生物強化和中間代謝物擾動對四川麩醋微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝組分的影響

周楠，黃鈞，周榮清*，文平，何培，劉記堂

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)2(四川閬州醋業(yè)有限公司，四川 南充，637455)

食醋是兼有營養(yǎng)和保健功能的酸性調(diào)味品之一。除永春老醋外，中國谷物醋以固態(tài)釀造工藝為主，如山西老陳醋、鎮(zhèn)江香醋和四川麩醋，其工藝特點是淀粉轉(zhuǎn)化、酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵等多邊代謝速率協(xié)調(diào)進(jìn)行[1-2]。作為中國四大名醋之一，四川麩醋以麩皮為原料，因采用回糟生料、分層翻醅的獨特發(fā)酵工藝而獨樹一幟[3]。長期以來，操作者缺乏對其微生物群落及代謝機制的認(rèn)識，僅憑經(jīng)驗調(diào)控品質(zhì)，嚴(yán)重地阻礙其技術(shù)進(jìn)步和生產(chǎn)規(guī)模的擴大。

隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代檢測技術(shù)的快速發(fā)展，功能菌群對發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的貢獻(xiàn)逐漸被揭示。選育優(yōu)良功能菌株并開發(fā)強化工藝是提高產(chǎn)率和改善品質(zhì)的有效措施之一。例如，將Aspergillusniger強化的麩曲應(yīng)用于保寧醋的生產(chǎn)，可提高總酸、有機酸含量以及淀粉利用率，并在連續(xù)三輪發(fā)酵中保持相對穩(wěn)定的品質(zhì)[4-5]。接種Bacillusamyloliquefaciens的強化曲用于同一類型食醋的發(fā)酵，可顯著提高四甲基吡嗪及乙偶姻的含量[3]。類似地，將Lactobacillussp.和Acetobacterpasteurianus進(jìn)行原位生物共培，二者的協(xié)同作用也可促進(jìn)乙偶姻等關(guān)鍵組分的積累[6]。此外，非豐富物種Komagataeibactereuropaeus應(yīng)用于鎮(zhèn)江香醋的發(fā)酵，可有效調(diào)節(jié)細(xì)菌的組成，增強原位共生網(wǎng)絡(luò)的魯棒性，同時上調(diào)了與糖和酒精代謝相關(guān)基因的豐度[7]。因此，生物強化是調(diào)控微生物群落及其功能和改善中國傳統(tǒng)谷物醋質(zhì)量的有效策略。據(jù)報道，乙醇是食醋發(fā)酵過程中關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，也是驅(qū)動微生物群落演替的環(huán)境因子[8-9]。然而，與生物強化模式相比，乙醇對微生物群落及代謝相關(guān)作用機制仍不清楚。

本文主要研究生物強化和中間代謝產(chǎn)物擾動對微生物群落和代謝組分的影響規(guī)律，并探討二者對食醋風(fēng)味貢獻(xiàn)的差異，預(yù)測其對特征風(fēng)味形成途徑中關(guān)鍵酶的調(diào)控作用。旨在科學(xué)地揭示傳統(tǒng)食醋固態(tài)工藝蘊藏的釀造機理，為規(guī)?；a(chǎn)過程參數(shù)的調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

強化醋曲(QHCQ)，接種Bacillusvelezensis和Bacillussubtilis組成的功能菌群，參照HE等[10]所述的工藝生產(chǎn)，由瀘州老窖股份有限公司提供；傳統(tǒng)醋曲(LZCQ)，由四川閬州醋業(yè)有限公司生產(chǎn)；麩皮和次粉購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

草酸(≥99.99%)、檸檬酸(≥99.50%)、酒石酸(≥99.50%)、L-蘋果酸(≥99.00%)、L-焦谷氨酸(≥99.50%)、琥珀酸(≥99.50%)、乙酸(≥99.70%)、乳酸(≥98.00%)、辛酸甲酯(≥99%)等，Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購于本地化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Trace 1300-TSQ 9000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo Fisher Electron公司；配備VF-WAX-MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美國Bellefonte公司；Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀，美國Agilent Technologies公司；配備Alltech OA-1000有機酸柱(300 mm×7.8 mm)，美國Alltech公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 麩醋醋醅的發(fā)酵及取樣

