TGF-β1 在腹膜纖維化中的相關研究進展

薛丹丹，張宜明通信作者，李相

（1.濟寧醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，山東 濟寧 272067；2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內二科，山東 濟寧 272067）

0 引言

腹膜透析是終末期腎病患者的一種替代療法，與血液透析相比，腹膜透析對晚期腎衰竭患者具有廣泛的治療優(yōu)勢，包括早期生存益處、居家治療的便利性和較低的醫(yī)療費用[1]。然而，長期的腹膜透析會導致腹膜功能和結構的改變，即腹膜纖維化，間皮細胞層的剝脫、皮下細胞層的增厚、血管病變被認為是腹膜纖維化的主要特征[2-3]。引起腹膜纖維化的因素有很多，例如：非生理腹膜透析液（高級糖基化終末產(chǎn)物AGEs、葡萄糖降解產(chǎn)物GDPs、高濃度葡萄糖、低PH 值、高滲透壓）、氧化應激、低氧、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）、腹膜炎癥等因素[4]。腹膜纖維化與血管生成和EMT 密切相關，并且這些過程相互影響，按照這些思路，腹膜纖維化可被視為最終破壞性變化的標志，這些改變可能在腹膜纖維化改變的同時或之前發(fā)生。

1 腹膜纖維化、EMT 與TGF-β1

腹膜纖維化被解釋為間皮細胞（MC）轉變?yōu)槌衫w維細胞的結果，即上皮間充質轉化（EMT）。在胚胎發(fā)育過程中，腹膜間皮細胞（MC）起源于原始的中胚層，在那里它們具有上皮細胞和間充質細胞的特性，腹膜間皮細胞的起源可能表明間皮細胞具有上皮表型和間充質表型轉化的潛能。在腹膜的“活動區(qū)”，已經(jīng)鑒定出一組具有立方體形態(tài)的柱狀MC[5]。與鱗狀MC 相比，這些細胞處于更活躍的代謝狀態(tài)，這些活躍的MC 似乎傾向于獲得間質表型，并在器官損傷和纖維化形成過程中轉化為成纖維細胞[6,7]。然而，在健康或疾病的條件下，MC 如何在不同的刺激下完成上皮和間質表型轉換仍然是未知的。

EMT 是一個生物學過程，它允許上皮細胞經(jīng)歷多種生物學變化，最終成為間充質細胞表型。其中包括增強的遷移能力、侵襲力，增強的抗凋亡能力，干細胞特性，免疫抑制及增加細胞外基質的產(chǎn)生[8]。這兩種細胞表型之間的轉換受到關鍵轉錄因子的精細調控，其中TGF-β1 家族起主導作用[9-11]。

TGF-β1 是一種多功能細胞因子，參與多種創(chuàng)傷愈合過程：成纖維細胞激活、膠原沉積、纖溶酶原激活物抑制劑-1 抑制纖溶作用、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1 的膠原酶溶解與血管生成。TGF-β1 的激活是一個重要的早期事件，它通過葡萄糖、葡萄糖降解產(chǎn)物和高級糖基化終末產(chǎn)物在生物不相容的腹膜透析液中介導纖維化形成[12]。TGF-β1 可以通過smad 依賴和非smad 依賴途徑發(fā)揮作用，但大多數(shù)促纖維化作用通過smad 依賴信號通路發(fā)生轉導[13-15]。在內皮細胞中，Smad2/3信號通路抑制細胞的增殖和遷移。相反，Smad1、Smad5 和Smad8 信號促進了這些細胞過程[16-18]。

Ⅰ型激活素受體樣激酶5(ALK5)是上皮細胞表達的主要ALK，通常被稱為T-βRI[19]。TGF-β/激活素通路通常通過Smad2、Smad3 發(fā)出信號，在被激活之前，smad 錨將Smads 錨定在細胞膜上以激活受體，從而使Smads 接近TGF 受體激酶[20]。TGF-β1 首先與T 細胞受體-Ⅱ(TβR-Ⅱ)結合，然后被T 細胞受體-Ⅰ(TβR-I)募集。這兩種受體形成TβR 異構體復合物，其中TβR-Ⅱ磷酸化并 激 活TβR- Ⅰ[21,22]?；?性TβR- Ⅰ然 后 磷 酸 化Smad2/3(R-Smads)。這導致p-Smad2/3 滯留在細胞質中，并與Smad4(co-SMAD)結合。由此產(chǎn)生的異寡聚復合物被移位到細胞核中，并激活Smad 依賴的轉錄活性[23,24]。

