，于麗娜2，鄭秋生1，3
(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子832002;2.濱州醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，山東煙臺(tái)264003;3.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺(tái)264005)

中國圖書分類號(hào): R-332; R284.1; R329.24; R329.28; R739.5摘要:目的研究甘草查爾酮A抑制B16F10細(xì)胞增殖機(jī)制。方法SRB法檢測(cè)甘草查爾酮A對(duì)B16F10細(xì)胞增殖影響，Giemsa染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化，比色法檢測(cè)B16F10細(xì)胞內(nèi)、外黑色素含量，Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布，Q-PCR法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因B淋巴細(xì)胞-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin E2)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-2(CDK2)的mRNA表達(dá)。結(jié)果甘草查爾酮A能有效抑制B16F10細(xì)胞增殖，呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性;隨藥物濃度增加，細(xì)胞增殖速度降低，細(xì)胞形態(tài)由樹突狀變?yōu)楣炭s圓球狀，并伴有黑色素顆粒物出現(xiàn)，且細(xì)胞內(nèi)、外黑色素含量呈濃度依賴性增加趨勢(shì)，甘草查爾酮A能使細(xì)胞阻滯在G1期，在低濃度時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，高濃度時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;同時(shí)，甘草查爾酮A下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax比率，抑制周期相關(guān)蛋白Cyclin E2、CDK2的mRNA表達(dá)。結(jié)論甘草查爾酮A抑制B16F10細(xì)胞增殖機(jī)制可能是通過使B16F10細(xì)胞G1期阻滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡。

關(guān)鍵詞:B16F10;甘草查爾酮A;增殖抑制率;黑色素含量;細(xì)胞分化;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期阻滯

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.016.html

鄭秋生(1967－)，男，博士，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，E-mail: zqsyt@ sohu.com

惡性黑色素瘤(黑色素瘤)是臨床上較為常見的皮膚黏膜和色素膜惡性腫瘤，也是發(fā)病率最高的腫瘤之一［1］。目前，臨床治療黑色素瘤的主要方法是輻射和化療，但這些方法給病人帶來難以忍受的不良反應(yīng)，因此，尋找高效低毒的中藥改善黑色素瘤的治療是十分有意義的。

甘草查爾酮A是一種酚類查爾酮化合物，具有抗寄生物［2］、抗菌［3］、抗腫瘤［4］等作用。由于甘草查爾酮A大量分布于甘草根莖中，且甘草在自然界中分布廣泛，故其具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。本研究目的在于研究甘草查爾酮A對(duì)黑色素瘤B16F10細(xì)胞的增殖影響，為進(jìn)一步闡明甘草查爾酮A抗黑色素瘤機(jī)制研究提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1主要試劑與儀器

1.1.1藥品和試劑小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10購買于中國典型培養(yǎng)物保藏中心;甘草查爾酮A(成都普瑞法生物科技有限公司，純度為98%，批號(hào): 14022606); DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司，批號(hào): 1342967);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào):140130);磺基羅丹明B(SRB，Sigma，批號(hào):3520421);苯甲基磺酰氟(PMSF，Sigma，批號(hào): 101335685); RNA提取試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司，批號(hào): 13112605Y); cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo公司，批號(hào): 00170212);實(shí)時(shí)熒光定量SYBR Green擴(kuò)增試劑盒(凱杰公司，批號(hào): 148041276): Annexin V/FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、PI周期檢測(cè)試劑盒(杭州碧云天生物技術(shù)研究所); Giemsa干粉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)。

1.1.2主要儀器Thermo 3131型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Thermo 3001型多功能酶標(biāo)儀、PCR擴(kuò)增儀(美國Thermo公司); 5424R型Eppendorf離心機(jī)(德國Eppendorf);倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司); AR-2140型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)取生長狀態(tài)良好細(xì)胞B16F10，用含10%胎牛血清、鏈霉素(100 μg·L－1)、慶大霉素(100 μg·L－1)的DMEM培養(yǎng)液(pH = 7.5)，在37℃、5 % CO2飽合濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SRB法測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率取對(duì)數(shù)生長期B16F10細(xì)胞，計(jì)數(shù)后用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按每孔0.8×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，然后加不同濃度的甘草查爾酮A，使終濃度分別為0、15、30、45、60、75 μmol·L－1，繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48和72 h，培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入50%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(TCA)50 μL固定細(xì)胞，然后在4℃冰箱中放置1 h。培養(yǎng)板各孔用去離子水洗滌5遍，使TCA被去除。室溫條件下，晾干96孔板內(nèi)殘余液體，每孔加0. 4%的SRB 100 μL，在室溫下放置20 min，棄去各孔內(nèi)液體(回收)后用1%乙酸洗滌5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用DMSO(二甲基亞砜)150 μL溶解，在平板振蕩器上振蕩5 min，Thermo 3001多功能酶標(biāo)儀OD 515nm測(cè)量各孔的吸光值。并按下公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率:

