缺氧預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞差異表達(dá)microRNA的芯片篩選與生物信息學(xué)分析

何淑芳，朱海娟，程　潔，許士進(jìn)，楊　婉，張　野(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥　230601)

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缺氧預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞差異表達(dá)microRNA的芯片篩選與生物信息學(xué)分析

何淑芳，朱海娟，程潔，許士進(jìn)，楊婉，張野
(安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽合肥230601)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào): R-332; R322.11; R342.2; R394. 2; R845. 22

摘要:目的篩選缺氧預(yù)處理(hypoxia preconditioning，HPC)誘導(dǎo)成年大鼠心肌細(xì)胞差異表達(dá)的microRNA(miRNA)，并預(yù)測(cè)分析miRNA調(diào)控的靶基因與功能。方法體外分離培養(yǎng)成年大鼠心室肌細(xì)胞，分為對(duì)照組(CON)和缺氧預(yù)處理組(HPC)，CON組細(xì)胞正常培養(yǎng)，HPC組細(xì)胞經(jīng)歷10 min缺氧和30 min再給氧，提取心肌細(xì)胞總RNA，行miRNA芯片篩選，qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。利用軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因，分析靶基因富集的基因功能(gene ontology，GO)和信號(hào)通路(pathway)。結(jié)果與CON組相比，HPC可誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，共有12 個(gè)miRNA上調(diào)，14個(gè)miRNA下調(diào)(P＜0. 01，F(xiàn)DR＜0. 05);選擇其中熒光信號(hào)值＞500的7個(gè)miRNA，用于生物信息學(xué)分析。qRT-PCR檢測(cè)miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216水平，變化趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致。生物信息學(xué)分析顯示差異表達(dá)miRNA所調(diào)控的靶基因功能明顯富集于27個(gè)GO和6條信號(hào)通路。結(jié)論HPC可誘導(dǎo)成年大鼠心肌細(xì)胞miRNA表達(dá)譜明顯改變，這些差異表達(dá)miRNA可能通過(guò)調(diào)控靶基因參與HPC介導(dǎo)的心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:心肌細(xì)胞;成年大鼠;缺氧預(yù)處理; microRNA;芯片;生物信息學(xué)

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.011.html

張野(1968－)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向:麻醉藥理學(xué)，通訊作者，Tel: 0551-63869480，E-mail: zhangye_hassan@ sina.com

缺血性心臟病嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，在全球前10位死亡原因中居于首位［1］。心肌缺血導(dǎo)致急性心肌梗死后，盡早通過(guò)溶栓、冠狀動(dòng)脈介入或搭橋手術(shù)等方法恢復(fù)缺血心肌組織灌注是最有效的治療措施，然而再灌注本身會(huì)引起心肌缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)，不但降低再灌注的臨床療效，而且可能增加急性心肌梗死后的死亡率和心力衰竭發(fā)生率。如何預(yù)防或減輕心肌IRI，已成為目前心臟病學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

自1986年Murry等［2］提出缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)的概念以來(lái)，大量研究已經(jīng)證實(shí)了IPC的心肌保護(hù)作用，但其確切機(jī)制仍不清楚。microRNA(miRNA)是一類(lèi)由18～25個(gè)核苷酸組成的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與各種疾病病理生理過(guò)程。近年研究表明miRNA通過(guò)調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡或氧化應(yīng)激，在心肌缺血、再灌注、預(yù)處理等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用［3］。心肌細(xì)胞缺氧預(yù)處理(hypoxia preconditioning，HPC)可以模擬體內(nèi)IPC，有助于心肌細(xì)胞對(duì)抗之后更嚴(yán)重的缺氧性損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡［4］，是體外研究IPC作用與機(jī)制的重要手段。本研究利用miRNA芯片研究HPC對(duì)成年大鼠心肌細(xì)胞miRNA表達(dá)譜的影響并分析其靶基因功能，擬從miRNA水平初步探討IPC保護(hù)心肌IRI的作用機(jī)制。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)成年♂SD大鼠購(gòu)自江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證批號(hào): SCXK(蘇)2009-0002)。

