牛血清白蛋白與辛烯基琥珀酸淀粉酯糖基化產(chǎn)物改善谷維素的理化性質(zhì)和生物可及度

劉曼麗，鐘金鋒，劉雄，覃小麗

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

谷維素(γ-oryzanol，GO)是米糠油中的重要活性成分，在米糠油中含量約占1.5%～3%，它是阿魏酸酯、植物甾醇和三萜醇的混合物[1]。其抗氧化活性是維生素E的4倍，具有抗炎、抗糖尿病、抗衰老等多種作用[2]，因此在食品[3]、醫(yī)藥[4]等領(lǐng)域備受關(guān)注。但是，由于谷維素自身存在溶解度低、吸收效果差以及光、熱不穩(wěn)定等缺點(diǎn)[5]，從而限制了其廣范應(yīng)用。因此，如何提高谷維素的水溶性、吸收率和穩(wěn)定性，進(jìn)而改善其生物可及度，已成為相關(guān)產(chǎn)品在應(yīng)用方面急需關(guān)注的重點(diǎn)。

包埋是一種可以保持活性食品成分的穩(wěn)定和提高其生物可及度的有效方式。包埋谷維素常用的方法有微囊化[6]和微乳化法[7]，但這兩種方法得到的粒徑往往為微米級(jí)，不利于細(xì)胞對(duì)被封裝生物活性化合物的吸收[8]。因此有必要研究納米技術(shù)對(duì)谷維素的包埋。目前，納米技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于槲皮素[9]、姜黃素[10]等活性分子的包埋，采用蛋白與多糖復(fù)合物為載體構(gòu)建的納米顆粒載體對(duì)活性分子有很好的包埋效果且提高了活性分子的穩(wěn)定性和生物可及度[11]。然而，負(fù)載谷維素的納米顆粒研究鮮有報(bào)道。

牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)是牛乳中經(jīng)過酸凝乳或凝乳酶凝固后剩余的液態(tài)部分(乳清)中的一種蛋白，因其與人血清蛋白具有高度同源性，常作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白來使用[12]。辛烯基琥珀酸淀粉酯(octenyl succinate anhydride starch，OSAS)是由淀粉經(jīng)辛烯基琥珀酸酯化改性生成，具有兩親性，常被用作乳化劑、微膠囊壁材等應(yīng)用廣泛[13]。但未見以BSA和OSAS的糖基化產(chǎn)物做載體構(gòu)建納米顆粒的研究，因此，本研究以BSA和OSAS為原料，通過干法美拉德反應(yīng)制備BSA-OSAS糖基化產(chǎn)物，探討糖基化產(chǎn)物對(duì)谷維素的包埋效果，并研究谷維素納米粒子的抗氧化性、體外抗消化性和生物可及度，以期為糖基化產(chǎn)物在谷維素的包埋遞送中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白(CAS No.9048-46-8，純度≥98%)，北京蘭杰柯有限公司；辛烯基琥珀酸淀粉酯(CAS No.26544-38-7)，國(guó)民淀粉化學(xué)(上海)有限公司；谷維素(CAS No.11042-64-1，純度>98%)，大連美倫生物技術(shù)有限公司；其他試劑均屬于分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY98-ⅢDN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外分光分度計(jì)，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；DYCZ-24DN型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Zetasizer ZS90型激光粒徑儀，英國(guó)Malvern公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 BSA-OSAS糖基化產(chǎn)物的制備

將30 g/L的BSA與30 g/L的OSAS分別溶于超純水中，室溫下攪拌過夜，得到BSA母液和OSAS母液。取BSA和OSAS母液按質(zhì)量比1∶1混合，用1 mol/L 的NaOH和HCl調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，混勻溶液置于37 ℃反應(yīng)12 h。樣品經(jīng)冷凍干燥48 h后，研磨平鋪在培養(yǎng)皿內(nèi)于60 ℃，相對(duì)濕度為79%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)48 h，取出樣品后調(diào)節(jié)至蛋白等電點(diǎn)，去除未反應(yīng)的OSAS，樣品凍干得到BSA-OSAS糖基化產(chǎn)物。

1.3.2 聚丙烯酰胺電泳

參考YU等[14]的方法。取1 mg/mL的樣品溶液，與上樣緩沖液按體積比1∶1混合，沸水浴2 min，取10 μL樣品加到凝膠泳道中，樣品在濃縮膠時(shí)電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓為120 V。分離膠和濃縮膠的濃度分別為12%和5%。

