黃曲霉毒素的生物脫毒研究進(jìn)展

陳 暉， 覃先武， 王 俁， 王 茜， 鄧娟娟， 杜梨梨， 鄧張雙，2*

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003；2.三峽大學(xué)中國輕工業(yè)功能酵母重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002）

黃曲霉毒素（AFT）是由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物（計(jì)成等，2010；Hassan等，1995）。已發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20余種，均為二氫呋喃香豆素的衍生物（Hall等，1993）。由于其在紫外線照射下能產(chǎn)生熒光，根據(jù)熒光顏色不同將其分為發(fā)藍(lán)光的B族、發(fā)綠光的G族及其衍生物（張玲玲等，2015）。已經(jīng)分離鑒定出的18種AFT主要為B族和G族兩大類，在動(dòng)物體內(nèi)代謝后能形成M1、M2及多種同源衍生物（史敦勝等，2017；趙春 霞 等，2016；Moyne等，2001；Sweeney等，1998）。

黃曲霉毒素B1（AFB1）是AFT家族中毒性最強(qiáng)的一種，分子結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)毒性位點(diǎn)（孫統(tǒng)政等，2021）。急性毒性是氰化鉀的10倍、砒霜的68倍。致癌能力是二甲基亞硝胺的75倍、二甲基偶氨苯的900倍。AFB1在1993年被世界衛(wèi)生組織列為毒物之首，2002年又被國際腫瘤研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為Ⅰ級強(qiáng)致癌物質(zhì)（孫玲玉等，2012）。AFB1能夠造成人類和動(dòng)物的肝臟損傷，引起肝炎、肝硬化和肝癌等多種疾病（龐慧萍等，2019）。真菌毒素對畜禽養(yǎng)殖業(yè)及飼料工業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響，在食品和飼料等行業(yè)對其含量有嚴(yán)格的限定（龔阿瓊等，2018）。世界衛(wèi)生組織規(guī)定的食品中黃曲霉毒素上限濃度為15 μg/kg，我國食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的上限濃度為20 μg/kg，歐盟規(guī)定的上限濃度為2 μg/kg（劉付香等，2010；Van Egmond等，2004）。

AFB1的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在280~300℃的高溫下才分解。AFB1不溶于水、石油醚和乙醚等，易溶于氯仿、甲醇和乙醇等多種極性有機(jī)溶劑（戴軍，2015；Gratz等，2005）。AFB1在中性溶液中較穩(wěn)定，強(qiáng)酸條件下稍有分解，強(qiáng)堿溶液中迅速分解（喬宏興等，2017）。采用溫和的理化方法較難脫除，生物脫除法因其溫和、安全、高效的特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注和研究。本文對目前比較常見的AFB1生物脫除方法進(jìn)行了綜述，為飼料行業(yè)安全生產(chǎn)提供一定的參考。

1 AFB1的理化脫除方法

吸附法是目前飼料行業(yè)中應(yīng)用較廣泛、成熟且經(jīng)濟(jì)可行的一種脫毒方法。通過添加吸附物質(zhì)，使AFB1在經(jīng)過動(dòng)物腸道時(shí)不被吸收直接排出體外，從而達(dá)到毒素脫除的效果。吸附劑主要依靠特異性基團(tuán)或分子結(jié)構(gòu)吸附毒素。李娟娟等（2009）將酵母培養(yǎng)提取物、水合鋁硅酸鹽和兩者的復(fù)合物作為吸附劑的主要成分，測試其對AFB1的吸附能力。研究結(jié)果表明，水合鋁硅酸鹽為主要成分的吸附劑在體外試驗(yàn)和動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)中效果更好。關(guān)于鋁硅酸鹽的吸附原理，Phillips等（1995）的研究結(jié)果表明，鋁硅酸鹽的表面和層間結(jié)構(gòu)有利于和AFB1形成螯合物。天然蒙脫石也是具有相似功能的化學(xué)吸附劑，Diaz等（2004、2002）的應(yīng)用試驗(yàn)表明，天然蒙脫石能結(jié)合AFB1，降低牛奶中的AFB1含量，也可以添加到飼料中去除AFB1。但天然蒙脫石在應(yīng)用中會(huì)影響基底營養(yǎng)物質(zhì)，存在吸附量較少、選擇性較差、發(fā)生解吸反應(yīng)等問題。通過物理化學(xué)等方法得到的改性蒙脫石應(yīng)用更廣泛（韓露露等，2022）。除此之外，高溫和輻照也是常用的物理脫除方法。高溫導(dǎo)致的營養(yǎng)成分損失和輻照效果的不穩(wěn)定性等缺點(diǎn)也對使用場景造成了一定限制。臭氧處理是近期研究較多的化學(xué)脫除方法。Sultan等（2021）對黃曲霉菌株的不同生長階段和不同條件的臭氧處理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)臭氧能抑制分生孢子的萌發(fā)和AFB1的產(chǎn)生。除了成本因素外，臭氧處理對設(shè)備也提出了更高要求。除此之外，氨水、氨氣或堿液處理也是常用的化學(xué)脫除方法，但在使用過程中需考慮環(huán)保等問題。

