外周循環(huán)線粒體DNA拷貝數(shù)與急性心肌梗死患者近期預(yù)后的相關(guān)性研究

魯召輝，宋紅星，馬龍飛，韓欣宇，郭赫立

急性心肌梗死患者在有效治療后，其缺血心肌組織可再次灌注血流。但血液灌注帶來的氧氣會(huì)激發(fā)過度的氧化應(yīng)激，對組織造成二次損傷[1]。因此，這一時(shí)期的患者病情并不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)致命性心律失常等多種不良心血管事件。如果治療不及時(shí)，可造成患者病情加重甚至死亡。因此，準(zhǔn)確預(yù)測急性心肌梗死患者近期不良心血管事件的發(fā)生，具有重要的臨床意義。但目前相關(guān)預(yù)測手段十分有限。

線粒體是真核細(xì)胞有氧呼吸和能量代謝的場所，擁有自己的遺傳物質(zhì)，即線粒體DNA（mtDNA）。既往研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死與線粒體關(guān)系密切[2,3]。在冠狀動(dòng)脈（冠脈）血供中斷時(shí)，心肌線粒體功能發(fā)生障礙，造成能量供應(yīng)不足。線粒體膜結(jié)構(gòu)不再完整，mtDNA等物質(zhì)被釋放出來，誘發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步加重心肌損傷[4,5]。同時(shí)，由于心臟在循環(huán)系統(tǒng)中的核心地位，釋放出來的心肌mtDNA可便捷地進(jìn)入外周循環(huán)。因此，理論上講，外周循環(huán)中的mtDNA濃度可能與心肌線粒體乃至心肌損傷的程度存在關(guān)聯(lián)，進(jìn)而使外周循環(huán)mtDNA成為一種潛在的急性心肌梗死預(yù)后指標(biāo)。少數(shù)學(xué)者針對這個(gè)假設(shè)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周循環(huán)mtDNA濃度升高與急性冠脈綜合征所致死亡存在關(guān)聯(lián)，而外周循環(huán)mtDNA呈陽性，結(jié)合其他線粒體指標(biāo)的異常，可預(yù)測急性心肌梗死的不良預(yù)后[6,7]。但是，定量的檢測急性心肌梗死患者外周循環(huán)的mtDNA拷貝數(shù)，研究后者對患者發(fā)病近期多種不良心血管事件發(fā)生的預(yù)測作用，國內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。

本研究采用急性ST段抬高型心肌梗死患者的血液樣本和臨床數(shù)據(jù)，探討外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)與多種不良心血管事件的相關(guān)性。研究結(jié)果有助于臨床醫(yī)務(wù)人員更加準(zhǔn)確地評估急性心肌梗死患者的近期預(yù)后，有助于他們更深刻地了解線粒體在疾病轉(zhuǎn)歸中的作用，為豐富急性心肌梗死的治療策略提供現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對象于2018年1月至2020年12月期間就診于鄭州市第七人民醫(yī)院心內(nèi)科的急診患者。全部受試者均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)頒布的《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南（2019）》，確診為急性ST段抬高型心肌梗死[8]。②患者均接受急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（PCI），并住院接受后續(xù)治療。③無其他慢性疾病，或其他慢性疾病病情處于穩(wěn)定期。④患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 病史采集研究人員查閱病歷，采集患者年齡、性別、吸煙史、既往疾病史和本次入院情況等研究數(shù)據(jù)。其中，吸煙史定義為患者在日常生活中存在自發(fā)的至少6個(gè)月的規(guī)律吸煙，故偶爾吸煙不在此列。既往疾病史根據(jù)病歷資料中所記錄的既往診斷過程和服用相關(guān)藥物情況確定。

1.3 血液采集與檢測于接受急診介入治療前采集患者靜脈血5 ml。樣本mtDNA拷貝數(shù)采用qPCR方法測定[9,10]。首先，應(yīng)用DNeasy全血與組織DNA提取試劑盒提取血液DNA（Qiagen）。然后，DNA樣本應(yīng)用Sybr Green染色qPCR檢測試劑盒和ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量測定（Applied Biosystems）。其中，人類NADH脫氫酶1基因（mtDNA）正向引物為5’-ATACCCATG GCCAACCTCCT-3’，反向引物為5’-GGGCCTT TGCGTAGTTGTAT-3’。人類肌動(dòng)蛋白（細(xì)胞核DNA，nDNA）正向引物為5’-TAAAGCGGCCTT GGAGTGTG-3’，反向引物為5’-GAACACGGC TAAGTGTGCTG-3’。qPCR反應(yīng)條件為20 μl，50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性10 min，95 ℃復(fù)性15 s，60 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。所有樣本檢測3遍。最后，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算mtDNA和nDNA的絕對量，mtDNA拷貝數(shù)由mtDNA/nDNA表示。

1.4 分組與隨訪根據(jù)外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)對患者進(jìn)行分組。其中，未檢測到mtDNA的患者分入“mtDNA陰性組”，在外周循環(huán)中檢測出mtDNA的患者根據(jù)檢測結(jié)果中位數(shù)分入“mtDNA高水平組”和“mtDNA低水平組”。