所有的醋醅均按照傳統(tǒng)的四川麩醋固態(tài)釀造技術(shù)生產(chǎn)(圖1)，但發(fā)酵劑和乙醇濃度存在差異。添加20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))LZCQ發(fā)酵的醋醅記為LX，而分別使用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的LZCQ和10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的QHCQ釀造的醋醅記為LS。LJ則是在發(fā)酵起始使用3°食用酒精溶液代替自來水，發(fā)酵劑的添加方式與LX相同。以上3種醋醅在作坊石槽池中發(fā)酵，規(guī)模為400 kg/批。添加20% LZCQ在大槽中發(fā)酵得到的醋醅記為LD，規(guī)模為10 000 kg/批。主發(fā)酵45 d后，將醋醅壓實，在其表面完全覆蓋一層塑料薄膜以提供厭氧環(huán)境，以實現(xiàn)后熟增香(45 d)，相應(yīng)的熟醅分別記為LXYP、LSYP、LJYP及LDYP。在主發(fā)酵和陳釀結(jié)束時，根據(jù)5點采樣法分別從醋池上、中、下層各取50 g醋醅，混合均勻后裝入無菌自封袋，一式3份。取樣結(jié)束立即轉(zhuǎn)運至實驗室，隨即每份樣品分別進(jìn)行理化指標(biāo)和揮發(fā)性組分的檢測，取3次結(jié)果的平均值。保藏于-80 ℃ 的樣品用于微生物群落等分析檢測。

圖1 四川麩醋固態(tài)釀造工藝流程Fig.1 Solid-state fermentation process of Sichuan bran vinegar

1.3.2 微生物群落檢測

樣品總DNA提取：用于Fast DNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals，CA)提取醋醅的總DNA。操作步驟：按照供應(yīng)商提供的操作指令提取總DNA，用NanoDropDN-1000微量分光光度儀(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)分別測定A260和A280，其A260/A280應(yīng)在1.8～2.0，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證其純度。

PCR擴增及測序：分別使用引物338F和806R及ITS5F和ITS1R分別擴增細(xì)菌16S rRNA基因高變區(qū)V3～V4區(qū)和真菌ITS1區(qū)。PCR擴增體系：5×reaction buffer和5×GC buffer各5 μL，0.25 μL DNA聚合酶(5 U/μL，Q5 High-Fidelity)，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，正反引物各1 μL(10 μmol/L)，2 μL DNA模板，8.75 μL ddH2O。使用PCR擴增儀(S1000TM Thermal Cycler，Bio-Rad)，操作程序按照HE等[10]所述步驟。擴增的PCR經(jīng)Agencourt AMPure Beads核酸純化試劑盒(Beckman Coulter，Indianapolis，IN)純化后，委托上海派森諾生物科技股份有限公司在Illumina Miseq 2×300 flat form測序。應(yīng)用QIME處理測序結(jié)果，經(jīng)DATA2完成質(zhì)控、去噪、拼接和去嵌合體后，用UCLUST把相似長度≥150 bp及相似度>97%的序列聚類成可操作性單元(operational taxonomic unit, OTU)。通過Greengenes數(shù)據(jù)庫及UNITE數(shù)據(jù)庫分別搜尋比對真菌和細(xì)菌確定其分類。

1.3.3 理化指標(biāo)檢測

1.3.3.1 殘余淀粉含量測定

稱取2.00 g醋醅于250 mL三角瓶中，加入100 mL 2%(體積分?jǐn)?shù))的鹽酸溶液，在121 ℃下水解20 min，用20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉溶液中和后，定容至250 mL，過濾。濾液用菲林試劑法滴定其總還原糖含量，還原糖與淀粉間換算系數(shù)為0.9。

1.3.3.2 水分含量測定

精確稱取醋醅5.000 0 g，置于105 ℃下恒重，按照GB/T 5009.238—2016規(guī)定的方法測定。

1.3.3.3 總酸、還原糖和氨態(tài)氮含量測定

醋醅經(jīng)如下所述的預(yù)處理得到濾清液，總酸、還原糖和氨態(tài)氮分別按照GB 12456—2021、GB 50097—2016和GB/T 18186—2000規(guī)定的方法測定。樣品預(yù)處理：準(zhǔn)確稱取25 g醋醅，用適量蒸餾水浸泡1 h，15 min攪拌1次，定容至250 mL后過濾，得濾清液。