2 微生物對AFB1的脫毒作用

微生物對AFB1的脫毒方式主要分為吸附與降解。與理化方法相比，生物脫毒條件溫和，不會(huì)破壞原料本身造成營養(yǎng)成分損失，也不會(huì)改變感官，影響適口性。另外添加的微生物可能作為益生菌提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值。整個(gè)脫毒過程不需要昂貴的設(shè)備，因此更適用于飼料等行業(yè)中的大規(guī)模應(yīng)用（Fellows等，2017）。

2.1微生物對AFB1的吸附作用 除了傳統(tǒng)的鋁硅酸鹽和蒙脫石等化學(xué)吸附劑以外，自然界中的某些微生物如乳酸菌和酵母菌等，由于其特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能夠和AFB1形成復(fù)合體，最終被禽畜排出體外，減少對AFB1的吸收。乳酸菌細(xì)胞壁中的肽聚糖成分如N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺是吸附AFB1的主要原因（蔡俊等，2017）。酵母細(xì)胞壁富含β-葡聚糖和甘露聚糖，具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和形成分子間氫鍵的雙重功能，是一種理想的霉菌毒素吸附劑，可單獨(dú)使用也可與其他吸附材料聯(lián)合使用（Raju等，2000）。

Magnoli等（2016）從肉雞飼料、糞便及消化道中分離得到了9株酵母菌，通過對AFB1的吸附等溫線研究，發(fā)現(xiàn)酵母菌對AFB1的吸附能力和菌株來源無關(guān)。如能利用肉雞飼養(yǎng)環(huán)境中的天然酵母來控制家禽的慢性黃曲霉中毒將更有應(yīng)用前景。隨后Magnoli等（2017）通過體外試驗(yàn)研究了畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）對AFB1的吸附能力，發(fā)現(xiàn)在被100 μg/kg AFB1污染的飼料中添加0.1%的畢赤酵母能夠減輕毒素對肉雞的中毒影響。楚杰等（2013）研究了不同預(yù)處理?xiàng)l件、菌體濃度、處理時(shí)間、pH環(huán)境等因素對布拉酵母菌脫除AFB1效果的影響。試驗(yàn)中超聲波、強(qiáng)酸和高溫等預(yù)處理?xiàng)l件均能使菌體滅活，但對實(shí)際脫毒效果影響不大，表明其脫除AFB1的主要機(jī)理是吸附作用。另外也提到菌體脫毒率越高，水洗對脫毒效果的影響也相對較大。由于布拉酵母菌本身是一種廣泛用于養(yǎng)殖業(yè)的益生菌，能夠防治動(dòng)物胃腸道疾病，結(jié)合其脫除AFB1的能力，在飼料行業(yè)將會(huì)具有良好的應(yīng)用前景。張秀江等（2016）研究了主要成分為釀酒酵母和水合鋁硅酸鹽的吸附劑對霉變飼料中AFB1的吸附和脫除效果。體外吸附試驗(yàn)和蛋雞體內(nèi)吸收試驗(yàn)均表現(xiàn)出該吸附劑對AFB1（500 μg/kg）的吸附作用，其中添加0.25 mg/mL吸附劑的體外試驗(yàn)吸附率達(dá)98%，體內(nèi)試驗(yàn)的吸附率達(dá)86%，表明該吸附劑可用于預(yù)防動(dòng)物食用霉變飼料中毒。Zhou等（2017）從大豆醬中分離出魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）用于吸附去除霉變花生粕中的AFB1（115 μg/kg），通過單因子試驗(yàn)，在最優(yōu)條件下AFB1去除率達(dá)到了97%。在液體發(fā)酵中，魯氏酵母的非活細(xì)胞對AFB1的結(jié)合率最高達(dá)到了74.3%。