所有患者接受自發(fā)病之日起的30 d例行隨訪，住院患者通過查閱病歷完成，已出院的患者通過門診復(fù)診、電話詢問和查閱病歷相結(jié)合的方式完成。記錄不良心血管事件的發(fā)生，主要包括心力衰竭（Killip’s Ⅱ～Ⅳ）、房室傳導(dǎo)阻滯（二度Ⅱ型或三度）、室性心動(dòng)過速/心室顫動(dòng)和心源性死亡。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以算術(shù)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩個(gè)組之間的比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三個(gè)組之間的比較應(yīng)用方差分析及LSD檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。根據(jù)mtDNA水平的分組情況定義為自變量，不良心血管事件發(fā)生與否定義為表示狀態(tài)的因變量，不良事件從基線至發(fā)生的時(shí)長定義為表示時(shí)間的因變量，應(yīng)用多因素COX回歸評估m(xù)tDNA與不良心血管事件之間的相關(guān)性，報(bào)告風(fēng)險(xiǎn)比（HR）、95%可信區(qū)間（95%CI）以及相對應(yīng)的P值。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性心肌梗死患者的一般資料如表1所示，共253例急性心肌梗死患者納入本研究。其中，mtDNA高水平組113例，mtDNA低水平組113例，mtDNA陰性組27例。性別、年齡、吸煙史和既往史在三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。在入院情況方面，外周循環(huán)TnI濃度在mtDNA高水平組、mtDNA低水平組和mtDNA陰性組之間呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，且該指標(biāo)在mtDNA高水平組和mtDNA陰性組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.025）。心臟彩超LVEF值呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，在mtDNA高水平組和mtDNA陰性組之間也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.040）。而收縮壓、心率和前壁心梗例數(shù)在三組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 急性心肌梗死患者一般資料比較

2.2 外周循環(huán)mtDNA水平及其與TnI、LVEF的相關(guān)性外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)在mtDNA高水平組中顯著高于mtDNA低水平組（963.7±375.8 copies/ml，306.0±165.7 copies/ml，P＜0.001）（圖1A）。外周循環(huán)mtDNA水平與TnI水平無顯著的線性相關(guān)關(guān)系（r=0.098，P=0.141），與心臟彩超LVEF值呈現(xiàn)輕微顯著的線性相關(guān)關(guān)系（r=-0.131，P=0.049），（圖1B，圖1C）。

圖1 外周循環(huán)mtDNA水平及其與TnI、LVEF的相關(guān)性（注：*提示P＜0.05）

2.3 急性心肌梗死患者近期不良心血管事件發(fā)生情況在急性心肌梗死發(fā)病30 d內(nèi)，心力衰竭（Killip’sⅡ～Ⅳ）和房室傳導(dǎo)阻滯（二度Ⅱ型或三度）的發(fā)生在三個(gè)研究組中存在顯著差異。具體表現(xiàn)為，與mtDNA陰性組相比，上述兩種不良心血管事件在mtDNA高水平組中發(fā)生更加常見（P=0.011，P=0.040）。而室性心動(dòng)過速/心室顫動(dòng)和心源性死亡的發(fā)生在上述三個(gè)研究組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.160，P=0.616），表2。

表2 急性心肌梗死患者近期不良心血管事件發(fā)生情況

2.4 外周循環(huán)mtDNA陽性與近期不良心血管事件發(fā)生相關(guān)性的多因素COX回歸分析在本研究中，mtDNA高水平組和mtDNA低水平組的患者歸入mtDNA陽性組進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如表3所示，外周循環(huán)mtDNA檢測陽性組急性心肌梗死發(fā)病30 d內(nèi)出現(xiàn)心力衰竭（Killip’s Ⅱ～Ⅳ）、房室傳導(dǎo)阻滯（二度Ⅱ型或三度）、室性心動(dòng)過速/心室顫動(dòng)和心源性死亡發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與對照組相比無明顯差異（P＞0.05）。

表3 外周循環(huán)mtDNA陽性與近期不良心血管事件發(fā)生相關(guān)性的多因素COX回歸分析

2.5 外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)與近期不良心血管事件發(fā)生相關(guān)性的多因素COX回歸分析與擁有較低外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)的患者相比，外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)較高的患者發(fā)生心力衰竭（Killip’s Ⅱ～Ⅳ）、房室傳導(dǎo)阻滯（二度Ⅱ型或三度）和室性心動(dòng)過速/心室顫動(dòng)的可能性更大（P=0.007，P=0.031，P=0.013）。同時(shí)，本研究未發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)與心源性死亡之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（P=0.109），表4。

表4 外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)與近期不良心血管事件發(fā)生相關(guān)性發(fā)生的多因素COX回歸分析