1.3.4 代謝組分的分析

1.3.4.1 非揮發(fā)性組分

采用高效液相色譜法，樣品的預(yù)處理及檢測條件如COCCHI等[11]所述。主要步驟如下：稱取2.00 g醋醅，用適量9.00 mmol/L H2SO4溶液浸泡并超聲萃取1 h，隨后離心10 min(12 000 r/min，4 ℃)，收集上清液。C18 SPE小柱(Swell科學(xué)儀器有限公司)純化后的濾液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，待上機檢測。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算方法：將標(biāo)準(zhǔn)試劑分別配制成不同濃度的溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過外標(biāo)法計算有機酸含量。

1.3.4.2 揮發(fā)性組分

頂空固相微萃取結(jié)合氣相-質(zhì)譜色譜聯(lián)用儀測定揮發(fā)性組分，樣品的預(yù)處理及色譜條件如ZHANG等[12]所述。主要步驟如下：稱取1.0 g醋醅于頂空瓶，加入10 μL 0.007 9 g/100mL的辛酸甲酯溶液，在(60±1) ℃下平衡15 min，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(美國Supelco公司)插入并吸附45 min后，在進(jìn)樣口解析5 min。定性及定量方法：將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST2017數(shù)據(jù)庫通過比對鑒定揮發(fā)性組分，對于匹配度>800的物質(zhì)予以分析。采用內(nèi)標(biāo)法確定揮發(fā)性組分的相對定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本研究使用SPSS 24.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)中Duncan檢驗法分析其顯著性(P<0.05,n=3)。使用Simca 14.1軟件對風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析(principal components analysis, PCA)。采用Origin 2018軟件作圖。應(yīng)用R語言Vegan和ggplot2等軟件包計算Spearman相關(guān)系數(shù)、繪制熱圖及主坐標(biāo)分析圖(principal co-ordinates analysis, PCoA)。利用Cytoscape 3.8.2軟件對數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落多樣性分析

如表1所示，LX與LS間細(xì)菌Chao1和Simpson指數(shù)較為接近，但與LJ、LD間存在差異。該結(jié)果表明，乙醇擾動降低了細(xì)菌的α-多樣性，而強化曲對其影響較小。乙醇對細(xì)胞膜的損傷作用較大，會導(dǎo)致部分細(xì)菌的形態(tài)或膜通透性的改變，而真菌具有較為致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對其毒性具有一定的抵抗力[13-14]。LX(LXYP)的細(xì)菌類群Chao1指數(shù)高于LD(LDYP)的，故作坊式生產(chǎn)的醋醅微生物的豐富度高于工業(yè)規(guī)模的。

表1 微生物群落的α-多樣性指數(shù)Table 1 Differences of α-diversity indexes among samples

如圖2所示，發(fā)酵結(jié)束時各醋醅群落間分布距離較遠(yuǎn)，故擾動及生產(chǎn)模式均顯著影響細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)。作坊和工業(yè)化操作模式的差異則會導(dǎo)致溫度和溶氧的不同，使其群落結(jié)構(gòu)呈顯著差異[15]。除LDYP細(xì)菌群落及LSYP真菌群落外，其余熟醅則聚為一簇。這可能是由于高酸度、厭氧以及營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的陳釀環(huán)境對微生物群落具有定向馴化作用。

a-細(xì)菌；b-真菌圖2 微生物群落的PCoAFig.2 Principal co-ordinates analysis of microbial community

