黃芩苷通過Wnt/β-catenin信號通路對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的促進作用

李晨睿，孟志遠，牛銀波，翟遠坤，潘亞磊，謝　麗，梅其炳(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實驗?zāi)M技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室，陜西西安　710072)

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黃芩苷通過Wnt/β-catenin信號通路對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的促進作用

李晨睿，孟志遠，牛銀波，翟遠坤，潘亞磊，謝麗，梅其炳
(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院空間生物實驗?zāi)M技術(shù)國防重點學(xué)科實驗室，陜西西安710072)

中國圖書分類號: R-332; R284.1; R329.24; R345.61; R394.2; R681; R977. 3

摘要:目的研究黃芩苷(baicalin)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(rat bone marrow derived mesenchymal stem cells，rBMSC)成骨分化過程中Wnt/β-catenin信號通路的影響。方法采用貼壁篩選法體外培養(yǎng)rBMSC，給予黃芩苷3、5、7 d后，比

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015－6－5 11:22網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150605.1122.007.html

梅其炳(1953－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:骨丟失發(fā)生機制及其藥物防護，通訊作者，Tel: 029-84779212，E-mail: qbmei@ nwpu.edu.cn較藥物處理組與對照組之間堿性磷酸酶(ALP)的活性。同時檢測給予黃芩苷對堿性磷酸酶陽性克隆和礦化結(jié)節(jié)形成的影響。提取總mRNA和總蛋白，用實時熒光定量PCR檢測黃芩苷對Wnt10a、GSK-3β、β-catenin以及LEF1 mRNA水平的影響。免疫印跡檢測藥物處理對β-catenin以及Runx2蛋白表達量的影響。結(jié)果黃芩苷明顯提高ALP的活性。10 μmol·L－1濃度的黃芩苷還可增加堿性磷酸酶克隆數(shù)和鈣化結(jié)節(jié)的形成。黃芩苷還可提高Wnt10a、β-catenin、GSK-3β、LEF1以及osteocalcin的mRNA水平，并提高β-catenin和Runx2的蛋白表達量。結(jié)論黃芩苷在0. 1～50 μmol·L－1的給藥濃度下可促進rBMSC的成骨分化成熟，Wnt/β-catenin信號可能參與調(diào)控rBMSC的成骨分化。

關(guān)鍵詞:黃芩苷;大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞;成骨分化; Wnt/βcatenin信號通路;堿性磷酸酶

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)來源于骨髓，是具有自我更新及多向分化功能的細胞［1］。BMSCs的成骨分化能力隨年齡增加而減弱，并在微重力環(huán)境下被抑制，這可能是導(dǎo)致骨質(zhì)流失的重要原因之一［2－4］。Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)控BMSCs成骨分化的重要信號通路［5］。近年來研究表明，多種植物藥或天然藥物單體能有效防治骨質(zhì)疏松，如續(xù)斷、蛇床子素等［6－8］。黃芩為唇形科植物，富含黃酮類化合物，黃芩苷是其中的主要活性組分(化學(xué)結(jié)構(gòu)見Fig 1)。在不同結(jié)構(gòu)的36個黃酮類化合物中，黃芩苷對原代成骨細胞堿性磷酸酶活性促進作用最為明顯，并且通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號促進成骨細胞分化［9］。然而，黃芩苷對rBMSC的成骨分化的作用及其分子機制還未見報道。本實驗以大鼠rBMSC為對象，研究黃芩苷對細胞增殖及成骨分化和成熟的影響，以及對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控。