1.2主要試劑及儀器M199培養(yǎng)基、TRIzol(Invitrogen)，DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基(Gibco)購(gòu)自L(fǎng)ife Technologies公司;新生牛血清(NBS)購(gòu)自杭州四季青公司; 2，3-Butanedione monoxine(BDM)、Insulin-transferring-selenium(ITS)、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司; All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit(AQMD-020)及miRNA引物購(gòu)于廣州復(fù)能基因公司; microRNA微陣列芯片由LC Sciences公司提供。主要儀器包括缺氧小室(加拿大Stem Cell公司); Langendorff離體心臟灌流裝置(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司); Agilent Bioanalyzer 2100，Mx3000PTMReal Time PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)Agilent公司)等。

2　方法

2.1分離培養(yǎng)正常大鼠心室肌細(xì)胞參照文獻(xiàn)［5］并加以改進(jìn)分離成年大鼠心室肌細(xì)胞。正常大鼠斷頭處死后取出心臟，主動(dòng)脈逆行插管，經(jīng)Langendorff灌流、Ⅱ型膠原酶消化、梯度復(fù)鈣、差速貼壁等步驟獲得鈣耐受的活細(xì)胞，桿狀細(xì)胞率＞80%。分離成功的細(xì)胞置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，在含ITS、BDM、BSA的M199培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2心肌細(xì)胞缺氧預(yù)處理原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞分為2組，每組4例(n =4):對(duì)照組(CON)、缺氧預(yù)處理組(HPC)。HPC組心肌細(xì)胞培養(yǎng)液更換為低糖(5 mmol·L－1)、無(wú)血清DMEM，置于缺氧小室中，并沖入95% N2+ 5% CO2以驅(qū)走O2造成缺氧環(huán)境，將密閉的缺氧小室放入培養(yǎng)箱，37℃下缺氧培養(yǎng)10 min，隨后更換含10% NBS的高糖(25 mmol ·L－1)DMEM培養(yǎng)液，5% CO2、95 %空氣、37℃培養(yǎng)30 min。對(duì)照組細(xì)胞在含10% NBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)。預(yù)處理后即刻收集心肌細(xì)胞，提取RNA用于miRNA芯片分析。

2.3 microRNA芯片檢測(cè)分析心肌細(xì)胞給予HPC后，立即收集心肌細(xì)胞，TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，采用Agilent Bioanalyzer 2100鑒定RNA的純度和質(zhì)量。利用YM-100微離心濾器將RNA樣品進(jìn)行大小分別，取5 μg小RNA(＜300nt)，用Poly(A)聚合酶在總RNA 3'端加上Poly(A)尾，并進(jìn)行熒光標(biāo)記。雜交反應(yīng)在uParaflo微流體芯片上過(guò)夜進(jìn)行。檢測(cè)探針均使用PGR(photogenerated reagent)化學(xué)法進(jìn)行原位合成。RNA與探針雜交后，與標(biāo)記特異結(jié)合的Cy3染料在微流體芯片上循環(huán)流動(dòng)進(jìn)行染色。利用激光掃描儀(GenePix 4000B，Molecular Device)采集雜交圖像，使用Array-Pro圖像分析軟件進(jìn)行圖像數(shù)字化轉(zhuǎn)換，并使用LOWESS過(guò)濾(Locally-Weighted Regression)進(jìn)行信號(hào)歸一化。使用genecluster2.0和Cluster3.0分析軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析(此部分實(shí)驗(yàn)由杭州LC Sciences生物技術(shù)有限公司完成)。

