五色培元固本方高效液相色譜指紋圖譜及藥效學(xué)研究*

段瑤，陳娟，沈潔

（重慶市中醫(yī)院藥劑科，重慶 400021）

五色培元固本方臨床主要用于改善慢性腎臟疾病（CKD）患者血液透析后蛋白質(zhì)能量消耗（PEW）并發(fā)癥。該方對脾腎氣虛型CKD療效較好，特別是能有效減少長期維持性血液透析患者的并發(fā)癥，提高其生活質(zhì)量。本研究中建立了五色培元固本方基準樣品高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合動物模型評價其對CKD-PEW的藥效作用，為全面控制和評價五色培元固本方的質(zhì)量奠定基礎(chǔ)，并為研究該方治療疾病的作用機制提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包含DAD檢測器（美國Agilent公司）；JA3003J型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；R500型氣體麻醉機（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；Donatello型脫水機（意大利Diapath公司）；JB-P5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；Nikon Eclipse E100型光學(xué)顯微鏡及DS-U3成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；GFL-230型烤箱（天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司）；AS10200AT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

蘇木素-伊紅染液（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號為G1003）；中性樹膠（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為96949-21-2）；酪蛋白（廣東環(huán)凱生物科技有限公司，批號為3209090）；4%酪蛋白（北京科澳協(xié)力飼料有限公司以酪蛋白加工）；尿素氮（BUN）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海江萊生物科技有限公司，批號為JL21202）；肌酐（Cr）、尿素（Upr）比色法試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號分別為E-BC-K188-M，E-BC-K183-M）；無水乙醇、二甲苯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號分別為20190707，20190522）；異氟烷（深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號為20220101）；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純。五色培元固本方原料藥材飲片產(chǎn)地、生產(chǎn)廠家及批號見表1，均經(jīng)重慶市中醫(yī)研究院制劑研究所楊敏主任中藥師鑒定為正品，且符合2020年版《中國藥典》中各飲片標準。

表1 藥材飲片來源信息Tab.1 Source information of medicinal materials

1.3 動物

SPF級SD大鼠40只，8周齡，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004，動物倫理審查號2022-DWSY-SJ。置晝夜光照規(guī)律條件下，自由進食進水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立與評價

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時1%A，10～20 min時1%A→10%A，20～25 min時10%A→15%A，25～30 min時15%A→20%A，30～45 min時20%A→30%A，45～50 min時30%A→60%A，50～60 min時60%A，60～65 min時60%A→85%A，65～67 min時85%A）；流速：1 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.1.2 供試品溶液制備

按五色培元固本方處方比例稱取8種組方藥材，混合，加8倍量水煎煮2次，每次60 min，濾過，合并濾液，減壓濃縮至100 mL；精密量取2 mL，置錐形瓶中，加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）處理60 min，放冷，再次稱定質(zhì)量；用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗：取2.1.2項下供試品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件，連續(xù)進樣測定6次；室溫下放置0，2，4，8，12，24 h時進樣測定；以及制備供試品溶液6份，進樣測定。計算共有峰相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果相對保留時間的RSD分別小于0.54%，0.81%，3.72%（n=6），相對峰面積的RSD分別小于2.23%，3.42%，4.76%（n=6），表明方法精密度良好，供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

2.1.4 指紋圖譜建立及相似度評價

取樣品（S1～S12）各適量，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，并按2.1.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，將色譜圖依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012A版），以S1樣品的特征圖譜為參照圖譜，采用中位數(shù)法，進行多點校正和色譜峰匹配，得到12批樣品HPLC疊加指紋圖譜及對照指紋圖譜，確定了10個共有峰，見圖1和圖2。以對照指紋圖譜為參照圖譜，設(shè)其相似度為1.000，計算12批樣品的相似度，結(jié)果S1～S11樣 品 均為1.000，S12樣 品為0.993，均大 于0.950，相似度良好，表明樣品的穩(wěn)定性、均一性較好。

圖1 12批樣品HPLC疊加指紋圖譜Fig.1 Superimposed HPLC fingerprint of 12 batches of samples

圖2 樣品高效液相色譜對照指紋圖譜Fig.2 HPLC reference fingerprint of the samples

2.2 藥效學(xué)分析

2.2.1 分組與建模

取SD大鼠20只，隨機分為假手術(shù)組（6只，等體積蒸餾水）、模型組（7只，等體積蒸餾水）、五色培元固本方組（7只，9 g/kg）；先切除大鼠2/3左腎，1周后切除右腎，然后連續(xù)8周喂飼4%酪蛋白飼料［1］（5 g/100 g）以復(fù)制CKD-PEW模型，假手術(shù)組僅作切口、剝離腎膜并喂飼常規(guī)飼料；建模同時灌胃相應(yīng)藥物或蒸餾水，每日1次，連續(xù)8周。大鼠存活率為82.5%。

