姜黃素下調(diào)miR-21表達(dá)緩解ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷

劉佳奇，劉綏軍

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心病，CHD）是指動(dòng)脈粥樣硬化引起的冠狀動(dòng)脈（冠脈）狹窄或梗阻，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死。冠心病是目前全球死亡的主要原因之一，我國(guó)約有1100萬冠心病患者[1,2]。探索冠心病發(fā)展的潛在分子機(jī)制將為其防治提供新思路。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)使用天然有效物質(zhì)可減少血管疾病的發(fā)生，姜黃素具有天然多酚活性，含有三種姜黃素類化合物（姜黃素、脫甲氧基姜黃素和雙脫甲氧基姜黃素），其中姜黃素為主要成分[3]。研究證據(jù)表明，姜黃素在心血管疾病、慢性炎癥、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等方面均具有治療價(jià)值[4]。姜黃素可通過影響UCP2信號(hào)傳導(dǎo)、或增加一氧化氮的生物利用度，減少氧化應(yīng)激，以改善中老年人血管內(nèi)皮功能，預(yù)防中風(fēng)[5,6]。MicroRNAs（miRNAs）是一組內(nèi)源性的非編碼小RNA，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸。人類miRNAs占所有基因的1%，但可調(diào)節(jié)約三分之一基因的表達(dá)、修飾、轉(zhuǎn)錄和翻譯[7]。更多的臨床研究聚焦于miRNAs的功能，微小RNA-21（MicroRNA-21，MiR-21）位于染色體17q23-2，在細(xì)胞活力、血管生成和抗凋亡、葡萄糖穩(wěn)態(tài)等多種生理和血管病變過程中相關(guān)[8-10]，并參與某些有效活性成分調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞分化等功能[11]。本研究采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探究姜黃素通過調(diào)控miR-21表達(dá)加強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲功能，發(fā)揮潛在心血管保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑人血管內(nèi)皮細(xì)胞系血管內(nèi)皮（VE）細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。姜黃素購自美國(guó)Sigma公司；ox-LDL購自MCE（MedChemExpress）公司；胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗混合液購自美國(guó)Sigma公司；TRIzol試劑購自美國(guó)Life Technologies公司；CCK-8試劑盒和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購自碧云天科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自大連寶生物有限公司；miR-21、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和GAPDH引物合成自蘇州金唯智生物科技有限公司；兔源GAPDH、PCNA和MMP-9一抗以及HRP標(biāo)記的二抗均購自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入10%FBS和100 U/ml雙抗，置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VE細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度約50%～60%，更換為無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期VE細(xì)胞并接種于96孔板，分別加入0、10、50、100、200、400、1000 μg/ml的ox-LDL；或0、5、10、50、100、200 μg/ml的姜黃素，CCK-8法檢測(cè)各濃度下細(xì)胞增殖活力，確定適宜的ox-LDL和姜黃素處理濃度。將VE細(xì)胞分為空白組（未處理）、模型組（100 μg/ml ox-LDL）和姜黃素組（100 μg/ml ox-LDL+50 μg/ml姜黃素）。其中模型組在VE細(xì)胞中加入100 μg/ml的ox-LDL誘導(dǎo)的CHD血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型[12]。姜黃素組在VE細(xì)胞中加入100 μg/ml的ox-LDL和50 μg/ml的姜黃素。

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖向每孔細(xì)胞加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h，加入DMSO溶液終止反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下細(xì)胞吸光度值（OD值），以空白孔測(cè)定值作為空白對(duì)照，分析各組細(xì)胞活力。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移將密度為5×105/ml的VE細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，直至形成單層細(xì)胞；用滅菌10 μl白色Tip槍頭在單層培養(yǎng)細(xì)胞上劃一條直線，Tip槍頭盡量垂直，顯微鏡下觀察并記錄，隨后用PBS洗去脫落的細(xì)胞。在顯微鏡下觀察并拍照。將細(xì)胞置于37℃、5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后用PBS洗去劃落的細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀察并拍照，分析細(xì)胞從致傷區(qū)遷移的相對(duì)距離。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲按照1:20的稀釋比例將基質(zhì)膠稀釋，取稀釋液100 μl，將稀釋液均勻涂于包被小室底部基底膜，放置在4℃環(huán)境中風(fēng)干。向每個(gè)Transwell小室加100 μl DMEM培基水化基底膜，37℃靜置1 h后用1%血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞至濃度為1×105/ml；往小室外加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)液900 μl，在每個(gè)小室內(nèi)接種細(xì)胞數(shù)約1×105，常規(guī)培養(yǎng)24 h；取出Transwell小室，PBS洗滌后用4%多聚甲醛固定 30 min；待小室底部的膜風(fēng)干，晶紫染液染色 20 min后，放PBS反復(fù)淋洗，經(jīng)光學(xué)顯微鏡100倍放大觀察、照相，每組隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。