2.2 不同醋醅群落結(jié)構(gòu)組成的差異

如圖3-a和圖3-b所示，醋醅微生物主要由Firmicutes、Proteobacteria、Ascomycota、Basidiomycota和Mucoromycota組成。陳釀后，Proteobacteria和Mucoromycota的豐度顯著提高，但Firmicutes和Ascomycota的豐度顯著降低。主發(fā)酵結(jié)束時，這些醋醅均以Lactobacillus和Acetobacter為絕對優(yōu)勢細(xì)菌(圖3-c)，與其他谷物醋一致[5,16-17]。Lactobacillus對食醋風(fēng)味的形成具有重要作用，產(chǎn)生乳酸、乙酸、蘋果酸等有機酸，也可合成2,3-丁二醇、乙偶姻等作為四甲基吡嗪的前體物質(zhì)[18]。LS與LX微生物同一菌屬間豐度差異顯著，僅在前者中檢出的Sphingomonas和Komagataeibacter等低豐度菌屬可通過增加冗余性以維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[7]。Lactobacillus和Acetobacter在LJ中的豐度分別為91.50%和7.41%。值得注意的是，強化曲及乙醇擾動分別將Lactobacillus的豐度提高了17.91%和25.27%。曾報道在酒精發(fā)酵階段，乙醇可能具有促進(jìn)Lactobacillus繁殖的作用[9]。LD以Acetobacter為絕對優(yōu)勢細(xì)菌，而Lactobacillus豐度顯著低于LX。這是由于工業(yè)化生產(chǎn)中機械倒醅強度和頻率均更高，醅間溶氧濃度高于作坊式的，故有利于Acetobacter的生長。此外，工業(yè)化醋醅中Oceanobacillus和Bacillus的豐度分別是12.53%和12.13%，二者在作坊式醋醅中豐度均較低。

類似地，擾動和生產(chǎn)模式顯著影響了優(yōu)勢真菌屬的組成(圖3-d)。LX以Thermomyces、Pichia和Trichosporon為優(yōu)勢真菌，LD中Aspergillus、Monascus和Pichia則是優(yōu)勢菌。LS的Aspergillus和Rhizopus豐度顯著高于LX，這可能是源于強化曲的貢獻(xiàn)。此外，Phaeosphaeria、Monascus和Xeromyces也是LS的優(yōu)勢真菌。Monascus的豐度在LS、LJ及LD中分別提高了11.99%、7.65%和19.98%，該菌屬被廣泛用于福建米酒和食醋的釀造，可產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)[19]。相較于LX，Alternaria、Aspergillus和Acremonium豐度在乙醇擾動下增強，并成為LJ的優(yōu)勢菌。其中，Acremonium豐度為10.10%，分泌纖維素酶和半纖維素酶的能力較強[20]。

這些醋醅與醋曲的細(xì)菌組成存在明顯的差異，推測其優(yōu)勢菌屬可能源于原料、微生態(tài)環(huán)境及生產(chǎn)設(shè)施等。陳釀后，Lactobacillus(38.86%～79.06%)豐度有所降低，但仍為絕對優(yōu)勢菌，Acetobacter豐度在該厭氧環(huán)境中顯著降低，在作坊生產(chǎn)的醋醅中均<0.5%。此外，Sphingomonas、Pseudeurotium、Rhizopus和Lichtheimia的豐度都提高，可能與該過程揮發(fā)性組分含量變化密切相關(guān)。

a-細(xì)菌門組成；b-真菌門組成；c-細(xì)菌屬組成；d-真菌屬組成圖3 門及屬水平上細(xì)菌和真菌的相對豐度(OTU>0.5%) Fig.3 Relative abundance of bacterial and fungal community at phylum and genus level (OTU>0.5%)

2.3 發(fā)酵過程和陳釀前后理化性質(zhì)的差異

如圖4所示，除總酸外，水分、殘余淀粉及還原糖含量的動態(tài)變化在主發(fā)酵階段存在差異。發(fā)酵末期，LS淀粉轉(zhuǎn)化率略高于LX和LJ，三者分別為50.81%、48.73%和45.10%。值得注意的是，LD因Bacillus、Oceanobacillus和Aspergillus的豐度較高，分泌淀粉酶、纖維素酶的能力較強[21-22]，故其殘淀含量顯著低于LX的(表2)。陳釀過程淀粉和還原糖含量分別減少了0.80%～7.59%及14.68%～50.00%，總酸呈增加的趨勢，這表明碳水化合物的水解和利用在該階段仍緩慢進(jìn)行。

a-水分；b-總酸；c-殘余淀粉；d-還原糖圖4 手工醋醅發(fā)酵過程理化參數(shù)的變化規(guī)律Fig.4 The changes of physicochemical parameters in manual Cupei during the fermentation