2.2.2 藥效指標

從適應(yīng)期開始至第11周，每周測定大鼠體質(zhì)量1次。末次給藥后，提前24 h將大鼠放入代謝籠，禁食不禁飲，收集尿液與糞便，記錄體質(zhì)量，檢測24 h Upr水平。末次給藥后眼眶取血，分離血清，采用ELISA法檢測血清肌酐（SCr）、BUN水平。眼眶取血后，處死大鼠，取大鼠的腎臟、脛骨前肌，浸泡于4%多聚甲醛中，HE染色，顯微鏡下觀察病理組織形態(tài)，計算脛骨前肌橫截面積。

2.2.3 結(jié)果

一般情況：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠精神狀況較萎靡，毛發(fā)光澤度較暗淡，大小便頻率較高，籠內(nèi)墊料更換頻率較高，體質(zhì)量增長較慢；與模型組比較，五色培元固本方組大鼠毛發(fā)光澤度較好，體質(zhì)量增長速度稍快，大小便頻率稍低，相同時間段內(nèi)籠內(nèi)潔凈度較好。詳見圖3和表2。

圖3 大鼠體質(zhì)量變化情況Fig.3 Changes in body mass of rats

血清生化指標：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的BUN，SCr及24 h Upr水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，五色培元固本方組上述指標水平均明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

病理組織形態(tài)檢查：1）肌肉萎縮。假手術(shù)組大鼠正常肌細胞大小程度不等，呈多邊形排列，肌膜下每個肌細胞有數(shù)個肌細胞核；模型組大鼠肌細胞存在慢性淋巴細胞浸潤現(xiàn)象，且肌細胞面積縮減早于間質(zhì)空間縮減；五色培元固本方組大鼠相比模型組間質(zhì)空間增大及肌細胞面積增大。詳見表2和圖4。2）腎臟病理。肉眼可見模型組及五色培元固本方組大鼠腎臟代償性腫大。顯微鏡下觀察，模型組大鼠腎小管中存在脫落細胞碎片，管狀基底膜區(qū)域被相鄰細胞的細胞質(zhì)薄層覆蓋；腎臟毛細血管中存在間質(zhì)水腫和炎性細胞；灶性腎小管上皮細胞凝固性壞死，腎小管腔內(nèi)可見細胞碎片，且腎小管邊緣不清晰或破裂。與模型組比較，五色培元固本方組大鼠腎小管炎癥減輕，細胞碎片及間質(zhì)水腫減少，但腎小球損傷改善不明顯。詳見圖5。

圖4 大鼠脛骨前肌形態(tài)（HE，×10）A.Sham operation group B.Model group C.Wuse Peiyuan Guben Formula groupFig.4 Morphology of tibialis anterior muscle of rats（HE，×10）

圖5 大鼠腎臟病理組織形態(tài)（HE，×10或×40）A.Sham operation group B.Model group C.Wuse Peiyuan Guben Formula groupFig.5 Pathological histomorphology of kidney of rats（HE，×10 or×40）

表2 各組大鼠相關(guān)指標比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of relevant indexes of rats in each group（±s，n=6）

表2 各組大鼠相關(guān)指標比較（±s，n=6）Tab.2 Comparison of relevant indexes of rats in each group（±s，n=6）

注：與 假 手 術(shù) 組 比 較，△P＜0.05；與 模 型 組 比 較，#P＜0.05。Note：Compared with those in the sham operation group，△P＜0.05；Compared with those in the model group，#P＜0.05.