Fig 1　Chemical structure of baicalin

1　材料與方法

1.1實驗材料體質(zhì)量220～250 g的Sprague-Dawley大鼠4只，購自中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心(動物合格證號: SCXK軍2007－007)。DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清、青－鏈霉素及0.25% Trypsin-EDTA購自Thermo Scientific Hyclone公司。黃芩苷(純度≥99%)、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、MTT試劑、固藍RR、茜素紅、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma-Aldrich公司。堿性磷酸酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。總RNA提取試劑盒(離心柱型)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量預(yù)混試劑均購自天根生化科技(北京)有限公司。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設(shè)計合成。β-catenin、Runx-2單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購自Abcam公司。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)大鼠頸椎脫臼處死，于75%酒精中浸泡10 min，在無菌條件下快速分離股骨及脛骨，切除兩端骨骺，用5 mL注射器抽取一定量DMEM/F12培養(yǎng)液沖洗骨髓腔至液體澄清。收集沖洗液，用微量移液器吹打后靜置5 min。取上清液，于1 000 r·min－1離心5 min，棄上清，用含10%體積分?jǐn)?shù)胎牛血清的DMEM/F12使細胞重懸，反復(fù)吹打后計數(shù)，以104個/cm2的密度接種于6孔板中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3d后首次換液，每日觀察細胞生長情況，待貼壁細胞達80%融合后用胰酶進行消化傳代培養(yǎng)(此為第一代P1)。待細胞傳代至P3時進行實驗，96孔板、24孔板、6孔板接種密度為2×103、2 ×105、4×105細胞/孔。

1.2.2 ALP活性測定細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24h后進行成骨性誘導(dǎo)(誘導(dǎo)培養(yǎng)液中抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松濃度分別為0. 284、10、2× 10－3mmol·L－1)。同時進行給藥處理，系列黃芩苷終濃度為0. 1、0. 5、1、5、10、50 μmol·L－1，每組設(shè)6個復(fù)孔。給藥組與對照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、5、7 d，每3 d換液1次。棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入緩沖液和基質(zhì)液各50 μL，混勻于37℃水浴15 min，加入150 μL顯影液，于520 nm波長下測吸光度(OD)。根據(jù)試劑盒說明配制酚標(biāo)液標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)酚標(biāo)液及樣本的吸光度值計算酶活性，結(jié)果以每孔15 min內(nèi)產(chǎn)生酚的摩爾量表示。

1.2.3堿性磷酸酶陽性克隆(CFU-FALP)分析細胞接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予10 μmol·L－1黃芩苷，對照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。7 d后采用偶氮偶合法進行ALP組織化學(xué)染色。PBS 洗2遍，10%甲醛溶液固定1 min，加入基質(zhì)液(含0.1%的α-萘基磷酸鈉和固藍RR鹽的Michaelis氏巴比妥鈉-HCl緩沖液，pH 8.9)中反應(yīng)30 min。出現(xiàn)褐色斑點時棄掉基質(zhì)液，PBS洗后固定，照相保存結(jié)果，用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描CFU-FALP的面積、數(shù)量和灰度，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.4礦化結(jié)節(jié)形成細胞接種于24孔板，培養(yǎng)24h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予10 μmol·L－1黃芩苷，對照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。d12棄培養(yǎng)液，PBS洗2次，10%甲醛固定5 min。加入茜素紅染色劑，37℃孵育1 h，觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。照相保存結(jié)果，用Image-Pro Plus 6.0軟件掃描礦化結(jié)節(jié)的面積、數(shù)量和灰度，進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.5 Real time-qPCR分析細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予10 μmol·L－1黃芩苷，對照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。8、24、48 h后，按試劑盒方法提取總RNA，用超微量紫外可見分光光度計檢測濃度和純度，調(diào)整RNA濃度至1 μg，取1 μL逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在體系中加入引物(見Tab 1)和SYBR Green試劑，于Bio-Rad CFX96型實時熒光定量PCR儀上，以兩步法對cDNA進行擴增。預(yù)變性階段，在95反應(yīng)10 min，一個循環(huán)。PCR反應(yīng)階段，分別為95反應(yīng)15 s、57反應(yīng)30 s、72反應(yīng)30 s，共40個循環(huán)。記錄CT(cycle threshold)值，通過ΔΔCT =(CT目的基因－CT內(nèi)參基因)處理組－(CT目的基因－CT內(nèi)參基因)對照組，計算各組2－ΔΔCT，即得該目的基因給藥組mRNA表達與對照組mRNA的倍數(shù)。