1.6 熒光定量PCR（RT-qPCR）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)基因表達(dá)VE細(xì)胞處理48 h后，向每孔細(xì)胞中加入1 ml TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)的95℃ 5 s及 60℃ 30 s。目標(biāo)基因的表達(dá)使用GAPDH作為內(nèi)參，定量結(jié)果采用2-ΔΔCt表示。引物序列：miR-21-F：5'-C GCGCTAGCTTATCAGACTGA-3'，miR-21-R：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6-F：5'-GCTT CGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，U6-R：5'-C GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；PCNA-F：5'-GAAGATCTCGCTTCCTCCAATGTATGCT-3'，PCNA-R：5'-TCGACCATGGTGGCGGAGTGGCAA CAA-3'；MMP-9-F：5'-TCTATGGTCCTCGCCCT GAA-3'，MMP-9-R：5'-CATCGTCCACCGGACT CAAA-3'；GAPDH-F：5'-AGACACCATGGGGAA GGTGAA-3'，GAPDH-R：5'-ATTGCTGATGATC TTGAGGCTG-3’。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)VE細(xì)胞處理48 h后，向每孔細(xì)胞中加入150 μl蛋白裂解液RIPA提取總蛋白。將樣本與上樣緩沖液按照對(duì)應(yīng)比例混勻，沸水煮10 min使蛋白質(zhì)變性。樣品（每孔上樣30 μg）通過SDS-PAGE電泳凝膠混合液恒壓電泳, 采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜置于5% BSA，脫色搖床封閉2 h。TBST洗3次后4℃孵育一抗（1:1000）過夜。TBST洗PVDF膜3次，每次5 min，室溫孵育二抗（1:4000）1 h。TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min，避光環(huán)境中用ECL發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影，并在化學(xué)發(fā)光儀器中曝光拍照。最終結(jié)果表示為目標(biāo)條帶與內(nèi)參GAPDH的光密度比值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，兩組間樣本分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型建立CCK-8結(jié)果顯示，10、50、100、200、400、1000 μg/ml ox-LDL處理組細(xì)胞存活率分別為（85.979±3.142）%、（75.209±2.824）%、（58.916±3.138）%、（48.810±2.087）%、（41.531±4.530）%和（32.647±2.264）%，與空白組（0 μg/ml）相比，各組細(xì)胞存活率均明顯下降（P＜0.05）。其中使用100 μg/ml ox-LDL處理VE細(xì)胞的存活率約60%，故選擇此濃度構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。

2.2 姜黃素對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞增殖的影響CCK-8結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組VE細(xì)胞活力降低（P＜0.01），表明100 μg/ml ox-LDL處理顯著降低了VE細(xì)胞的增殖活力，證實(shí)模型構(gòu)建成功。與模型組相比，姜黃素組VE細(xì)胞活力明顯增加（P＜0.05），證明50 μg/ml姜黃素處理可明顯減輕ox-LDL誘導(dǎo)的VE細(xì)胞增殖抑制，表1。

表1 白藜蘆醇影響LPS誘導(dǎo)的VE細(xì)胞增殖

2.3 姜黃素對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞遷移的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞傷口愈合程度為（64.397±4.648）%、模型組為（33.063±3.532）%、姜黃素組為（61.773±2.451）%。模型組VE細(xì)胞傷口愈合程度顯著低于空白組（P＜0.01）；姜黃素組VE細(xì)胞傷口愈合程度顯著高于模型組（P＜0.01），表明50 μg/ml姜黃素處理明顯減輕ox-LDL誘導(dǎo)的VE細(xì)胞遷移抑制，圖1。

圖1 VE細(xì)胞遷移情況

2.4 姜黃素對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞侵襲的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組明顯減輕了ox-LDL誘導(dǎo)的VE細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量（404.333±10.105）個(gè)，模型組（256.667±11.865）個(gè)，姜黃素組（393.000±11.547）個(gè)。模型組VE細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯低于空白組（P＜0.01）；姜黃素組VE細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)量高于模型組（P＜0.01），表明50 μg/ml姜黃素處理明顯減輕ox-LDL誘導(dǎo)的VE細(xì)胞侵襲抑制，圖2。

圖2 VE細(xì)胞侵襲情況

2.5 姜黃素對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞相關(guān)因子表達(dá)的影響RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組VE細(xì)胞PCNA（P＜0.01）和MMP-9（P＜0.01）的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。與模型組相比，姜黃素組VE細(xì)胞PCNA和MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.01），圖3～4。

圖3 PCNA和MMP-9的mRNA相對(duì)表達(dá)量情況

2.6 姜黃素抑制ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞中miR-21的表達(dá)RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組VE細(xì)胞中miR-21的相對(duì)表達(dá)量為1.000±0.080，模型組中miR-21的相對(duì)表達(dá)量為8.020±0.483，姜黃素組中miR-21的相對(duì)表達(dá)量為2.241±0.205，姜黃素處理明顯抑制ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞中miR-21的表達(dá)（P＜0.01），圖5。