組別假手術(shù)組模型組五色培元固本方組BUN（mmol/L）2.93±0.66 13.67±0.66△11.73±1.37#SCr（μmol/L）29.37±1.04 63.27±0.76△43.20±0.94#24 h Upr（mg）20.35±1.46 36.98±1.14△26.91±0.98#體質(zhì)量（g）632.80±54.54 547.12±23.22 555.04±59.66脛骨前肌橫截面積（μm2）2 496.78±24.89 1 626.00±22.69△2 205.23±30.55#

3 討論

CKD已成為全球關(guān)注的健康問題，其發(fā)病率以每年約8%的速度增長，成為全球第12大死亡原因［2］。20%～25% CKD患者會發(fā)生PEW，后者被認為是死亡和加速動脈粥樣硬化心血管疾病的危險因素之一。PEW常見于中后期CKD患者，透析患者尤甚，病情因CKD的分期和透析技術(shù)的不同而有所不同，18%～75%成年維持性透析患者存在消耗證據(jù)［3］。因此，需重點處理好CKD進展與糾正PEW之間的平衡。

中醫(yī)認為，PEW是由于外感六淫邪氣，內(nèi)因臟腑虛衰，脾腎虧虛，先后天生化乏源，導(dǎo)致氣血衰敗，五臟六腑失養(yǎng)，脈絡(luò)瘀滯，痰、濕、瘀內(nèi)停，積聚于腎，促進炎癥發(fā)展，蛋白代謝失衡的狀態(tài)，故以扶正祛邪、培脾補腎為主要療法［4-6］。脾為后天之本，氣血生化之源；腎為先天之本，主先天之精氣。氣虛日久，陽為之不足，腎陽衰敗，脾土失于溫煦，無力運化水谷精微，脾腎二臟衰憊，飲食不進，化源不足，必導(dǎo)致機體失于濡養(yǎng)［7-8］。故中醫(yī)宜圍繞本（脾腎虧虛）虛標（濕濁瘀毒）實展開治療，以健脾益腎、益氣養(yǎng)陰、祛濕泄?jié)?、活血和絡(luò)為主要治則，并善于補氣養(yǎng)血，填精助陽，調(diào)養(yǎng)臟腑，充養(yǎng)機體［9-10］。

五色培元固本方有補脾益腎、益氣活血功效，能改善患者脾腎虧虛、氣血不足所致肢體倦怠、腰膝酸軟、氣短聲低、汗多懶言、脘腹痞悶、納差食少等癥。方中生地性寒、味甘苦、滋陰益腎、為君藥；白術(shù)性溫、味甘苦、健脾益氣，黃芪性溫、味甘、善入脾胃、益氣固表，兩藥均能補氣健脾，共為臣藥；防風(fēng)性溫、味辛甘、祛風(fēng)解表、益衛(wèi)固表、祛邪而不傷正、固表而不留邪，當歸性溫、味甘、質(zhì)潤、補血活血行滯，枳殼理氣寬中，共為佐藥；靈芝性平、味甘、補氣安神，紅景天益氣活血，兩藥為使藥，既可助白術(shù)、黃芪補氣之力，又兼具安神、活血之效。全方脾腎同補，氣血并調(diào)，動靜結(jié)合，補而不滯，最終實現(xiàn)扶正祛邪。

預(yù)試驗中分別考察了不同提取方法（超聲法與回流法），不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇）對五色培元固本方提取的影響，不同梯度及全波長掃描對峰分離的影響。結(jié)果表明，使用甲醇為溶劑進行超聲提取，且以2.1.1項下條件梯度洗脫，可獲得更多和含量更高的成分，使得分離的各峰峰形更好，峰響應(yīng)值更高。并通過HPLC法建立了12批五色培元固本方樣品的指紋圖譜，共篩選出10個共有峰，基準樣品相似度較好，表明樣品穩(wěn)定、均一性較好，主要物質(zhì)群差異較小。還通過二次5/6腎切術(shù)搭配低蛋白飼料復(fù)制CKD-PEW模型大鼠，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果結(jié)合實驗效率及給藥影響綜合分析，選擇模型復(fù)制時間為8周。大鼠的“蛋白質(zhì)庫”主要集中在腿部肌肉群，蛋白質(zhì)消耗的臨床表現(xiàn)為肌肉萎縮。而本研究結(jié)果表明，五色培元固本方能通過改善肌間質(zhì)空間及肌細胞面積縮減，有效改善CKD-PEW模型大鼠的腎臟損傷及肌肉萎縮情況，改善因肌肉萎縮帶來的體質(zhì)量增長緩慢或降低的影響。

綜上所述，本研究中所建方法結(jié)果準確、重復(fù)性好，可用于五色培元固本方的質(zhì)量評價。五色培元固本方能有效改善由CKD引起的PEW并發(fā)癥。本研究確定了大鼠CKD-PEW模型的可行性，并為后續(xù)深入開展五色培元固本方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定了一定基礎(chǔ)。