1.3.3 負(fù)載谷維素的BSA-OSAS納米粒子的制備

參考FAN等[10]的方法，并稍作修改。配制BSA-OSAS糖基化產(chǎn)物溶液(4 g/L，pH 5.8)，取一定量10 g/L的GO乙醇溶液加入BSA-OSAS糖基化產(chǎn)物溶液中，使BSA-OSAS與GO的質(zhì)量比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1，磁力攪拌60 min后將溶液在180 W下超聲6 min 得到負(fù)載GO的納米粒子溶液。此外，以負(fù)載GO的BSA與OSAS質(zhì)量比為1∶1的物理共混物(Mix-GO)和BSA作對(duì)照，按照上述步驟制備。

1.3.4 納米粒子的粒徑和電位的測(cè)定

參考YI等[15]的方法，采用Zetasizer ZS90型激光粒徑儀測(cè)定，水相溶液的折射率設(shè)置為1.33，測(cè)試溫度為25 ℃，平衡時(shí)間為2 min。

1.3.5 包埋率和負(fù)載率的測(cè)定

先用紫外光譜確定谷維素的吸收波長(zhǎng)[16]，再用分光光度法測(cè)定谷維素含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在327 nm處測(cè)其吸光值，以谷維素的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.030 5x-0.009，R2=0.998 8)。

包埋率與負(fù)載率的測(cè)定參考FENG等[17]的方法，并作適當(dāng)修改。在4 ℃放置 24 h后，取10 mL負(fù)載谷維素的納米粒子溶液在8 000 r/min下離心10 min，上清液用10 mL乙醇萃取，充分振蕩30 min后離心(8 000 r/min，5 min)，得到乙醇相。萃取重復(fù)2次，合并萃取液。將萃取液用乙醇適當(dāng)稀釋，在327 nm處測(cè)吸光值，包埋率和負(fù)載率計(jì)算分別如公式(1)和公式(2)所示：

(1)

(2)

1.3.6 谷維素納米粒子的抗氧化特性

參考FAN等[10]的方法，并稍作修改。用超純水配制蛋白質(zhì)量濃度為0.5 g/L的BSA-OSAS-GO、Mix-GO、OSAS-GO(其中GO質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL)各5 mL；用超純水配制質(zhì)量濃度為0.5 g/L的BSA、BSA-OSAS、BSA與OSAS的物理共混(Mix)、OSAS溶液5 mL。以無(wú)樣品的超純水作為空白對(duì)照。取上述樣品溶液各100 μL加入到2 mL 1.75×10-4mol/L的DPPH 乙醇溶液中，室溫避光反應(yīng)60 min，檢測(cè)其在517 nm處的吸光值，按公式(3)計(jì)算DPPH自由基清除率。

取7 mmol/L的ABTS水溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合，避光反應(yīng)12 h以上。取上述樣品溶液各100 μL加入到2 mL ABTS溶液中，振蕩20 s，反應(yīng)6 min，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值， ABTS陽(yáng)離子自由基清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A1為DPPH自由基或ABTS陽(yáng)離子自由基空白對(duì)照的吸光值，At為反應(yīng)60 min或6 min后樣品溶液的吸光值，B為樣品空白的吸光值。

1.3.7 谷維素納米粒子的貯藏穩(wěn)定性

參考劉堯等[18]的方法，并作適當(dāng)修改。配制負(fù)載谷維素的納米溶液20 mL，用超純水和無(wú)水乙醇配制GO溶液做對(duì)照，分別置于4、25 ℃下避光、25 ℃自然光下貯藏15 d，每隔3 d取出2 mL 的納米粒子溶液，在10 000 r/min下離心10 min，上清液用乙醇萃取，充分渦旋3 min后離心(8 000 r/min，5 min)，得到乙醇相。萃取重復(fù)2次，合并萃取液。將萃取液用乙醇適當(dāng)稀釋，測(cè)定327 nm 處的吸光值，根據(jù)1.3.5中的標(biāo)曲測(cè)定納米粒子的谷維素含量，按公式(4)計(jì)算殘留率，以殘留率表征其貯藏穩(wěn)定性。

(4)