Tab 1　Specific primer sequences for Real-time qPCR

1.2.6 Western blot分析細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后成骨誘導(dǎo)，給藥組給予1、10、50 μmol· L－1濃度黃芩苷，對照組加入空白誘導(dǎo)培養(yǎng)基，給藥組與對照組培養(yǎng)液均含有1‰的DMSO。處理3 d后，每孔用300 μL細胞裂解液(含有PMSF 1 mmol ·L－1)提取總蛋白。用超微量紫外可見分光光度計檢測蛋白濃度，加入含有溴酚藍的上樣緩沖液，于95℃變性5 min，經(jīng)12 % SDS-PAGE電泳分離后，將待測蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5 %脫脂奶粉于室溫下?lián)u床封閉1 h，加入用TBST稀釋的β-catenin、Runx2、β-actin的一抗(稀釋比例為1∶1 000)，4℃過夜。次日用TBST將PVDF膜洗3次后，加入用TBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下?lián)u動2 h。洗膜3次后，將發(fā)光液涂抹于PVDF膜上，于暗室曝光。將膠片進行拍照，用IPP6.0軟件對條帶的灰度值進行測定，用相對定量進行分析。

2　結(jié)果

2.1不同濃度黃芩苷對堿性磷酸酶活性的影響如Fig 2所示，rBMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，ALP活性隨時間而增加，誘導(dǎo)7 d后ALP活性最高。不同濃度黃芩苷在5、7 d均能增加ALP活性(P＜0. 01)，并呈現(xiàn)出濃度依賴性，其中10 μmol·L－1黃芩苷對ALP活性增加最為明顯，而在50 μmol·L－1時ALP活性略有降低。

Fig 2　Effect of baicalin on ALP activityat various concentrations(n =6)*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs con

2.2黃芩苷對堿性磷酸酶活性陽性克隆形成的影響如Fig 3所示，rBMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)7 d后，對照組與給藥組均能形成堿性磷酸酶活性陽性克隆(CFU-FALP)。通過IPP 6.0軟件對進行CFU-FALP灰度掃描(Tab 2)，給予黃芩苷1、10、50 μmol·L－1后，CFU-FALP的面積、數(shù)量和相對灰度高于對照組，且兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0. 05或P＜0. 01)。

Tab 2　Intensity scanning of CFU-FALPformation 7 days after osteogenic induction(n =4)

2.3黃芩苷對鈣化結(jié)節(jié)形成的影響如Fig 4所示，rBMSC經(jīng)成骨誘導(dǎo)12 d后，對照組與黃芩苷組均形成鈣化結(jié)節(jié)。給予黃芩苷1、10、50 μmol·L－1后，鈣化結(jié)節(jié)形成數(shù)量多于對照組。經(jīng)IPP6.0軟件分析(Tab 3)，鈣化結(jié)節(jié)的面積、數(shù)量和相對灰度高于對照組，且兩組間差異有顯著性(P＜0. 01)。

Fig 3　Effect of baicalin at various concentrations on CFU-FALPformation 7 daysafter osteogenic induction.A: CON，B: baicalin at 1μmol·L－1; C: baicalin at 10μmol·L－1; D: baicalin at 50 μmol·L－1

Fig 4　Effect of baicalin at various concentrations on mineralized nodule formation 12 days after osteogenic inductionA: CON; B: baicalin at 1 μmol·L－1; C: baicalin at 10 μmol· L－1; D: baicalinat 50 μmol·L－1

2.4黃芩苷對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因表達的影響經(jīng)10μmol·L－1黃芩苷處理原代rBMSC 12、24、36 h后，Real time-qPCR檢測Wnt/β-catenin信號通路表達的變化，用相對定量法2－ΔΔCT分析檢測結(jié)果。如Tab4所示，給藥組在12、24、36 h均

Tab 3　Intensity scanning of mineralized nodule formation 12 days after osteogenic induction(±s，n =4)

Tab 3　Intensity scanning of mineralized nodule formation 12 days after osteogenic induction(±s，n =4)