研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露于高糖腹膜透析液會誘導顯著的腹膜損傷，而腹膜中Smad2 基因缺失加劇了腹膜纖維化和功能障礙。Smad3 在腹膜纖維化過程中起關鍵作用，smad2 則起保護作用[25-27]。

Smad6 和Smad7 是 抑 制 性Smad，對TGF-β1家族信號活性提供負反饋控制。Smad6 優(yōu)先阻斷BMP 信號。Smad7 首先競爭與TβR-I 結合，抑制Smad2 或Smad3 的磷酸化[28]，其次可通過誘導受體降解降低了TβR-I 的穩(wěn)定性和活性，同時Smad7與Smad4 競爭與R-SMADs 結合，進行多泛素化和蛋白體降解，Smad7 還阻斷了異源寡聚Smad 復合物與其核靶的相互作用。在慢性纖維化條件下(包括EPS) 中Smad7 的表達存在缺陷，從而促進了TGF-β1 誘導的E-鈣粘蛋白的抑制和波形蛋白的上調，從而促進了EMT[29]。

2 血管形成與TGF-β1

腹膜毛細血管嵌入內皮下松散的脂肪層，腹膜新生血管和高血管通透性導致小的溶質轉運增加，并伴隨著葡萄糖驅動的滲透壓的迅速降低，這是導致超濾衰竭的原因之一。膜功能衰竭患者的腹膜可見高血管密度和血管內皮下玻璃化。

VEGF-A 是血管生成和血管通透性改變的中央調節(jié)因子[30]。葡萄糖降解產(chǎn)物誘導腹膜間皮細胞產(chǎn)生VEGF-A，高級糖基化終末產(chǎn)物通過誘導微血管內皮中的自分泌信號VEGF-A 誘導血管生成。發(fā)生EMT 的腹膜間皮細胞比正常的上皮分化間皮細胞產(chǎn)生更多的VEGF-A[31]。

在利用人體組織進行的研究中，已經(jīng)證實腹膜轉運速率與PD 流出物中VEGF-A 或TGF-β1 濃度存在相關性。重要的是，PD 流出物中的VEGF-A 濃度與TGF-β1 濃度相關[32,33]。Tetsuyoshi Kariya 等通過在洗必泰誘導的大鼠腹膜損傷(CG)模型中，用TGF-β1 受體抑制劑腹腔注射，以探討VEGF-A 與體內新生血管形成的調控機制。在CG 模型中應用TGF-β1 受體抑制劑可降低腹膜厚度、血管數(shù)和VEGF-A 水平。TGF-β1 增加人間皮細胞系和成纖維細胞系中VEGF-A 的產(chǎn)生，以及TGF-β1 誘導的VEGF-A 可以被TGF-β I型受體（TGFβR-I）抑制劑抑制。這些結果表明，在間皮細胞和成纖維細胞中，新生血管生成通過TGF-β-VEGF-A 途徑與纖維化有關[34-36]。

TGF-β 已被證明可在多重器官纖維化及癌癥中誘導VEGF 的表達[37-40]。TGF-β 可以與Ⅰ型激活素受體樣激酶1(ALK-1)結合，激活下游涉及細胞內和核蛋白的信號(Smads 和ID1)，并導致促血管生成反應[41]。此外，TGF-β1 和缺氧是細胞表達血管內皮生長因子的有效誘導劑。研究表明，TGF-β 顯著上調血管內皮生長因子/血管內皮生長因子受體的表達，對血管內皮細胞的形成和遷移有很強的作用，從而促進細胞的血管生成[42]。TGF-β 通過促進結締組織生長因子和血管生成調節(jié)酶如基質金屬蛋白酶(MMP2、MMP9、MMP10 等)介導新生血管的形成[43]。轉分化的MC是PD患者VEGF的重要來源，MC 上調VEGF 的潛在機制是這些細胞的間質轉化。研究表明，來自成纖維細胞樣表型的MC 體外產(chǎn)生的VEGF 遠遠多于上皮表型的MC[44,45]。

