線粒體DNA與心肌梗死后的炎癥反應

孫偉，王倩怡，張璐莎，冷雨澤，李夢瑤，薛岳進，陳璐，王虹

近年來，線粒體DNA（mtDNA）作為一種免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)引起了人們的廣泛關(guān)注。在正常生理狀態(tài)下，線粒體DNA被包裹在線粒體的雙層膜結(jié)構(gòu)中。但在病理條件下，它會被釋放到細胞質(zhì)從而激活先天免疫信號通路，包括toll樣受體、炎性小體和環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激因子（STING）信號通路，這些信號通路參與觸發(fā)下游信號和刺激產(chǎn)生效應分子。炎癥免疫在心肌梗死后心肌的損傷與修復過程中發(fā)揮重要作用。本文將對心肌梗死后線粒體DNA引起炎癥免疫反應的機制和線粒體DNA內(nèi)化的機制進行探討。

1 引言

1.1 線粒體與線粒體DNA的結(jié)構(gòu)與功能線粒體的起源可追溯到大約15億年前，它被認為是真核細胞祖先中一種α原生細菌的一種內(nèi)共生[1]。線粒體逐漸進化成對細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)有著至關(guān)重要的生物學作用的細胞器，參與調(diào)節(jié)細胞鈣代謝和信號傳遞，控制產(chǎn)熱，產(chǎn)生大多數(shù)細胞活性氧，是細胞程序性死亡的守門人[2,3]。線粒體還具有重要的生物合成活性，參與生物大分子代謝。這個細菌起源的細胞器不僅被免疫系統(tǒng)所耐受，而且是細胞防御的中心調(diào)節(jié)器。但是，線粒體內(nèi)仍隱藏著一種先天免疫激動劑：它自身的基因組—線粒體DNA（mtDNA）。通常線粒體DNA的結(jié)構(gòu)被簡單描述為質(zhì)粒式結(jié)構(gòu)，但超分辨率成像顯示，它是由一個復制的mtDNA的和一些不同的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合組成的致密類核[4]，結(jié)構(gòu)與細菌祖先高度相似，包含大量未甲基化的DNA，如CpG島[5-7]。線粒體基因組編碼37個基因，除了2個核糖體RNA成分和22個tRNAs外，還有13個mRNA參與了呼吸鏈關(guān)鍵成分的編碼[8,9]。在線粒體中估計有1000多種蛋白質(zhì)，除mtDNA自己編碼的蛋白質(zhì)外，其余蛋白質(zhì)都是在細胞質(zhì)中被翻譯然后入線粒體[10]。

1.2 線粒體DNA與炎癥反應線粒體DNA通過誘導免疫信號通路或引起病理狀態(tài)，參與多種類型的先天免疫反應。有研究指出，在特定情況下線粒體釋放的mtDNA激活不同的先天免疫通路，可能包括toll樣受體、環(huán)磷酸鳥苷-腺苷酸合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激因子（STING）信號通路和炎性小體。線粒體通常是以連接網(wǎng)的形式存在，可在心肌和骨骼肌周圍被發(fā)現(xiàn)。線粒體網(wǎng)絡上碎裂的小球體發(fā)生有絲分裂，可能是線粒體DNA暴露到胞漿中的一種原因[11]。

2 心肌梗死后的炎癥反應

2.1 心肌梗死急性心肌梗死（AMI）以及隨之而來的心力衰竭是導致人們死亡和殘疾的主要原因之一。AMI后，減少急性心肌缺血/再灌注損傷（IRI）、保護心肌和限制心肌梗死面積最有效治療方法是及時使用直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PPCI）進行心肌再灌注。然而，心肌再灌注過程本身會造成心肌細胞死亡和心肌損傷，即“心肌再灌注損傷”，可占心肌梗死面積的50%[12]。因此，在AMI發(fā)生后需要減小心肌梗死面積，同時防止不利的左心室重構(gòu)，減少心力衰竭的發(fā)作并改善臨床結(jié)果[13]。急性缺血再灌注損傷后的炎癥反應在確定心肌梗死面積和不良心室重構(gòu)方面起著關(guān)鍵作用。

2.2 炎癥免疫應答參與心肌梗死后心肌的損傷與修復研究認為，心肌梗死后心臟的修復過程可分為3個階段：炎癥期、纖維增殖期及穩(wěn)定期[14]。在炎癥期，急性心肌缺血的發(fā)作會誘發(fā)最初的炎性反應，其目的是清除心肌梗死區(qū)的壞死細胞碎片。PPCI后繼發(fā)的心肌再灌注損傷，加重了這種促炎反應[15]。纖維增殖期及穩(wěn)定期是抗炎的修復階段，這一階段通過傷口愈合和瘢痕形成防止心臟破裂。炎癥反應和抗炎修復期之間的過渡是由心臟內(nèi)部的多種細胞組織（包括心肌細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和間質(zhì)）和免疫反應的組成部分（包括中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和淋巴細胞）共同完成的。兩個階段的平衡和過渡受到干擾會加劇IRI，并導致心肌梗死后左室的不良重構(gòu)。