2.4熒光定量RT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果選取芯片中顯著差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。miR-133b-5p、miR-6216、miR-664-1-5p以及內(nèi)參U6的擴(kuò)增引物購(gòu)自廣州復(fù)能基因公司(序列保密)。按照Allin-OneTMmiRNA qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，PolyA加尾法逆轉(zhuǎn)錄RNA，PCR程序設(shè)定為:95℃10 min變性，95℃10 s、60℃20 s、72℃10 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增;熔解曲線(xiàn)程序采用Agilent儀器默認(rèn)程序。反應(yīng)結(jié)束儀器自動(dòng)生成CT值(threshold cycles，CT)及熔解曲線(xiàn)圖。熔解曲線(xiàn)呈單一銳利主峰說(shuō)明PCR產(chǎn)物單一，擴(kuò)增反應(yīng)特異性好。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)管，同時(shí)設(shè)無(wú)模板陰性對(duì)照(NTC)。2－△△CT法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于空白對(duì)照組的miRNA表達(dá)的差異倍數(shù)［6］。

2.5靶基因預(yù)測(cè)與功能顯著性分析采用miRNA生物信息學(xué)軟件TargetScan、miRanda對(duì)芯片檢測(cè)的差異表達(dá)miRNA(信號(hào)值＞500且P＜0. 01)進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，選擇兩種軟件交集的靶基因?；贕O(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用DAVID軟件根據(jù)靶基因的基因功能富集程度(enrichment P-value)，進(jìn)行GO顯著性分析;基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)用DAVID軟件根據(jù)靶基因在信號(hào)通路中的富集程度，進(jìn)行Pathway顯著性分析。計(jì)算P值，并根據(jù)P值排序計(jì)算FDR 值(false discovery rate)［7］。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10. 0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析采用Fisher精確檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3　結(jié)果

3.1 RNA純度及質(zhì)量鑒定各組RNA樣本的OD260/OD280比值均在1. 8～2. 0之間，RIN≥7. 0，28S/18S≥0. 7，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，5S rRNA條帶較弱，說(shuō)明RNA樣品完整性好，純度高，無(wú)明顯降解，可以用于后續(xù)芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)Fig 1。

3.2 miRNA表達(dá)譜差異及聚類(lèi)分析miRNA芯片結(jié)果顯示，與CON組相比，HPC組共有26個(gè)miRNA表達(dá)發(fā)生明顯變化(P＜0. 01，F(xiàn)DR＜0. 05)，其中12個(gè)miRNA上調(diào)，14個(gè)miRNA下調(diào)，明顯差異表達(dá)miRNA的聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)Fig 2。熒光信號(hào)值＞500的miRNA中，2個(gè)miRNA(miR-133b-5p，let-7d-5p)明顯上調(diào)，5個(gè)miRNA(miR-664-1－5p，－6216，－6215，30a－5p，30e－5p)明顯下調(diào)(P＜0. 01，F(xiàn)DR＜0.05)。見(jiàn)Tab 1。

3.3熒光定量RT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA為了驗(yàn)證miRNA芯片結(jié)果，選擇差異表達(dá)最為明顯的miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216進(jìn)行驗(yàn)證，利用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)CON與HPC組3種miRNA差異表達(dá)情況。結(jié)果表明HPC組miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致，但變化倍數(shù)不同。見(jiàn)Fig 3。

Fig 1　Qualification of total RNA by bioanalyzer The representative analysis results of total RNA in(A)Control group and(B)hypoxia preconditioning group

Tab 1　Differentially expressed miRNAs between CON and HPC groups(n =4，±s)

Tab 1　Differentially expressed miRNAs between CON and HPC groups(n =4，±s)

CON: cardiomyocytes was cultured in normal condition; HPC: cardiomyocytes were subjected to hypoxia for 10 min followed by 30 min reoxygenation.

Signal valueFold change MiRNAs CON　HPC(HPC/CON)　P value rno-miR-133b-5p 　10170±1013 　27852±1208 　2.740.0003 rno-let-7d-5p　3451±311 　4487±381 　1.30 　0.008 rno-miR-664-1-5p 　9563±976 　8200±1049 　0.24　?。?.0001 rno-miR-6216　1761±262　529±93 　0.30 　0.0002 rno-miR-6215　2446±96 　1715±120 　0.70 　0.0009 rno-miR-30a-5p 　12757±775 　10360±312 　0.81 　0.003 rno-miR-30e-5p 　12117±914 　9544±271 　0.79 　0.009

Fig 2　Hierarchical clustering analysis of differentially expressed miRNAs between CON and HPC groups(P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05，n =4)The colors display miRNA expression variance: red indicates a higher gene expression，green lower expression，and black the median value.