表2 醋醅間理化性質(zhì)的差異Table 2 Differences on physicochemical properties of Cupei

2.4 擾動對代謝組分的影響

優(yōu)勢有機酸為乙酸、乳酸、焦谷氨酸及琥珀酸，其中乳酸和乙酸含量之和占比高達(dá)89.99%～95.09%，構(gòu)成了食醋風(fēng)味的主要骨架(表3)。曾報道乳酸/乙酸是四川麩醋的潛在特征指標(biāo)[23]，因為豐富的乳酸可平衡乙酸的刺激性，賦予麩醋口感柔和、回味悠遠(yuǎn)的特色。該比值在作坊模式生產(chǎn)的醋醅中為0.51～0.73，而工業(yè)化醋醅為0.91～0.93。盡管LJ中Acetobacter豐度顯著低于LX，但其乙酸含量提高了10.42%。這可能是添加的乙醇擾動了淀粉、酒精和乙酸三者間的轉(zhuǎn)化平衡，更高效地推動了乙醇氧化為乙酸。陳釀后，乳酸含量略有下降，這與其被轉(zhuǎn)化為乳酸乙酯有關(guān)。再者，高乙酸濃度的脅迫亦能使乳酸通過D-乳酸脫氫酶作用逆向轉(zhuǎn)化為丙酮酸，合成2,3-丁二醇等風(fēng)味物質(zhì)[24]。

這些樣品中檢出的酯、酸、酮及酚類為優(yōu)勢揮發(fā)性成分(圖5-a和圖5-b)。此外，盡管吡嗪類物質(zhì)含量僅為754.91～4 670.02 ng/g，但它為食醋貢獻(xiàn)令人愉快的堅果香和烘焙的面包味道[25]。其中，四甲基吡嗪是重要的生物活性物質(zhì)，不僅可由美拉德反應(yīng)合成，Bacillus等微生物亦能代謝產(chǎn)生[25-26]。熟醅中四甲基吡嗪含量大小順序如下：LSYP[(3 687.14±318.36) ng/g]>LJYP[(1 863.55±282.88) ng/g]>LXYP[(1 559.40±238.80) ng/g]>LDYP[(588.08±52.70) ng/g]。該結(jié)果表明，2種擾動方式均提高了四甲基吡嗪的含量，其中強化曲擾動的效果更顯著。此外，LSYP乙偶姻、2,3-丁二酮、2,3-丁二醇的含量分別提高了3.64、3.41、1.27倍。乙偶姻可由Lactobacillus和Acetobacter利用雙乙酰還原酶催化轉(zhuǎn)化2,3-丁二酮產(chǎn)生，是評價谷物醋重要的質(zhì)量指標(biāo)[6,18]?？赏茰y強化曲中優(yōu)勢菌Bacillus和Lactobacillus對四甲基吡嗪、乙偶姻等關(guān)鍵組分的合成具有較大的貢獻(xiàn)。

表3 不同醋醅有機酸含量 單位：mg/g

除有機酸以外，乙醇擾動還主要影響了部分醇、酸和吡嗪類物質(zhì)的含量。例如，LJYP中2,3-丁二醇含量是LXYP的2.40倍，前者異丁酸、正己酸、辛酸及壬酸含量也都顯著高于后者，吡嗪類組分的含量提高了36.89%。2,4,5-三甲基惡唑的含量提高了9.52倍，該物質(zhì)可由丁二酮和氨基酸經(jīng)美拉德反應(yīng)生成[27]。由于乳酸含量較高，LDYP的乳酸乙酯含量顯著高于LXYP，該酯可為食醋貢獻(xiàn)果香。

陳釀后，LXYP、LSYP及LJYP酸類和醇類組分含量都顯著增加，吡嗪類物質(zhì)含量分別提高了38.64%、187.48%及99.58%。因3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，酮類組分含量降低。乙酸苯乙酯、乳酸乙酯、乙酸糠酯等酯類組分含量增加，糠醇、苯乙酸、苯乙醛、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-丙基吡嗪及2,3,5-三甲基-6-乙基吡嗪等物質(zhì)在陳釀過程中合成。