2.3 心肌梗死后炎癥免疫應答的啟動心肌梗死后，在心肌梗死區(qū)壞死的細胞和基質(zhì)碎片產(chǎn)生的損傷相關(guān)模式分子（DAMPs），通過與模式識別受體（PRR）結(jié)合，激活固有免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生強烈而短暫的炎癥反應[16]。當DAMPs與PRRs結(jié)合后，啟動下游促炎信號通路，促使炎癥細胞向梗死心肌浸潤，并清除這些壞死細胞及細胞外基質(zhì)碎片。心肌梗死后活性氧（ROS）的產(chǎn)生也能通過激活 NF-κB 信號通路啟動細胞因子和趨化因子的合成，從而促進炎癥細胞趨化聚集[17]。

線粒體約占人類心臟的30%，線粒體DNA作為一種DAMP，能觸發(fā)免疫應答并引起有害的無菌性炎癥[18]。mtDNA可刺激許多PRR，包括TLR9、cGAS以及炎性小體等。Toll樣受體（TLRs）是一類常見的PRR。目前為止在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有13種TLRs，其中TLR2和TLR4是啟動心肌梗死后炎癥反應的重要調(diào)節(jié)因子[19,20]。研究發(fā)現(xiàn)，以TLRs為治療靶點可促進心肌梗死后心臟修復并有效減小心肌梗死面積[21]。

3 心肌梗死后線粒體DNA引起的炎癥反應

3.1 線粒體DNA作為免疫系統(tǒng)的刺激物因為線粒體可能源于細菌，被認為是“外來物”，mtDNA在細胞中會被視為不同于“自身”的DNA。線粒體DNA的異常甲基化情況為這種理論提供了依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，盡管線粒體中存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶[22,23]，但mtDNA與核DNA（nDNA）相比是低甲基化的[24,25]。mtDNA的異常甲基化模式，包括CpG基序上的5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）[26]，也有研究發(fā)現(xiàn)mtDNA中沒有CpG甲基化[27]。mtDNA擁有的類似于細菌DNA的未甲基化的CpG基序，可能是mtDNA與一些PRR結(jié)合的潛在原因。

還有研究認為，電子傳輸鏈是活性氧的主要來源，存在于線粒體基質(zhì)中的mtDNA與電子傳輸鏈非常接近。因此，它特別容易被氧化，導致mtDNA突變，可能是導致糖尿病[28]、癌癥[29]和衰老的發(fā)病機制。將mtDNA注射到小鼠的關(guān)節(jié)中會導致局部炎癥和關(guān)節(jié)炎[30]，進一步研究發(fā)現(xiàn)炎癥依賴于線粒體DNA中存在的氧化損傷堿基（ODN）。此外，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mtTFA，簡寫為TFAM）本身可能也具有免疫刺激作用[31]。

3.2 線粒體DNA與TLR9Toll樣受體是PRRs中最為常見的一類[32]。TLR1、TLR 2、TLR 5和TLR 6在細胞表面表達，TLR3、TLR 7、TLR 8和TLR 9在細胞內(nèi)的溶酶體中發(fā)現(xiàn)，其中TLR3、TLR 7和TLR 8識別RNA而TLR9識別DNA。TLR9會在心肌細胞中表達。

一項研究發(fā)現(xiàn)，通過TLR9抑制mtDNA的降解，可以誘導心力衰竭小鼠產(chǎn)生炎癥和心功能障礙，線粒體DNA還會導致心肌細胞死亡和線粒體功能受損。靶向破壞mtDNA可保護大鼠心臟免受體內(nèi)缺血-再灌注損傷[33]。在另一項研究中，TLR9基因缺失小鼠用陽離子納米載體和mtDNA引起肺壞死，小鼠存活率得到了改善[34]。進一步研究發(fā)現(xiàn)在骨髓分化因子88（MYD88）和TLR9缺失的肺壞死小鼠模型中，mtDNA造成的肺炎損傷明顯減少，表明潛在機制可能是TLR9-MYD88信號傳導通路。還有研究者給正常小鼠靜脈注射含有大量mtDNA的線粒體碎片，刺激小鼠全身產(chǎn)生了炎癥反應，而在缺失TLR9型小鼠中這種反應顯著降低[35]。此外，TLR9的表達水平似乎與胞質(zhì)mtDNA的水平有關(guān)，mtDNA釋放水平的增加誘導了TLR9的高表達[36]。