除酵母菌以外，乳酸菌作為另一類益生菌，其中的某些菌株也具有特異性吸附脫毒的能力。因此近年來乳酸菌在食品行業(yè)中的防霉去毒應(yīng)用研究逐漸興起。李志剛等（2003）將多種乳酸菌與AFB1振蕩培養(yǎng)1 h和2 h后，檢測細(xì)胞沉淀中AFB1的含量，Ames試驗(yàn)被用于檢測AFB1的致突變性。試驗(yàn)結(jié)果顯示8株乳酸菌結(jié)合AFB1的強(qiáng)度差異從4%到50%不等，其中干酪乳桿菌亞種CGMCC1.539吸附AFB1的能力可達(dá)到49%，AFB1被吸附后依然有致突變性的可能。Ahlberg等（2015）研究也發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能夠降低AFB1在食品和飼料中的毒性，同時(shí)滅活的細(xì)菌細(xì)胞相比活細(xì)胞對AFB1具有更高的結(jié)合能力。Bovo等（2014）評估了鼠李糖乳桿菌菌液和干燥細(xì)胞對AFB1的吸附能力，表明鼠李糖乳桿菌菌液和冷凍干燥的細(xì)胞具有相似的吸附能力，而噴霧干燥的細(xì)胞由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和功能被破壞，幾乎完全喪失了吸附能力，表明乳酸菌對AFB1的吸附作用主要取決于其細(xì)胞壁的完整性結(jié)構(gòu)。Huang等（2017）從豆腐中分離得到一株植物乳桿菌C88，研究其體外的AFB1結(jié)合能力和在小鼠體內(nèi)對AFB1的解毒效果。結(jié)果表明小鼠口服熱殺死的C88菌體，隨糞便排出的AFB1含量增加，通過調(diào)節(jié)AFB1的代謝來減輕中毒癥狀。

微生物與AFB1的結(jié)合往往是可逆的，可能會(huì)導(dǎo)致去毒不徹底、去毒周期長，同時(shí)AFB1也會(huì)隨著食品和飼料的多次加工而游離出來，造成二次污染（李超波等，2012）。因此生物吸附脫毒在應(yīng)用上存在一定局限性，從源頭進(jìn)行生物降解脫毒就顯得十分重要。

2.2微生物對AFB1的降解作用 研究認(rèn)為微生物在生長繁殖過程中所產(chǎn)生的胞外、胞內(nèi)酶能將劇毒的AFB1降解為無毒或微毒產(chǎn)物。目前細(xì)菌降解AFB1的報(bào)道主要有假單胞菌、芽孢桿菌、分枝桿菌、橙色黃桿菌和紅串紅球菌等。真菌降解AFB1的報(bào)道主要有黑曲霉、白腐菌和假蜜環(huán)菌等。真菌的降解作用受周期較長、程度不一和安全性等因素限制，阻礙了其在工業(yè)和農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。Shetty等（2007）的研究發(fā)現(xiàn)，微生物降解AFB1的原理可能是破壞其結(jié)構(gòu)中雙呋喃環(huán)或內(nèi)酯環(huán)單元，分子結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致毒性降低。但目前大多數(shù)具有降解AFB1能力的微生物并不是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部所規(guī)定的可以在食品、飼料中允許添加的菌株，因此在應(yīng)用上存在一定局限性。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部允許在飼料中添加且目前研究較多的主要是芽孢桿菌屬的相關(guān)菌株。