3 討論

急性心肌梗死冠脈再通后的“缺血再灌注損傷”說明冠脈血供中斷所造成的心肌缺血性壞死只是疾病演進(jìn)的第一階段。此后，氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等一系列病理生理過程也會(huì)參與進(jìn)來。即使血供恢復(fù)，這些病理生理過程也不會(huì)立即中止，甚至?xí)M(jìn)一步加劇，并持續(xù)損傷心肌組織[11,12]。上述特點(diǎn)造成急性心肌梗死患者在發(fā)病早期病情十分不穩(wěn)定，易出現(xiàn)心力衰竭、致命性心律失常等危險(xiǎn)情況。因此，根據(jù)患者疾病危險(xiǎn)性采取個(gè)體化的治療措施是必要的。但如何準(zhǔn)確評價(jià)患者的疾病危險(xiǎn)性，預(yù)測不良心血管事件的發(fā)生，是臨床工作者面臨的難題。

既往研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死會(huì)導(dǎo)致心肌線粒體功能障礙，而氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等又與線粒體功能關(guān)系密切。因此，線粒體相關(guān)指標(biāo)的變化可能反映心肌損傷程度和多種繼發(fā)病理生理過程的嚴(yán)重程度。在此推測的基礎(chǔ)上，周雙艷等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死患者血漿游離mtDNA拷貝數(shù)顯著升高，后者可能成為輔助診斷心肌梗死的生物學(xué)標(biāo)志。胡漢等[14]研究進(jìn)一步證實(shí)，外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)對急性心肌梗死的診斷價(jià)值可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。兩項(xiàng)國外研究也初步揭示，外周循環(huán)mtDNA濃度可能與急性冠脈綜合征的不良預(yù)后有關(guān)[6,7]。但是，探討外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)在急性心肌梗死中的預(yù)后價(jià)值的研究仍然較少，而專門探討其對發(fā)病早期不良心血管事件的預(yù)測價(jià)值的研究未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，一小部分急性心肌梗死患者并未在外周循環(huán)中檢測到游離的mtDNA，這可能與患者心肌損傷較輕有關(guān)。還有另外一種可能的解釋，即血液采集時(shí)間距離發(fā)病時(shí)間過近。因?yàn)榧毙孕募」Ｋ篮缶€粒體損傷并出現(xiàn)mtDNA大量釋放入血需要一定時(shí)間，這與心肌酶在發(fā)病后數(shù)小時(shí)才能檢測到的情況類似。我們在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)考慮到了上述因素，安排所有患者在接受介入治療前采集血液，預(yù)留了比較充足的時(shí)間。因此，采血時(shí)機(jī)對于本研究的影響較小。

本研究還發(fā)現(xiàn)，多種不良心血管事件的發(fā)生在這些檢測陰性的患者和檢測陽性的患者之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在檢測陽性的患者中，mtDNA拷貝數(shù)較高的患者發(fā)生心力衰竭和惡性心律失常的危險(xiǎn)性明顯更高。說明外周循環(huán)mtDNA定量測定比定性測定具有更高的針對近期不良心血管事件的預(yù)測價(jià)值。

另外，不論在定性分析中，還是在定量分析中，本研究均未發(fā)現(xiàn)外周mtDNA拷貝數(shù)能夠預(yù)測心源性猝死。可能與樣本量較小，影響了檢驗(yàn)效能有關(guān)。樣本量偏小是本研究的主要不足之處。造成這種情況的原因?yàn)榫驮\的急性心肌梗死患者數(shù)量有限、納入標(biāo)準(zhǔn)較高（不符合要求的患者被直接排除）和部分患者不愿加入本研究。但是，本研究仍然在外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)預(yù)測心力衰竭、房室傳導(dǎo)阻滯和室性心律失常方面取得了陽性結(jié)果，為今后開展大樣本量的研究奠定了基礎(chǔ)。

外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)預(yù)測急性心肌梗死近期預(yù)后的機(jī)制尚不清楚。本研究的初步結(jié)果顯示，在外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)較高的患者中，外周循環(huán)TnI水平較高，而心臟彩超LVEF值較低。進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，mtDNA拷貝數(shù)與TnI水平、LVEF值幾乎或者已經(jīng)具有線性相關(guān)關(guān)系。眾所周知，外周循環(huán)TnI水平與心肌壞死程度有關(guān)，LVEF值與心臟收縮力有關(guān)，進(jìn)而與具有收縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)量有關(guān)[15,16]。另一方面，線粒體是供應(yīng)心肌細(xì)胞能量的細(xì)胞器，大量mtDNA進(jìn)入外周循環(huán)預(yù)示著心肌細(xì)胞壞死[17]。因此，外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)間接反映急性心肌梗死中心肌組織存活情況可能是其預(yù)測預(yù)后的機(jī)制之一。

綜上所述，外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)與急性心肌梗死近期多種不良心血管事件的發(fā)生相關(guān)，較高的外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)是急性心肌梗死近期預(yù)后不良的重要提示。因此，常規(guī)檢測外周循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)，了解患者的疾病發(fā)展危險(xiǎn)性，及時(shí)采用個(gè)性化的救治措施，可能有效提高急性心肌梗死的治療效果，改善患者預(yù)后。