因為線粒體DNA與細菌DNA相似，可能含有高含量的未甲基化CpG，可誘導心肌炎癥，并可能通過激活TLR9而降低心肌細胞收縮力[37]。TLR9主要通過MYD88依賴通路產(chǎn)生信號，最終激活NF-κB并轉(zhuǎn)錄其下游基因。含有不同程度的未甲基化CpG可作為mtDNA與TLR9受體結(jié)合的配體：NF-κB通路（CpG B）或干擾素調(diào)節(jié)因子通路（CpG A），或同時激活兩種通路（CpG C）[38]。總之，心肌梗死后mtDNA與TLR9的相互作用不僅激活了先天免疫系統(tǒng)，而且增強了隨后的炎癥反應。

3.3 線粒體DNA作為干擾素信號的刺激物研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧復氧條件下mtDNA是通過NF-κB和干擾素信號調(diào)節(jié)因子途徑引起心肌梗死后的炎癥反應[39]，線粒體DNA也是干擾素信號的刺激物。

干擾素基因刺激因子（STING）是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的細胞質(zhì)DNA感受器蛋白。已有研究表明，由微生物病原體DNA引起的免疫反應與STING途徑有關(guān)，STING蛋白在激活之后，誘導干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）轉(zhuǎn)移到細胞核，刺激I型干擾素基因的轉(zhuǎn)錄，并激活NF-κB信號通路[40,41]。與微生物DNA相似的線粒體DNA是否通過STING途徑介導先天免疫引起關(guān)注[42,43]。

研究表明，線粒體DNA是激活STING途徑調(diào)節(jié)干擾素（IFN）響應的關(guān)鍵因素[44]。凋亡酶（caspases）的缺失是I型IFN基因轉(zhuǎn)錄增強的原因。這種生物學現(xiàn)象與Bak-Bax有關(guān)，Bak-Bax是屬于BCL2家族的促凋亡蛋白，與線粒體外膜的通透性有關(guān)，能促進膜間隙相關(guān)蛋白的釋放。此外，它們還參與了mtDNA的釋放和細胞色素C的釋放，從而激活了固有凋亡途徑。一般認為，細胞凋亡不會刺激炎癥反應。然而，當?shù)蛲雒副灰种茣r，mtDNA將繼續(xù)誘導cGAS-STING調(diào)節(jié)途徑的I型IFN信號[45-47]。

3.4 線粒體DNA作為炎性小體激活劑炎性小體是先天免疫系統(tǒng)的胞質(zhì)多蛋白聚體，參與炎癥反應的激活。目前的研究中，已有六種不同類型的炎性小體被報道：NLRP1、NLRP3、NLRP6、，NLRP12、AIM-2以及NLRC4-IPAF[48]。mtDNA與炎性小體直接結(jié)合，激活下游caspase-1和下游因子（如IL-18和IL-1β）成熟。

2011年首次報道了mtDNA作為炎性小體激活劑[48]。該研究發(fā)現(xiàn)，自噬蛋白的抑制提高了巨噬細胞內(nèi)胞質(zhì)mtDNA對脂多糖（LPS）或ATP的響應水平。該研究還發(fā)現(xiàn)mtDNA的釋放受到線粒體活性氧的介導，也與NLRP3的濃度有關(guān)，釋放的mtDNA對LPS和ATP應答從而使IL-18和IL-1β產(chǎn)生。此外，NLRP3除了作用于mtDNA釋放的下游，還作用于上游，以促進線粒體上MPTP的形成，從而允許mtDNA釋放。但MPTP是否能夠讓線粒體中的mtDNA釋放到細胞質(zhì)中仍存有疑問。

類似的研究證實，在巨噬細胞凋亡過程中，mtDNA被釋放并與NLRP3結(jié)合[49]。且NLRP3更傾向于氧化的mtDNA，表明活性氧在炎癥小體激活中起著關(guān)鍵作用[50]。線粒體DNA被ROS氧化并釋放到細胞質(zhì)中，然后它激活NLRP3并刺激IL-1β的分泌[51]。但是，許多不同信號都被認為是NLRP3激活的共同信號，故NLRP3作為mtDNA的直接靶標仍存有爭議[52]。

3.5 線粒體DNA內(nèi)化的機制mtDNA位于線粒體的雙膜結(jié)構(gòu)中，要與TLR9相互作用，須從線粒體中并釋放到細胞質(zhì)中，或者當mtDNA在細胞外時，通過某種機制而內(nèi)化[53]。因為mtDNA帶高負電荷，很難通過細胞膜上的帶電孔隙，跨膜擴散不是其內(nèi)化的方式。目前，細胞外線粒體的內(nèi)化機制尚不明確，吞噬、內(nèi)吞、受體介導的內(nèi)吞和跨膜擴散被認為是線粒體內(nèi)化的可能機制[54,55]。吞噬作用有一些證據(jù)支持，巨噬細胞可攜帶因細胞壞死而釋放出的完整線粒體[56]。一些研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA與其他輔助因子（如高遷移率類蛋白1和晚期糖基化終產(chǎn)物受體）的相互作用，促進了免疫細胞的內(nèi)化過程[57,58]。也有研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA與B細胞受體結(jié)合后刺激自身反應性B細胞，導致mtDNA內(nèi)化結(jié)合TLR9[59]。此外，細胞外的mtDNA是通過TLR9被心肌細胞內(nèi)化并激活NF-κB[60]。