1.2.3倒置顯微鏡下觀察取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化，離心后，按每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，用終濃度為0、15、30、45和60 μmol·L－1甘草查爾酮A處理B16F10細(xì)胞24 h后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Giemsa染色觀察取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化，離心后，按每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，用終濃度為0、15、30、45和60 μmol·L－1甘草查爾酮A處理B16F10細(xì)胞24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，每孔加固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)1 mL，固定30 min后，吸棄固定液，PBS洗2遍，每孔加Giemsa染色液1. 5 mL，染色15 min，吸棄染液，PBS洗2～3遍，吸棄PBS，晾干，鏡下觀察并拍照。

1.2.5比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外黑色素含量接種對(duì)數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞，(按每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板)，待細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，加入終濃度為0、15、30、45和60 μmol·L－1甘草查爾酮A后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS洗2次，用0. 25%的胰酶消化收集于離心管，8 400 r·min－1離心15 min，收集細(xì)胞上清液，取1 mL上清液加入1 mL 0. 4 mol·L－1HEPES buffer(pH 6. 8)和1 mL乙醚乙醇混合物(乙醚∶乙醇=1 ∶1)，8 400 r·min－1離心15 min，取下層水相鋪96孔板，每組6個(gè)平行孔，于405 nm測(cè)定細(xì)胞外吸光度(A);將細(xì)胞沉淀制成懸液，計(jì)數(shù)后加入1 mL含10% DMSO-NaOH，80℃煮1 h，12 000 r·min－1離心10 min，取上清液鋪96孔板，每組6個(gè)平行孔，于405 nm測(cè)定細(xì)胞內(nèi)吸光度(A)。

1.2.6檢測(cè)細(xì)胞凋亡率細(xì)胞經(jīng)藥物作用24 h后，離心(1 000 r·min－1，離心5 min)收集。用PBS洗滌細(xì)胞1次(1 000 r·min－1，離心5 min)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)。加入Binding buffer懸浮細(xì)胞液500 μL。輕緩操作，混勻細(xì)胞，加入Annexin VFITC 5 μL混勻，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)5 μL，混勻。室溫，避光，反應(yīng)10 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。激發(fā)波長Ex =488 nm;發(fā)射波長Em =530 nm。

1.2.7細(xì)胞周期的檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，收集細(xì)胞于離心管中，離心棄上清液，加預(yù)冷的70%乙醇3 mL，邊加邊振蕩，使細(xì)胞完全分散后置4℃冰箱過夜，然后離心棄去乙醇，加PBS洗2遍，最后加配好的PI染液(0. 05 g·L－1)，RNase A(0. 5 g·L－1)避光染色30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期所占的比例，激發(fā)波長Ex = 488 nm;發(fā)射波長Em =650 nm。

1.2.8 Q-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2及周期相關(guān)基因Cyclin E2、CDK2的mRNA表達(dá)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化，離心，計(jì)數(shù)，每培養(yǎng)瓶加入5× 105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加甘草查爾酮A，使其終濃度分別為0、15、30、45和60 μmol·L－1，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。根據(jù)試劑盒說明書操作，先提取總RNA，定量后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，上PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火和延伸30 s，不同引物選擇不同溫度退火，退火40 s，循環(huán)數(shù)為40－60次，最后得PCR產(chǎn)物并分析數(shù)據(jù)。PCR引物序列見下表(Tab 1)。

Tab 1　Sequences of Q-PCR primers

2　結(jié)果

2.1甘草查爾酮A明顯抑制B16F10細(xì)胞生長

甘草查爾酮A作用于B16F10細(xì)胞24、48和72 h后，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高，且呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性(Fig 1)，各時(shí)間點(diǎn)IC50分別為(45. 32± 1. 06)μmol·L－1、(35. 40±3. 2)μmol·L－1及(30. 3 ±1. 8)μmol·L－1。

Fig 1　Effect of Licochalcone A on proliferation rate of B16F10 cells(±s，n =3)＊＊P＜0. 01 vs control

2.2細(xì)胞形態(tài)變化甘草查爾酮A作用B16F10細(xì)胞24 h后，經(jīng)Giemsa染色，在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，呈不規(guī)則梭形，隨著藥物濃度的增加(15、30、45、60 μmol· L－1)，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，低濃度加藥組(15和30 μmol·L－1)細(xì)胞變長，呈現(xiàn)樹突網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，高濃度組(45和60 μmol·L－1)細(xì)胞體積逐漸縮小，呈現(xiàn)固縮的圓形結(jié)構(gòu)，且有黑色顆粒物出現(xiàn)(Fig 2)。