3.4差異表達(dá)miRNA靶基因顯著富集的GO與Pathway靶基因GO顯著性分析結(jié)果顯示，HPC誘導(dǎo)差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因功能主要富集于27個(gè)GO(P＜0. 01，F(xiàn)ig 4A)。其中16個(gè)GO涉及生物學(xué)過(guò)程，包括GTP酶活性的正性調(diào)控、磷脂酰肌醇去磷酸化、周期依賴(lài)蛋白激酶活性調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜融合等;5個(gè)GO涉及細(xì)胞組分，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物、胞核、膜組分、細(xì)胞內(nèi); 6 個(gè)GO涉及分子功能，包括泛素特異性蛋白酶活性、半胱氨酸肽酶活性、氨基酸連接酶活性、RNA聚合酶Ⅱ調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子活性等。Pathway顯著性分析顯示靶基因明顯富集于6條信號(hào)通路(P＜0. 05，F(xiàn)ig 4B)，分別為T(mén)oll樣受體信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Chagas疾病通路、醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收通路、RIG-I樣受體信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路。

Fig 3　Validation of miRNAs microarray data via qRT-PCR(±s，n =3)The relative expression value of miR-133b-5p，miR-664-1-5p and miR-6216 were normalized to U6 RNA level.*P＜0.05 vs CON group.

4　討論

miRNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性小分子非編碼RNA，其結(jié)合于mRNA的3’UTR區(qū)域，通過(guò)誘導(dǎo)mRNA的降解、翻譯抑制等形式，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。研究人員發(fā)現(xiàn)在心臟缺血/再灌注過(guò)程中很多miRNA發(fā)生改變，并推測(cè)在預(yù)處理過(guò)程中發(fā)生改變的miRNA可能對(duì)抗心肌缺血/再灌注損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用［8］。

Fig 4　GO and KEGG pathway analysis ondifferentially expressed miRNAsA: 27 GO terms enriched in hypoxia preconditioning; B: 6 KEGG pathways enriched in hypoxia preconditioning.The -lgP is the negative logarithm of the P-value.

我們前期研究發(fā)現(xiàn)缺氧10 min/復(fù)氧30 min的預(yù)處理可以減輕大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷，抑制心肌細(xì)胞凋亡［9］。本研究利用miRNA芯片技術(shù)，篩選HPC誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA，miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)一種新型高通量、廣譜的基因篩選方法，具有較高的特異性和敏感性。我們通過(guò)芯片篩選發(fā)現(xiàn)，HPC誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞中共26個(gè)miRNA發(fā)生明顯改變，選擇差異表達(dá)最為顯著的miR-133b-5p、miR-664-1-5p、miR-6216進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致，說(shuō)明芯片檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在這些明顯差異表達(dá)的miRNA中，miR-133b與miR-133a同屬于miR-133家族，兩者具有很高的同源性，已知miR-133a具有抗心肌細(xì)胞凋亡作用，在心肌IRI過(guò)程中表達(dá)下調(diào)但可被IPC上調(diào)［10］，然而miR-133b在心肌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制尚不明確。miR-30家族也在心血管疾病中發(fā)揮重要作用，最新研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌梗死誘導(dǎo)miR-30家族表達(dá)上調(diào)，抑制miR-30家族表達(dá)可以對(duì)抗心肌缺血后損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。而其他miRNA如miR-664-1-5p、let-7d-5p、miR-6216、miR-6215等在心肌缺血/再灌注過(guò)程中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。