近年來，研究者將目光投向了核仁素（NCL，C23），核仁素是真核細胞核仁中含量豐富的一種多功能蛋白[61]。它在翻譯后被修飾和調(diào)控，包含四個DNA結(jié)合位點和眾多的糖基化和磷酸化位點[62]。核仁素涉及核糖體成熟、RNA和DNA代謝，以及不均一核RNA（pre-RNA）從細胞核到細胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運[63]。一些研究發(fā)現(xiàn)，細胞表面的核蛋白與T淋巴細胞中人類免疫缺陷病毒的內(nèi)化[64]、DNA納米顆粒的攝取有關(guān)[65]。最新研究發(fā)現(xiàn)，核仁素在心肌細胞的細胞膜上高度表達。抑制核仁素可減少IL-1β、TNFα和IL-6在心肌細胞的表達，而mtDNA和心肌細胞膜上的核仁素結(jié)合，表明核仁素可能促進免疫原性DNA在心肌細胞中的攝取[18]。

3.6 線粒體DNA在細胞間轉(zhuǎn)移除mtDNA的細胞內(nèi)生物學效應外，釋放的線粒體DNA可能會從一個細胞移動到另一個細胞，從而將炎癥信號“傳遞”到另一類細胞中。現(xiàn)在已經(jīng)確定線粒體，包括線粒體DNA，是可以在細胞間轉(zhuǎn)移的。細胞間線粒體的轉(zhuǎn)移可能是一種進化保護的現(xiàn)象，與線粒體作用受損有關(guān)[66]。有研究報道，在大腦、心臟和肺上皮的缺血刺激性損傷后，細胞間線粒體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[67]。細胞融合、微囊和隧道膜納米管似乎是細胞間線粒體轉(zhuǎn)移的可能機制[68]。mtDNA的細胞間轉(zhuǎn)移及這一現(xiàn)象在心肌梗死后的炎癥免疫反應中的作用值得人們的關(guān)注。

4 總結(jié)和展望

線粒體是具有多種功能的細胞器，協(xié)調(diào)著細胞的生存和死亡，是細胞能量的來源地，是細胞防御的調(diào)節(jié)器，而且ATP、甲酰肽和線粒體DNA等會觸發(fā)先天免疫反應。近年來，研究者們對線粒體及線粒體DNA在炎癥和免疫中的作用有著濃厚的興趣，關(guān)于線粒體DNA引起炎癥反應與內(nèi)化、轉(zhuǎn)移等方面做了大量工作。

觸發(fā)先天免疫系統(tǒng)的內(nèi)源性分子被稱為損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）。缺血后心肌細胞釋放的DAMPs包括線粒體DNA。刺激先天免疫系統(tǒng)的受體，包括炎性小體（如NLRs）和類toll樣受體（TLRs）。目前研究表明，mtDNA擁有類似于細菌DNA的未甲基化的CpG基序，是線粒體DNA成為免疫系統(tǒng)刺激物的原因。心肌梗死后從線粒體中釋放的mtDNA激活不同的先天免疫通路，包括toll樣受體、干擾素信號調(diào)節(jié)因子通路和炎性小體。Toll樣受體是主要的通路，梗死后心肌細胞的缺氧再復氧與mtDNA一起協(xié)同識別TLR-9受體，誘導NF-κB響應，從而引起炎癥免疫反應。此外，干擾素信號因子通路和炎性小體也發(fā)揮了作用。

關(guān)于線粒體DNA如何從線粒體轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)中以及線粒體可能在細胞間的轉(zhuǎn)移，其機制尚不明確。研究認為，吞噬、內(nèi)吞、受體介導的內(nèi)吞均是線粒體內(nèi)化的可能機制，包括巨噬細胞攜帶因細胞壞死而釋放出的完整線粒體，線粒體DNA與其他輔助因子的相互作用以及核仁素促進免疫原性DNA在心肌細胞中的攝取等。線粒體DNA的內(nèi)化機制的研究將有助于對mtDNA引起炎癥反應的治療。線粒體DNA在細胞間的轉(zhuǎn)移，不同于以往局限于細胞內(nèi)的生物效應，而是一個內(nèi)環(huán)境的整體視角，正因它的復雜性，也吸引了眾多研究者的關(guān)注，為今后研究心肌梗死后先天免疫系統(tǒng)的反應提供更多的思路和啟迪。