1.3.8 谷維素納米粒子的體外消化特性

參考PRIMOZIC等[19]的方法, 并作適當(dāng)修改。將各樣液(20 mL)與等體積的胃液(3.2 g/L的胃蛋白酶，150 mmol/L的NaCl)混合，并調(diào)pH至2.0。將混合溶液置于搖床(37 ℃，100 r/min)中保溫60 min后，將pH調(diào)至7.0以終止反應(yīng)。取20 mL胃液消化60 min后的溶液與等體積的腸液(0.3 g/L的CaCl2、30.72 mmol/L NaCl、5 g/L膽汁鹽和8 g/L的胰酶)混合，并調(diào)pH至7.0，置于搖床(37 ℃，100 r/min)中保溫180 min。在胃-腸液的消化過程中，每隔30 min取出2 mL的消化液測(cè)定其粒徑。

1.3.9 谷維素納米粒子的生物利用度

參考FENG等[17]的方法，并作適當(dāng)修改。取10 mL 1.3.8中消化180 min后的樣品于離心管中，離心(4 ℃，10 000 r/min，20 min)。樣品離心后一般被分為上層(負(fù)載谷維素的透明膠束)和下層(未消化的樣品形成的致密不溶物質(zhì))。分別取2 mL消化180 min 后的樣品和2 mL上層溶液檢測(cè)谷維素的含量，并按公式(5)計(jì)算谷維素的生物可及度:

(5)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次平行，結(jié)果以平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26進(jìn)行單因素ANOVA分析(P<0.05時(shí)表示組間差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA-OSAS的表征

當(dāng)多糖與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)時(shí)，交聯(lián)產(chǎn)物在聚丙烯酰胺電泳圖的濃縮膠中顯現(xiàn)染色條帶或者在濃縮膠和分離膠的交界處展現(xiàn)拖尾條帶[20]。BSA 的分子質(zhì)量主要分布在67 kDa處[21]，聚丙烯酰胺電泳圖中呈現(xiàn)了相應(yīng)的特征帶(圖1，泳道2)。Mix(泳道3)在67 kDa 處出現(xiàn)條帶且與BSA(泳道2)類似。與泳道2和3相比，泳道4蛋白質(zhì)在67 kDa 的條帶出現(xiàn)輕微上移，在濃縮膠與分離膠交界處出現(xiàn)新的染色條帶。這表明OSAS以共價(jià)的形式接到BSA中，形成了大分子質(zhì)量的糖蛋白聚合物。GUO等[22]也有類似的發(fā)現(xiàn)，在聚丙烯酰胺電泳圖中也顯示有較大分子質(zhì)量的聚合物生成，這表明干法美拉德反應(yīng)生成了大分子量的糖蛋白。

圖1 聚丙烯酰胺凝膠電泳Fig.1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis band注：圖泳道1～4分別為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker、BSA、Mix和BSA-OSAS

2.2 BSA-OSAS與谷維素的質(zhì)量比對(duì)納米粒子物理性質(zhì)的影響

如圖2-a所示，BSA-OSAS與谷維素的質(zhì)量比從10∶1增加到50∶1時(shí)，BSA-OSAS-GO的納米粒子粒徑穩(wěn)定在110 nm左右(50∶1時(shí)粒徑增加了10.96 nm)；BSA-GO的粒徑從144.74 nm 降低為123.43 nm；Mix-GO則從111.32 nm增加到151.94 nm。這些結(jié)果表明，相較于Mix和BSA，BSA-OSAS糖基化產(chǎn)物提高了顆粒的密度，形成了結(jié)構(gòu)更為致密的尺寸較小的顆粒。納米粒子的電位隨著BSA-OSAS與谷維素的質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)(圖2-b)。通常，電位絕對(duì)值越高，納米顆粒之間的靜電斥力越大，它們彼此締合的可能性越小，體系越穩(wěn)定[23]。當(dāng)BSA-OSAS與谷維素的質(zhì)量比在20∶1與40∶1之間時(shí)，此時(shí)的納米粒子的粒徑較小，電位絕對(duì)值較高，說明該質(zhì)量范圍內(nèi)負(fù)載谷維素的納米粒子溶液更穩(wěn)定。

a-粒徑；b-電位圖2 質(zhì)量比對(duì)谷維素納米顆粒的粒徑及電位的影響Fig.2 Effect of mass ratio on the particle size and ζ-potential of γ-oryzanol nanoparticles注:不同字母表示各處理之間存在顯著差異(P<0.05)(下同)