圖5 miR-21表達(dá)情況

3 討論

圖4 PCNA和MMP-9蛋白表達(dá)情況

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管壁的重要組成部分，血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和遷移是冠心病、高血壓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后再狹窄等疾病的重要病理生理過程。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度（10～1000 μg/ml）的ox-LDL處理VE細(xì)胞存活率均有不同程度下降，采用100 μg/ml的ox-LDL處理VE細(xì)胞，構(gòu)建CHD血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。姜黃素作為一種在我國(guó)已使用了幾個(gè)世紀(jì)的香料和食用色素，由多種分子靶點(diǎn)（包括轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)因子、受體、細(xì)胞因子、趨化因子和酶等）介導(dǎo)，發(fā)揮抗氧化性、抗炎、抗纖維化和抗腫瘤特性等治療活性[13-15]。研究顯示，姜黃素可能對(duì)一系列與衰老相關(guān)的疾病（如糖尿病、高血壓、神經(jīng)退行性疾病、骨質(zhì)疏松癥，以及心血管疾病和動(dòng)脈粥樣硬化等），具有協(xié)同療效[16,17]。關(guān)于姜黃素治療應(yīng)用的一個(gè)新興研究領(lǐng)域是改善血管功能障礙，與降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。為進(jìn)一步探究姜黃素在冠心病血管內(nèi)皮功能中的作用，我們?cè)趏x-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型中添加50 μg/ml的姜黃素進(jìn)行處理，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ox-LDL誘導(dǎo)模型組VE細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程均受到明顯抑制，而姜黃素處理明顯增強(qiáng)了VE細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明姜黃素能夠緩解由于ox-LDL引起的血管內(nèi)皮損傷。另外，ox-LDL誘導(dǎo)下調(diào)了VE細(xì)胞中PCNA和MMP-9表達(dá)，姜黃素在一定程度上增加了VE細(xì)胞中PCNA和MMP-9表達(dá)。PCNA是DNA復(fù)制的重要組成部分，是DNA聚合酶d和DNA聚合酶e的輔助蛋白，也是DNA重組和修復(fù)所必需[18]，是細(xì)胞增殖標(biāo)志物。MMP-9是金屬基質(zhì)蛋白酶，在細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要的作用。研究顯示姜黃素能夠抗動(dòng)脈粥樣硬化，這種特性與其維持內(nèi)皮細(xì)胞功能的有益作用有關(guān)。姜黃素可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，一定程度上防止血管內(nèi)皮功能障礙[19]。同樣，姜黃素改善內(nèi)皮功能，減少跨內(nèi)皮單核細(xì)胞遷移[20]。血管新生是對(duì)缺血的一種修復(fù)性反應(yīng)，血管生成是導(dǎo)致動(dòng)脈壁粥樣硬化斑塊形成的主要原因，可能導(dǎo)致心臟病發(fā)作和中風(fēng)。根據(jù)細(xì)胞類型不同，姜黃素具有抗血管生成或促進(jìn)血管生成的作用（如抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成[15]，增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管生成[17,19]等）。

miRNAs與多種心血管疾病的治療相關(guān)，包括冠心病。研究顯示miRNAs在調(diào)節(jié)冠心病發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要，包括影響心肌肥厚、心肌重構(gòu)和血管生成等。研究顯示miR-21在冠心病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC中的異常高表達(dá)[21]。另外，miR-21不僅能夠抑制冠心病中內(nèi)皮祖細(xì)胞EPCs的血管生成，還能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。總之，miR-21是心血管疾病的顯著調(diào)控因子，其SNPs rs1292037(T＞c)和rs13137(a＞T)與冠心病風(fēng)險(xiǎn)增高和預(yù)后不良相關(guān)。除SNPs外，miR-21的生物學(xué)功能可能被其他機(jī)制改變（如DNA甲基化等），因此miR-21在冠心病中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍需進(jìn)一步探索。本研究中，我們檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-21在ox-LDL誘導(dǎo)損傷VE細(xì)胞中異常高表達(dá)，而姜黃素處理顯著抑制miR-21表達(dá)，提示姜黃素可能抑制miR-21表達(dá)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移等過程來改善血管內(nèi)皮功能紊亂。

綜上所述，本研究表明姜黃素能夠促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞VE的增殖、遷移與侵襲，阻滯血管內(nèi)皮的惡性發(fā)展，其分子作用機(jī)制可能與抑制miR-21表達(dá)有關(guān)。本研究在細(xì)胞層面證實(shí)了姜黃素影響miR-21表達(dá)，緩解血管內(nèi)皮功能損傷，為其在血管內(nèi)皮治療的臨床推廣提供一定依據(jù)。