3 針對TGF-β1 靶點的抑制改善腹膜纖維化

MicroRNA(MiRNA) 是通過促進mRNA 降解或抑制蛋白翻譯來調節(jié)靶基因表達的ncRNA 之一[46-48]。越來越多的證據(jù)表明，依賴于TGF-β/Smads 的miRNAs 也可以調節(jié)腹膜纖維化，如miR-30a，miR-29 家 族，miR-589,miR-200a。MiR-29 家族成員是TGF-β1 介導的器官纖維化相關的最具特征性的miRNAs，據(jù)預測，它以一系列細胞外基質基因為靶點，如ELN、FBN1、COL1A1、COL1A2 和COL3A1[49]。在腹膜透析動物模型中，miR29、miR-30a、miR-200a、miR-589 等 在 進 行性纖維化和腹膜功能受損的腹膜組織中表達顯著下調[50-53]，MiR-21 和miR-34 在長期持續(xù)非臥床腹膜透析患者流出液中的表達增加[54-57]，靶向上述miRNA 可對腹膜纖維化起保護和預防作用。

最近實驗證明，在小鼠腹膜纖維化模型中，高糖腹膜透析液可引起腹膜糖酵解途徑加劇，在人類MET-5A 中證實糖酵解途徑中關鍵酶的表達可被TGF-β1 上調。在這些代謝變化之后，TGF-β1 處理的細胞中纖維蛋白的表達上調，E-cadherin 的表達顯著下調，提示TGF-β1 可誘導這些細胞發(fā)生內皮細胞轉化。TargetScan 收集了差異表達miRNAs的預測靶基因,將miR-21a、miR26a 和miR-200a作為潛在的治療靶點，將這三個miRNA 組合成miRNA 三聯(lián)體，其顯著抑制了TGF-β1 刺激的細胞能量代謝（ECAR）的誘導。TGF-β1 誘導的糖酵解和糖酵解能力都被三聯(lián)體大大削弱。伴隨著這些糖酵解代謝的改變，即使在TGF-β1 的刺激下，纖維化蛋白(FN1、COL1A1 和α-SMA)的表達也被miRNA 三聯(lián)體降低。miRNA 三聯(lián)體的抗纖維化作用大于任何單獨的miRNA 模擬物或抑制劑[58]。

最近的研究表明，細胞質中的CircRNAs 具有許多miRNAs 結合位點，這些結合位點與miRNAs呈負相關，并通過充當miRNAs 的ceRNAs 而抑制miRNAs 的活性。CircRNA 被證明參與多種器官纖維化，在EMT 過程中，CircRNAs 可以作為miRNA抑制劑，減弱miRNA 對EMT 相關基因的抑制作用。結果，上皮細胞失去了它們的特性，如細胞間的粘附和細胞極性。取而代之的是，當細胞獲得運動性、遷移性和侵襲性時，它們會成為間充質干細胞。雖然我們沒有檢索到任何研究，但CircRNAs 也可能通過EMT 參與PF[59,60]。

TGF-β1 是介導腹膜損傷、腹膜纖維化的關鍵分子，但已有的證據(jù)顯示在小鼠模型中，PD 液中加入兩種TGF-β1 抑制肽可以保護腹膜免受損傷[61,62]。然而，該辦法在臨床實踐中應用非常困難，因為TGF-β1 有著非常重要的在生理功能，可以調節(jié)免疫和炎癥反應，如果阻斷了TGF-β1 的作用，可能帶來不可預知的不良反應[63]。

4 終結

腹膜透析領域在過去幾年里在提高腹膜透析質量和患者安全性方面取得了重大飛躍，包括開發(fā)分離系統(tǒng)和雙腔袋，認識到腹膜炎發(fā)作和GDPs 對腹膜的有害影響。自從實施了pH 中性、GDPs 含量低的更具生物相容性的解決方案以來，腹膜纖維化發(fā)生比率減低[64,65]。

我們仍需要通過更多的努力來更好地闡明腹膜間皮細胞對纖維化信號的分子反應。在TGF 和TLR/IL-1 引發(fā)的級聯(lián)反應中，抑制主要的細胞外介質以及特定的參與者可能是同時影響多個靶基因的治療方法。此外，對特定miRNA 水平的可能控制，例如，通過簡單的無性系方法，可以為更有針對性的治療保證基因表達的特異性調節(jié)。

此外，利用特定細胞類型的信息(如條件性基因敲除實驗)和單細胞水平的信息(如轉錄研究)，將進一步增強我們對纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中細胞串擾的了解。未來的研究將進一步解決腹膜纖維化計劃本身與其他促成過程之間的復雜相互作用，這將有必要提高開發(fā)延長腹膜存活的新治療方案的潛力，并將其轉化為腹膜透析患者的臨床益處。