miRNA芯片檢測(cè)結(jié)合生物信息學(xué)分析有助于更好地了解miRNA調(diào)控的靶基因功能與涉及的信號(hào)通路，可以提高芯片分析的研究效率和準(zhǔn)確性。我們同時(shí)利用Targetscan、miRanda兩個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA可能調(diào)控的靶基因，并選擇兩種軟件交集的靶基因，以避免單一軟件預(yù)測(cè)的假陽(yáng)性。通過(guò)對(duì)靶基因所富集的GO(基因功能)和Pathway(信號(hào)通路)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HPC誘導(dǎo)差異表達(dá)miRNA所調(diào)控的靶基因功能明顯富集于27個(gè)GO，主要涉及細(xì)胞周期調(diào)控、激酶活性、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞泛素化調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)節(jié)等。靶基因投射的6條信號(hào)通路中，已知Toll樣受體信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［11－12］; MAPK信號(hào)通路參與調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡［13－14］、TGF-β信號(hào)通路在心肌梗死后重塑和心肌纖維化中發(fā)揮重要作用［15］;而其他3條信號(hào)通路在心肌缺血/再灌注損傷中的作用尚不明確。

綜上所述，本研究利用miRNA表達(dá)譜芯片及生物信息學(xué)技術(shù)，篩選出HPC誘導(dǎo)心肌細(xì)胞明顯差異表達(dá)的miRNA，并對(duì)其調(diào)控的靶基因和信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，從miRNA角度初步探討了HPC發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用的可能機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究HPC的miRNA調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

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Screening and bioinformatics analysis of differentially expressed miRNAs induced by hypoxia preconditioning in rat cardiomyocytes

HE Shu-fang，ZHU Hai-juan，CHENG Jie，XU Shi-jing，YAN Wan，ZHAGN Ye
(Dept of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China)

Abstract:Aim To screen the differentially expressed microRNAs(miRNAs)induced by hypoxia preconditioning(HPC)in adult rat cardiomyocytes，and predict miRNAs-regulated target genes and their functions.Methods Cardiomyocytes were isolated from adult rat ventricular myocardium and cultured(in vitro).The cells were divided into 2 groups: control group(CON)and hypoxia preconditioning group(HPC).The cardiomyocytes in HPC group were subjected to 10 min hypoxia followed by 30 min reoxygenation，while the cells in CON group were cultured under normal condition.After that，total RNA was extracted and then subjected to miRNA microarray to screen differentially expressed miRNAs.The microarray results were further validated by quantitative RTPCR(qRT-PCR).Bioinformatics analysis was performed to predict the miRNAs-regulated target genes and analyze the enriched gene ontology(GO)and signaling pathway(Pathway).Results HPC caused significant changes in miRNAs expression in cardiomyocytes as compared to CON group.A total of 12 miRNAs were up-regulated and 14 miRNAs were down-regulated(P＜0. 01，F(xiàn)DR＜0.05).The differentially expressed 7 miRNAs with a fluorescent signal intensity ＞500 were selected for further bioinformatics analysis.The expression of miR-133b-5p，miR-664-1-5p and miR-6216 detected by qRT-PCR exhibited the similar patterns of up or down regulation to those shown in microarray results.Bioinformatics analysis revealed that miRNAs-regulated target genes were significantly enriched in 27 GOs and 6 signal pathways.Conclusion

The expression profile of miRNAs in rat cardiomyocytes is significantly affected by HPC.These differentially expressed miRNAs might participate in HPC-induced cardioprotection by regulating their target genes in rat cardiomyocytes.

Key words:cardiomyocytes; adult rat; hypoxia preconditioning; microRNA; microarray; bioinformatics

作者簡(jiǎn)介:何淑芳(1977－)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:麻醉藥理學(xué)，E-mail: hsf77 @163.com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金課題(No 81200171);安徽省科技廳年度重點(diǎn)項(xiàng)目(No 1301043030);高校省級(jí)自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(No KJ2014ZD16)

收稿日期:2015－03－15，修回日期:2015－04－30

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978(2015)07－0940－05

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.011