2.3甘草查爾酮A促進(jìn)B16F10細(xì)胞內(nèi)外黑色素含量增加如Fig 3、4所示，隨著藥物濃度的增加，甘草查爾酮A能明顯促進(jìn)B16F10細(xì)胞內(nèi)外黑色素含量增加，且呈濃度依賴性。與對(duì)照組相比，加藥組(45 μmol·L－1)B16F10細(xì)胞內(nèi)黑色素含量差異有顯著性(P＜0. 05);加藥組(15 μmol·L－1)B16F10細(xì)胞外黑色素含量差異有顯著性(P＜0. 05)。

2.4甘草查爾酮A誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡如Fig 5所示，甘草查爾酮A能誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)濃度依賴性。與對(duì)照組相比，加藥組(45和60 μmol·L－1)B16F10細(xì)胞凋亡率具有差異顯著性(P ＜0. 01)。

2.5甘草查爾酮A誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞周期阻滯在G1期如Fig 6所示，隨著甘草查爾酮A濃度增加，B16F10細(xì)胞G1期分布比率增加，S期分布比率下降，且呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.6甘草查爾酮A對(duì)B16F10細(xì)胞Bcl-2和Bax基因表達(dá)影響如Fig 7所示，甘草查爾酮A能明顯抑制Bcl-2基因的表達(dá)，促進(jìn)Bax基因的表達(dá)。與對(duì)照組相比，加藥組(15 μmol·L－1)B16F10細(xì)胞Bcl-2和Bax基因表達(dá)(P＜0. 05)差異有顯著性。

2.7甘草查爾酮A抑制B16F10細(xì)胞CyclinE2和CDK2基因表達(dá)如Fig 8所示，甘草查爾酮A能明顯抑制CyclinE2和CDK2基因的表達(dá)，具有濃度依賴性。與對(duì)照組相比，加藥組(15 μmol·L－1)B16F10細(xì)胞CyclinE2和CDK2基因表達(dá)(P＜0. 05)差異有顯著性。

Fig 2　Effect of Licochalcone A on morphological changes in B16F10 cells observed by Giemsa(upper)(×200)and under phase contrast microscope(lower)(×200)

Fig 3　Effect of Licochalcone A on intracellular melanin production of B16F10 cells(±s，n =3)*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control

Fig 4　Effect of Licochalcone A on extracellular melanin production of B16F10 cells(±s，n =3)*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control

3　討論

腫瘤細(xì)胞具有快速增殖、抵抗凋亡、無限復(fù)制等特征［5］。腫瘤細(xì)胞的這些特征，使臨床治療出現(xiàn)很多困難，給人類健康帶來巨大威脅，其中，黑色素瘤的發(fā)病危險(xiǎn)系數(shù)與總體死亡率依舊呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。近年來天然藥物以不良反應(yīng)少、毒性低、藥源豐富受到人們廣泛關(guān)注。甘草查爾酮A是一種黃酮類化合物，主要來源于甘草中。越來越多研究證明甘草查爾酮A對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用［6－9］，但對(duì)小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞增殖抑制機(jī)制的研究未見報(bào)道。

黑色素瘤細(xì)胞的典型分化特征是細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)樹枝狀，且細(xì)胞內(nèi)外黑色素含量明顯增加［10］。在本研究中，低濃度組(15和30 μmol·L－1)甘草查爾酮A能使細(xì)胞呈現(xiàn)典型的分化形態(tài)，細(xì)胞體積變大，呈現(xiàn)樹突網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);高濃度組(45和60 μmol·L－1)細(xì)胞體積固縮為圓球狀，并伴有黑色顆粒物出現(xiàn)，同時(shí)，甘草查爾酮A能促進(jìn)B16F10細(xì)胞內(nèi)外黑色素含量明顯增加。這些都表明甘草查爾酮A能誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞分化，使B16F10細(xì)胞趨向正常黑色素細(xì)胞，分泌大量黑色素。

Fig 5　Effect of Licochalcone A on apoptotic rates of B16F10 cells(±s，n =3)＊＊P＜0. 01 vs control

Fig 6　Effect of Licochalcone A on cell cycle distribution of B16F10 cells(±s，n =3)*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control

Fig 7　Effect of Licochalcone A on mRNA expression levels of Bcl-2 and Bax in B16F10 cells(±s，n =3)*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control

Fig 8　Effect of Licochalcone A on mRNA expression levels of CyclinE2 and CDK2 in B16F10 cells(±s，n =3)*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs control