孫玲玉（2014）從泰山土壤中分離并篩選出具有降解AFB1作用的枯草芽孢桿菌，研究了該菌株的AFB1降解率、活性組分及其性質(zhì)，優(yōu)化了其降解AFB1的條件，并對飼料中AFB1的降解效果進(jìn)行了評價(jià)。在實(shí)際應(yīng)用中，該菌株能將霉變飼料的AFB1含量從60 μg/mL左右降到10 μg/mL以下。具有降解功能的活性成分可能是游離于上清液中的一種胞外分泌物。在小鼠安全性試驗(yàn)中，該菌株也被證明是安全的，具有在飼料或者食品行業(yè)中應(yīng)用的可能性。張志敏等（2014）從秦川牛瘤胃中分離鑒定得到了一株巨大芽孢桿菌。在最適條件下接種5%，培養(yǎng)3 d后500 μg/mL的AFB1發(fā)酵培養(yǎng)基中降解率達(dá)79%，表明該菌株在飼料添加等方面有很大的應(yīng)用潛力。徐銘乾等（2015）采用唯一碳源、液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵等多級篩選，得到一株能夠高效降解AFB1的解淀粉芽孢桿菌。該菌株對不同AFB1含量的花生粕飼料樣品降解率均達(dá)到80%以上，降解量分別能達(dá)到10 μg/kg和120 μg/kg左右。降解后的花生粕飼料樣品中AFB1含量均低于30 μg/kg，符合國家限定標(biāo)準(zhǔn)。Xu等（2017）從玉米和大米等樣品中分離篩選了43株細(xì)菌，其中AFB1降解能力最強(qiáng)的為一株沙氏芽孢桿菌。該菌株的培養(yǎng)基上清液相比活細(xì)胞和細(xì)胞提取物的AFB1降解能力更強(qiáng)（分別為77.9%、28.6%和17.2%，P<0.05），加入蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉后降解率從77.9%降低至15.3%，表明降解AFB1的物質(zhì)可能是一種胞外酶。Zhang等（2017）從魚的內(nèi)臟中分離得到一株枯草芽孢桿菌，通過給鴨子飼喂發(fā)霉的玉米來研究該菌株對鴨子生長性能、抗氧化能力以及AFB1殘留的影響。結(jié)果顯示飼喂含有20 μg/kg左右AFB1的玉米會(huì)抑制鴨子的平均日增重和抗氧化能力，而在發(fā)霉玉米中添加該菌株后其各方面性能與空白對照組相似。表明枯草芽孢桿菌能緩解鴨子的中毒現(xiàn)象，將其作為飼料添加劑具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

具有AFB1降解能力的菌株還有很多，Lillehoj等（1967）發(fā)現(xiàn)，橙色黃桿菌能夠去除溶液中的黃曲霉毒素。Line等（1995）通過碳標(biāo)記證明了橙色黃桿菌對AFB1的去除是因?yàn)榫w代謝而非吸附作用。Sangare等（2014）分離得到一株銅綠假單胞菌N17-1，在NB培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，可以降解82.8%的AFB1、46.8%的AFB2和31.9%的AFM1。Eshelli等（2015）篩選發(fā)現(xiàn)Rhodococcus erythropolis，Streptomyces lividans和Streptomyces aureofaciens三種放線菌具有一定的AFB1降解能力。

3 AFB1生物脫毒在飼料中的應(yīng)用

飼料生產(chǎn)和加工過程中對AFB1進(jìn)行脫毒是保證人畜健康和食品安全的重要環(huán)節(jié)。目前AFB1生物降解在工業(yè)上的應(yīng)用主要集中在研究和生產(chǎn)可降解AFB1的酶制劑或菌劑產(chǎn)品等。

