尿毒癥晚期糖基化終產(chǎn)物和蛋白結合溶質(zhì)通過抑制Krüppel-樣因子2誘導腹膜間皮細胞功能障礙的機制研究

福建省南安市醫(yī)院（362300）黃德勝 莊宇亮

常規(guī)血液透析無法將蛋白質(zhì)結合尿毒癥毒素排出體外，導致患者受到蛋白質(zhì)結合尿毒癥毒素的危害[1][2][3]。當氯化氧化劑的損傷后，所產(chǎn)生的含有雙酪氨酸的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物即為AOPP[4]。AOPP可刺激單核細胞分泌TNF-α等炎癥因子[5]。腹膜表層間皮細胞（peritoneal mesothelial cells，PMCs）可維持腹膜結構和功能穩(wěn)定[6][7]。AGEs可導致腹膜功能衰竭[8]。α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）及轉化生長因子β1（TGF-β1）等與腹膜間皮細胞發(fā)生EMT相關。本研究探討尿毒癥晚期糖基化終產(chǎn)物和蛋白結合溶質(zhì)誘導腹膜間皮細胞功能障礙的機制。

1 方法

1.1 細胞培養(yǎng) 將人腹膜間皮細胞（HPMC）移至25mL的細胞培養(yǎng)瓶中，補充含10%胎牛血清的M119培養(yǎng)基至5mL。將細胞置于37℃下的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)和傳代。

1.2 MTT法測定各組細胞增殖抑制率 選取含有0、20、40、60、80、100和120mM的AGEs和AOPP分別作用于人腹膜間皮細胞，采用MTT法測定不同濃度的AGEs或AOPP對各組細胞的增殖抑制率。用酶標儀在570nm處測定吸光度值。細胞增殖抑制率（%）=（1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.3 實時定量PCR（q-PCR）法 人腹膜間皮細胞分組為正常對照（Control）組、80mM AGEs處理（AGEs）組和60mM AOPP處理（AOPP）組。反轉錄體系為20μL：1μL總RNA，4μL 5×Reaction Mix，2μL10×Super Script Enzyme Mix，加入雙蒸水將體系補足至20μL，混勻后離心。反應條件為：37℃下60min，95℃下5min，置于4℃保存?zhèn)溆?。基因的相對表達用2-△△CT法進行計算。

1.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法 電泳結束后，將蛋白轉移至PVDF膜上。一抗（1∶1000）4℃孵育過夜。用TBST洗膜三次，每次15min，二抗（1∶4000）室溫孵育2h，用TBST洗膜三次?；瘜W發(fā)光法顯色。

附表1 MTT法測定不同濃度AGEs對人腹膜間皮細胞增殖抑制率（±s）

附表1 MTT法測定不同濃度AGEs對人腹膜間皮細胞增殖抑制率（±s）

注：與正常對照（0mMAGEs）組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

AGEs濃度（mM） 細胞增殖抑制率（%）0 0.00±0.00 20 6.75±0.42 40 8.58±0.64*60 11.18±0.53*80 19.33±0.62**100 14.55±0.68*120 10.52±0.35*

附表2 MTT法測定不同濃度AOPP對人腹膜間皮細胞增殖抑制率（±s）

注：與正常對照（0mMAOPP）組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

AOPP濃度（mM） 細胞增殖抑制率（%）0 0.00±0.00 20 4.32±0.32 40 6.52±0.25*60 18.25±0.67**80 12.36±0.73*100 9.53±0.65*120 7.54±0.56*

附表3 q-PCR法檢測各組細胞中KLF2的mRNA表達（±s）

注：與Control組相比，**P＜0.01。

組別 KLF2相對mRNA表達Control組 1.00 AGEs組 0.56±0.09**AOPP組 0.47±0.07**

附表4 q-PCR法檢測各組細胞中TGF-β1的mRNA表達（±s）

附表4 q-PCR法檢測各組細胞中TGF-β1的mRNA表達（±s）

注：與Control組相比，**P＜0.01。

組別 TGF-β1相對mRNA表達Control組 1.00 AGEs組 0.56±0.09**AOPP組 0.47±0.07**

2 結果

2.1 MTT法測定不同濃度AGEs對人腹膜間皮細胞增殖抑制率 見附表1。

2.2 MTT法測定不同濃度AOPP對人腹膜間皮細胞增殖抑制率 見附表2。

2.3 q-PCR法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中KLF2 mRNA表達的影響 見附表3。

2.4 q-PCR法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中TGF-β1 mRNA表達的影響 見附表4。

2.5 Western Blot法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中Collagen I 蛋白表達的影響 如附圖1所示，與正常對照組相比，AGEs組和AOPP組人腹膜間皮細胞中Collagen I的蛋白表達上調(diào)（P＜0.01）。

2.6 Western Blot法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中α-SMA蛋白表達的影響 如附圖2所示，與正常對照組相比，AGEs組和AOPP組人腹膜間皮細胞中α-SMA的蛋白表達上調(diào)，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.7 Western Blot法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中E-cadherin蛋白表達的影響 如附圖3所示，與正常對照組相比，AGEs組和AOPP組人腹膜間皮細胞中E-cadherin的蛋白表達下調(diào)，有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

附圖1 Western Blot法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中Collagen I蛋白表達的影響

附圖2 Western Blot法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中α-SMA蛋白表達的影響

附圖3 Western Blot法測定AGEs和AOPP對人腹膜間皮細胞中E-cadherin蛋白表達的影響

3 討論

腹膜間皮細胞可抵抗非生理性的腹膜透析液對基底膜及膜下結締組織的損傷。腹膜間皮細胞對維持腹腔的抗菌防御、細胞外基質(zhì)的合成和降解、調(diào)節(jié)局部血管張力及腹腔內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有重要的作用。尿毒癥晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）和蛋白結合溶質(zhì)（AOPP）是尿毒癥患者透析過程中產(chǎn)生的非生理性的物質(zhì)，可損傷腹膜間皮細胞的結構和功能，導致腹膜功能衰竭。

KLF2因子可表達于成熟的內(nèi)皮細胞中，可通過抑制炎癥相關信號通路，從而發(fā)揮其抗炎功能。高濃度的糖含量抑制KLF2表達，從而加重內(nèi)皮細胞的損傷及炎癥反應。本研究發(fā)現(xiàn)，AGE和AOPP均可抑制人腹膜間皮細胞中KLF2的mRNA表達。

本研究發(fā)現(xiàn)，AGE和AOPP均可提高人腹膜間皮細胞中TGF-β1的mRNA表達，促進腹膜透析時腹膜纖維化和腹膜新生血管的形成。當腹膜間皮細胞發(fā)生EMT后，細胞間粘附連接蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原(Collagen I)的表達發(fā)生變化。α-SMA是細胞轉化為肌成纖維細胞的標志性蛋白。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，人腹膜間皮細胞在受到AGEs或AOPP刺激后，AGE和AOPP均可促進人腹膜間皮細胞的EMT過程，誘導人腹膜間皮細胞功能障礙。

綜上所述，尿毒癥晚期糖基化終產(chǎn)物可通過抑制Krüppel-樣因子2上調(diào)TGF-β1、Collagen I和α-SMA的表達，下調(diào)E-cadherin的表達，誘導人腹膜間皮細胞的上皮-間葉轉化，進而導致人腹膜間皮細胞功能障礙。