AreaNumber Group/mm2·well－1/mineralized nodule·well－1Intensity CON　30.34±6.53 　702.78±49.50 　21955.34±2397.71 1 μmol·L－1　54.55±6.23＊＊　973.64±74.70＊＊　71181.98±5769.01＊＊10 μmol·L－1　68.14±4.93＊＊　1218.64±147.13＊＊　90613.62±6423.42＊＊50 μmol·L－1　64.03±5.41＊＊　1157.68±85.70＊＊　74511.73±5773.22＊＊*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs CON

Tab 4　Effect of baicalin at 10 μmol·L－1on mRNA expression of Wnt/β-catenin molecular 12，24，36 h after osteogenic differentiation(±s，n =3)

Tab 4　Effect of baicalin at 10 μmol·L－1on mRNA expression of Wnt/β-catenin molecular 12，24，36 h after osteogenic differentiation(±s，n =3)

Gene　12 h　24 h　36 h Wnt10a 　15.17±2.49＊＊　20.22±2.72＊＊　25.82±2.84＊＊GSK-3β 　2.68±0.32＊＊　4.61±0.24＊＊　9.65±0.04＊＊β-catenin 　4.50±0.07＊＊　4.15±0.30＊＊　5.14±0.16＊＊LEF1　3.47±0.03＊＊　3.43±0.87*　16.63±1.10＊＊＊Osteocalcin 　2.66±0.03＊＊　6.67±1.15＊＊　8.57±1.19＊＊*P＜0. 05;＊＊P＜0. 01 vs CON

可明顯提高Wnt10a、GSK-3β、β-catenin、LEF1和osteocalcin的基因表達量(P＜0. 05 or P＜0. 01)。其中黃芩苷在36 h對Wnt10a以及LEF1mRNA表達水平影響最為明顯，與同時間對照組相比，相對于管家基因GAPDH分別提高25. 82倍和16. 63倍。

2.5黃芩苷對β-catenin和Runx2蛋白表達量的影響經(jīng)1、10、50 μmol·L－1黃芩苷處理原代rBMSC 3 d后，采用Western blot檢測β-catenin和Runx2蛋白表達量。結(jié)果如Fig 5所示，黃芩苷僅在10 μmol·L－1濃度下能明顯提高Runx2的蛋白表達量，而黃芩苷在1、10、50 μmol·L－1的給藥濃度下均能提高β-catenin的蛋白表達量。

3　討論

近年來研究表明，植物藥在防治骨質(zhì)疏松方面具有巨大潛力。在傳統(tǒng)中藥方劑的基礎(chǔ)上開發(fā)和改良出多個抗骨質(zhì)疏松中成藥。Wang等［10］總結(jié)了12項抗骨質(zhì)疏松中成藥的隨機對照試驗并評價其有效性，受試者包括1 816名骨質(zhì)疏松患者。結(jié)果表明，受試中藥制劑都明顯增加了患者腰椎的骨密度。多種黃酮類化合物在細胞或動物水平顯示出明顯促成骨作用，如淫羊藿苷、染料木黃酮、白藜蘆醇、蛇床子素等［10－14］。與傳統(tǒng)治療骨質(zhì)疏松藥物相比，植物藥來源廣泛且毒副作用較低，因此具有較大的應(yīng)用開發(fā)價值。

Fig 5　Effect of baicalin at various concentrations on protein expression of β-catenin and Runx2 after osteogenic differentiation for 3 days*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs CON

BMSCs源于骨髓，具有自我更新及多向分化功能，在一定條件下能夠分化為成骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞、成軟骨細胞、神經(jīng)細胞等［1］。促進BMSCs的成骨分化，能夠增加骨形成及骨強度。近年來，應(yīng)用BMSCs對骨相關(guān)疾病進行細胞治療引起極大關(guān)注，BMSCs在骨組織工程中也表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力［15－17］。本實驗結(jié)果表明，黃芩苷能夠促進BMSCs的成骨分化成熟，明顯提高ALP活性、ALP陽性克隆形成、鈣化結(jié)節(jié)形成，并提高Runx2基因及蛋白表達，所測定指標(biāo)均與細胞成骨分化密切相關(guān)。

Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控BMSC成骨分化過程中發(fā)揮重要作用，但文獻報道有正、負調(diào)控兩種結(jié)果。轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt1、Wnt10a、Wnt10b及β-catenin 的ST2細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細胞ALP活性及鈣化能力明顯提高［5］。整體動物水平，F(xiàn)ABP4-Wnt10b轉(zhuǎn)基因小鼠的骨量為野生型小鼠的4倍［18］。GSK-3α/β抑制劑603281-31-8能促進C3H10T1/2細胞的骨向分化［19］。C3H10T1/2細胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3A腺病毒載體后，通過上調(diào)CNN1/Cyr61表達增加其骨向分化［20］。然而Wnt3a抑制人BMSC的ALP活性并抑制其礦化［21－22］。實驗結(jié)果的不一致可能與采用的細胞類型及Wnt信號分子的水平高低密切相關(guān)。除了誘導(dǎo)BMSC分化，Wnt/β-catenin信號的過度激活能誘導(dǎo)BMSC衰老［23］。并且利用轉(zhuǎn)基因小鼠，在骨細胞持續(xù)激活β-catenin表達能夠明顯增加松質(zhì)骨骨量，但減弱骨力學(xué)性能［24］。因此，Wnt/β-catenin信號強弱對調(diào)控結(jié)果的影響，以及Wnt/β-catenin信號在不同細胞譜系、細胞周期所起的作用值得深入研究。

據(jù)報道，黃芩苷促進成骨細胞分化并非通過雌激素信號通路發(fā)揮作用，而是通過激活Wnt/β-catenin信號［7］。我們發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠提高Wnt10a、GSK-3β、β-catenin和LEF1的基因表達，并在蛋白水平提高β-catenin的表達量，表明黃芩苷可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號而促進BMSCs的分化成熟。BMSCs的分化成熟是復(fù)雜的過程，在黃芩苷調(diào)控rBMSC成骨分化的過程中是否有其他Wnt/β-catenin信號分子或其他信號通路的參與還有待于進一步研究。

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Baicalin induces osteogenic differentiation of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells via Wnt/β-catenin signaling pathway

LI Chen-rui，MENG Zhi-yuan，NIU Yin-bo，ZHAI Yuan-kun，PAN Ya-lei，XIE Li，MEI Qi-bing
(Key Laboratory for Space Bioscience and Biotechnology，School of Life Sciences，Northwestern Polytechnical University，Xi’an 710072，China)

Abstract:Aim To investigate the role of Wnt/β-catenin signaling pathway on the baicalin-induced osteogenic differentiation in rat bone marrow derived mesenchymal stem cells(rBMSC).Methods rBMSC was isolated and cultured by adherence screening method.Alkaline phosphatase(ALP)amount，CFU-FALP and mineralized nodules were compared between each baicalin group and vehicle control group at different time points.Real time q-PCR was employed to evaluate the mRNA level of Wnt signaling-related marker(Wnt10a，GSK-3β，β-catenin and LEF1)after baicalin treatment.Protein expression of β-catenin and Runx2 was measured by Western blot.Results Baicalin significantly increased ALP activities from day 3 to day 7.The formation of CFU-FALP and mineralized nodules remarkably increased after rBMSC was treated with1，10，50 μmol·L－1baicalin.mRNA levels of Wnt10a，β-catenin，GSK-3β，LEF1and osteocalcin were enhanced significantly in baicalin-treated group compared to control group.Protein expression of βcatenin and Runx2 was also elevated.Conclusion Baicalin(0. 1 to 50 μmol·L－1)promotes the osteogenic differentiation and maturation of rBMSC，in which Wnt/β-catenin signaling pathway might be involved.

Key words:baicalin; rat bone marrow derived mesenchymal stem cells(rBMSC); osteogenic differentiation; Wnt/β-catenin signaling pathway; alkaline phosphatase

作者簡介:李晨睿(1982－)，女，博士，博士后，研究方向:骨丟失發(fā)生機制及其藥物防護，E-mail: chenruilee525@126.com;

基金項目:中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助(No 3102014JKY15009，3102014KYJD020)

收稿日期:2015－03－30，修回日期:2015－04－28

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015)07－0919－06

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.07.007