2.5 基于風(fēng)味物質(zhì)的PCA

如圖5-c所示，主成分1和2的解釋率分別為36.90%和25.20%。LX、LS及LJ聚為一簇，與LD的距離較遠(yuǎn)。前者的特征組分包括乙偶姻、α-雪松烯、桃醛和琥珀酸等，而后者庚酸乙酯、乙酸庚酯、壬酸乙酯含量較高。該分析結(jié)果揭示了主發(fā)酵結(jié)束時作坊和工業(yè)模式生產(chǎn)的醋醅間風(fēng)味輪廓存在顯著差異，LSYP和LJYP聚為一簇，其特征組分主要是辛酸、3-乙?；?2-丁酮、2,3-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪。二者與LXYP間較為離散，這表明熟醅的特征風(fēng)味受強化曲和乙醇擾動的影響較為顯著。陳釀前后相應(yīng)的醋醅聚在不同象限，故該過程的各種物理和生化反應(yīng)對其風(fēng)味輪廓的形成和發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。

2.6 微生物與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析

如圖5-d所示，基于Spearman相關(guān)系數(shù)揭示了微生物(OTU>0.5%)與重要風(fēng)味物質(zhì)顯著關(guān)聯(lián)的結(jié)果(P<0.05)。有機酸主要與Lactobacillus、Acetobacter、Aspergillus和Pseudomonas相關(guān)。已有研究表明，乙酸主要由Acetobacter和Pseudomonas等菌屬代謝產(chǎn)生[28]。Aspergillus分泌的淀粉酶及纖維素酶等水解酶將原料水解為小分子糖，進(jìn)而通過EMP途徑合成乳酸，故乳酸與Aspergillus顯著正相關(guān)。多種乙酯類(如苯乙酸乙酯、乳酸乙酯)和醇類(如異戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇)與Sphingomonas、Virgibacillus、Hyphopichia、Rhizomucor和Rhizopus呈正相關(guān)。

2.7 擾動對特征風(fēng)味組分代謝途徑的影響

不同醋醅間吡嗪類、乳酸及苯乙醇等組分含量存在顯著差異，與細(xì)菌的代謝密切相關(guān)，故利用PICRUSt2對樣品代謝功能進(jìn)行預(yù)測(圖6)。

圖6 特征風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑分析Fig.6 The metabolic pathways of characteristic flavor compounds

生物擾動后，雙乙酰還原酶(EC：1.1.1.304和EC：1.1.1.76)的表達(dá)上調(diào)有助于四甲基吡嗪、三甲基吡嗪及2,3-丁二醇的積累，因此，上述風(fēng)味組分含量顯著提高。三甲基吡嗪由蘇氨酸脫羧反應(yīng)生成的氨基丙酮中間體與乙偶姻經(jīng)縮合氧化產(chǎn)生，而四甲基吡嗪則是由乙偶姻經(jīng)氨化及環(huán)化縮合反應(yīng)生成[25]。乙醇脫氫酶(EC：1.1.1.1)是提高食醋產(chǎn)率理想的調(diào)控位點[29]，在乙醇擾動后顯著上調(diào)。同樣地，負(fù)責(zé)苯乙醇合成的芳基醇脫氫酶(EC：1.1.1.90)也表達(dá)上調(diào)。調(diào)控乳酸合成的關(guān)鍵酶在強化曲和乙醇擾動后表達(dá)上調(diào)，包括D-乳酸脫氫酶(EC：1.1.1.28)和L-乳酸脫氫酶(EC：1.1.1.27)，這與其乳酸含量較高的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究基于高通量測序及色譜等多種現(xiàn)代檢測技術(shù)揭示了強化曲及乙醇擾動對四川麩醋微生物及代謝組分的影響。結(jié)果表明，2種擾動方式均提高了Lactobacillus、Aspergillus、Rhizopus和Monascus等功能菌屬的豐度，并顯著影響了熟醅的風(fēng)味輪廓。生物擾動顯著提高了四甲基吡嗪、乙偶姻及2,3-丁二酮等功能組分的含量，這與合成相關(guān)的關(guān)鍵酶表達(dá)上調(diào)有關(guān)，有助于增強四川麩醋特征性風(fēng)味。而乙醇擾動使2,4,5-三甲基惡唑的含量提高了9.52倍，并增強了苯乙醇、乳酸等相關(guān)代謝途徑關(guān)鍵酶的表達(dá)。本研究結(jié)果為開發(fā)提高四甲基吡嗪等關(guān)鍵功能組分的調(diào)控技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ)，為控制關(guān)鍵因素優(yōu)化四川麩醋釀造的管理提供了思路。