酶制劑的應(yīng)用主要是AFB1降解酶及其他復(fù)合酶，陳志敏等（2010）用AFB1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素降解復(fù)合酶直接與發(fā)霉飼料原料、濃縮飼料或全價(jià)飼料混合來進(jìn)行霉菌毒素的脫毒。該方法可以去除飼料中霉菌毒素，有利于動(dòng)物健康，提升經(jīng)濟(jì)效益。蔡俊等（2015）篩選獲得了一株夏孢生枝孢，具有較強(qiáng)的AFB1降解酶合成能力，通過利用工農(nóng)副產(chǎn)物或廢棄物糖蜜、玉米芯粉和橙皮粉發(fā)酵產(chǎn)酶，節(jié)約生產(chǎn)成本。王林等（2019）基于微生物和多種酶的復(fù)合作用，提出用米曲霉和釀酒酵母的發(fā)酵混合酶制劑對霉變的糧油和飼料中的AFB1進(jìn)行處理。

菌劑類產(chǎn)品相比酶制劑產(chǎn)品更方便制備和使用，常見的菌劑用微生物有枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母和魯氏接合酵母等。王旭等（2019）提供的一株溶桿菌和周育等（2019）篩選得到的一株泉水單胞菌均能同時(shí)處理AFB1和赭曲霉毒素A。尹清強(qiáng)等（2020）通過響應(yīng)面回歸設(shè)計(jì)，得出釀酒酵母、地衣芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌的組合，與黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的霉菌毒素降解酶配比，能綜合處理AFB1和玉米赤霉烯酮（ZEA）。表明了微生物菌劑在飼料綜合脫毒方面的應(yīng)用價(jià)值。

目前，市面上也出現(xiàn)了一些AFB1生物脫毒產(chǎn)品，例如上海牧興動(dòng)物藥業(yè)有限公司的產(chǎn)品霉敵含有AFB1解毒酶；鄭州百益寶生物技術(shù)公司的產(chǎn)品脫霉寶含有的降解酶是一種源于畢赤酵母菌種的AFB1降解酶，同時(shí)產(chǎn)品中還含有枯草芽孢桿菌、酵母菌，能夠增加產(chǎn)品的降解能力及營養(yǎng)成分；河南信之本公司的產(chǎn)品化霉凈則含有滅活酵母作為AFB1脫除劑。此外，獲得生產(chǎn)許可證的降解霉菌毒素的微生態(tài)制劑霉立解，為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研制開發(fā)，河南億萬中元生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)生產(chǎn)。產(chǎn)品主要成分為枯草芽孢桿菌及其發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)肉鴨、奶牛、肉雞、仔豬及蛋雞的解毒和生長促進(jìn)作用試驗(yàn)，表明該產(chǎn)品具有高效降解飼料黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素的功能，其中對AFB1的降解率達(dá)到了80%以上；同時(shí)能夠緩解霉菌毒素對動(dòng)物的危害，提高生長性能。

雖然目前已有部分AFB1生物降解產(chǎn)品應(yīng)用于飼料行業(yè)，但由于一些微生物及其培養(yǎng)成分超出我國法律所允許的添加范疇，直接影響到推廣應(yīng)用。由于微生物酶產(chǎn)量低、性質(zhì)不穩(wěn)定、產(chǎn)品價(jià)格偏高且降解機(jī)理及解毒特性缺乏深入研究，導(dǎo)致該類產(chǎn)品暫時(shí)還未被大多數(shù)用戶接受。因此，未來還需要開發(fā)更多高活性、低成本的新型解毒飼料添加劑。

4 結(jié)語

適宜的水分、溫度、營養(yǎng)基質(zhì)等給黃曲霉和寄生曲霉的生長提供了較好的條件。在飼料的生產(chǎn)、加工、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)冗^程中，黃曲霉繁殖產(chǎn)毒，不經(jīng)過處理直接被動(dòng)物食用后會(huì)對動(dòng)物的生長性能、肝臟、免疫系統(tǒng)等造成影響。目前主要通過前期水分控制防止霉變及后期去毒來降低黃曲霉毒素的影響。黃曲霉毒素的去毒研究已經(jīng)取得了一些成果，其中生物脫毒法是現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)，但目前在應(yīng)用上仍然存在著一些不足。因此研究黃曲霉毒素產(chǎn)生的控制措施及各種脫毒技術(shù)，進(jìn)一步開發(fā)能夠高效降解黃曲霉毒素B1的菌種對預(yù)防和處理毒素具有積極重要的作用。