為了進(jìn)一步明確甘草查爾酮A抑制B16F10細(xì)胞增殖機(jī)制，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布情況。本研究發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，低濃度組(15和30 μmol·L－1)細(xì)胞凋亡率僅為0% 和1. 36%;而高濃度組(45和60 μmol·L－1)細(xì)胞凋亡率為25. 8%和32. 66%，且差異具有顯著性。這些結(jié)果表明:低濃度甘草查爾酮A能誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞分化，而高濃度甘草查爾酮A可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，甘草查爾酮A還能使B16F10細(xì)胞周期分布率發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少的趨勢(shì)。

已有研究表明，Bcl-2和Bax都屬于凋亡基因Bcl-2家族蛋白，Bax/Bcl-2可以決定細(xì)胞對(duì)凋亡或生存信號(hào)的反應(yīng)［11－12］;而周期蛋白CyclinE2與CDK2可結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞向S期過渡［13］。本研究結(jié)果顯示:甘草查爾酮A能明顯下調(diào)Bcl-2/Bax比率，誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡;同時(shí)，甘草查爾酮A能減少Cyclin E2和CDK2的mRNA表達(dá)，抑制Cyclin E2與CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，這樣就促使細(xì)胞周期阻滯在G1期而無法進(jìn)入S期，迫使細(xì)胞周期發(fā)生紊亂。

上述結(jié)果表明:甘草查爾酮A能有效抑制B16F10細(xì)胞增殖，低濃度(15和30 μmol·L－1)能誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞分化，高濃度(45和60 μmol· L－1)能誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞凋亡，這兩種機(jī)制的發(fā)生可能是通過抑制Cyclin E2與CDK2的mRNA表達(dá)，促使細(xì)胞阻滯在G1期實(shí)現(xiàn)的。

(致謝:本研究在石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。感謝腫瘤實(shí)驗(yàn)室鄭秋生老師和同學(xué)在本課題的研究中給予我的關(guān)懷和支持，他們開創(chuàng)性的研究拓展了我的學(xué)術(shù)視野，創(chuàng)造了團(tuán)結(jié)而上進(jìn)的科研氛圍中，使我的科研工作取得進(jìn)展，謹(jǐn)此向我的導(dǎo)師鄭秋生博士和實(shí)驗(yàn)室全體同學(xué)致以衷心的感謝和崇高的敬意!)

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Inhibitory effects of Licochalcone A on proliferation of melanoma B16F10 cells

WANG Yan-ming1，LIU Ying1，YAN Xin-yan1，SI Ling-ling1，GAO Cai-xia2，YU Li-na2，ZHENG Qiu-sheng1，3
(1.Pharmacy School，Shihezi University，Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources of Ministry of Education，Shihezi Xinjiang 832002，China; 2.Binzhou Medical University，Yantai Shandong 264003，China; 3.College of Life Science，Yantai University，Yantai Shandong 264005，China)

Abstract:Aim To investigate the mechanism of the melanoma B16F10 cells proliferation induced by Licochalcone A in vitro.Methods The proliferation of B16F10 cells induced by Licochalcone A was determined by SRB method.The morphological changes were observed using Giemsa staining under the phase contrast microscope equipped with a digital camera.The melanin level was assessed by colorimetric method.The apoptotic rate was determined by Annexin VFITC/PI assay.Cell cycle distribution was determined by flow cytometry.The mRNA expression levels of B cell lymphoma/lewkmia-2(Bcl-2)，Bcl-2 associated X protein(Bax)，the cell cycle protein CyclinE2 and cyclin-dependent kinase-2(CDK2)CDK2 were detected using Q-PCR analysis.Results The proliferation of B16F10 cells treated with Licochalcone A was effectively inhibited in a concentration and time-dependent manner.A clear morphological change was observed with the increasing concentration of Licochalcone A in B16F10 cells，the dendrite-like projections changed to the narrowing ball shape，which was associated with the increasing melanin level.The low concentration of Licochalcone A could induce B16F10 differentiation，and the high concentration of Licochalcone A could induce B16F10 apoptosis，which was accompanied with the increasing G1phase in cell cycle.The mRNA expression levels of Bcl-2/Bax，CyclinE2 and CDK2 were markedly reduced.Conclusion Licochalcone A can effectively inhibit the proliferation of B16F10 cells，induced cell cycle arrest at G1phase，and further induced differentiation and apoptosis.

Key words:B16F10; Licochalcone A; the rate of proliferation; melanin level; differentiation; apoptosis; cell cycle arrest

作者簡(jiǎn)介:王艷明(1987－)，女，碩士，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，E-mail: 1040527954@ qq.com;

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 31471338，81260338);兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目，石河子科技計(jì)劃課題(No 2014QY16)

收稿日期:2015－03－09，修回日期:2015－04－28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015)07－0967－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.016