2.3 BSA-OSAS與谷維素的質(zhì)量比對(duì)谷維素的包埋率與負(fù)載率的影響

隨著BSA-OSAS與GO的質(zhì)量比的增加，包埋率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)(圖3-a)。當(dāng)質(zhì)量比為40∶1時(shí)，BSA-OSAS-GO的包埋率(84.46%)顯著高于Mix-GO(75.67%)和BSA-GO(62.78%)的包埋率，表明蛋白質(zhì)經(jīng)過糖基化之后可以提高其對(duì)GO的包埋效果?？赡苁怯捎贐SA經(jīng)過糖基化后，分子間提供更強(qiáng)的疏水作用力和氫鍵，從而更好地與GO結(jié)合，提高包埋能力。由圖3-b可知，3種納米粒子均隨著質(zhì)量比的增加而荷載能力降低?？紤]到納米粒子的荷載率不能過低并具有較高的包埋率，因此選取BSA-OSAS與GO的質(zhì)量比為40∶1進(jìn)行后續(xù)研究。

a-包埋率；b-負(fù)載率圖3 質(zhì)量比對(duì)谷維素的包埋率和負(fù)載率的影響Fig.3 Effect of mass ratio on the encapsulation efficiency and loading rate of γ-oryzanol

2.4 谷維素納米粒子的抗氧化性分析

谷維素抗氧化能力主要來源于阿魏酸分子的酚羥基基團(tuán)，可阻止自由基鏈的傳遞[24]。如圖4所示，BSA的DPPH自由基清除率(6.31%)和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率(3.29%)均顯著低于BSA-OSAS的DPPH自由基清除率(11.67%)和ABTS陽(yáng)離子自由基清除率(10.37%)。這可能是因?yàn)镺SAS共價(jià)接入BSA，產(chǎn)生了協(xié)同作用，使BSA-OSAS的抗氧化性提高。谷維素在水溶液和乙醇溶液對(duì)DPPH自由基的清除率分別為13.05%和77.31%，ABTS陽(yáng)離子自由基活性清除結(jié)果與DPPH自由基清除結(jié)果有著相似的趨勢(shì)。BSA-OSAS-GO的DPPH自由基清除率(55.44%)顯著高于BSA-GO(48.32%)和Mix-GO(41.03%)，但低于溶解在無(wú)水乙醇中的谷維素溶液(77.31%)。其原因可能是谷維素中的活性基團(tuán)與蛋白質(zhì)分子間形成氫鍵，對(duì)活性基團(tuán)產(chǎn)生一定的屏蔽效果[25]。這些結(jié)果表明相較于Mix和BSA，經(jīng)過糖基化修飾的BSA-OSAS顯著提高了谷維素的抗氧化性。

圖4 不同樣品的DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical and ABTS cation radieal scavenging ability of different samples

2.5 谷維素納米粒子的貯藏穩(wěn)定性分析

在自然光照下貯存15 d后，谷維素在水溶液和乙醇溶液2種體系中的殘留率(分別為50.48%和54.72%)顯著低于BSA-OSAS-GO的殘留率72.75%(圖5-a)。這表明BSA-OSAS能夠減緩谷維素的降解，且BSA-OSAS-GO的雙層結(jié)構(gòu)對(duì)谷維素有更好的保護(hù)效果。由圖5-a和圖5-b可知，在光照條件下 BSA-OSAS-GO 中谷維素的殘留率從76.96%下降至 72.75%，其他 4 種體系也表現(xiàn)出相似的降低趨勢(shì)。這表明光照會(huì)加速谷維素的降解。由圖5-b和圖5-c可得出，貯存溫度從25 ℃降為4 ℃后，BSA-OSAS-GO中谷維素的殘留率從76.96%變?yōu)?4.45%，這表明貯存溫度越低，納米粒子對(duì)谷維素的保護(hù)效果越好。此外，BSA-OSAS-GO納米粒子中谷維素的殘留率均高于其他4種體系(圖5)，表明BSA-OSAS-GO能夠有效地保護(hù)谷維素，減少外界條件對(duì)谷維素的影響。

2.6 谷維素納米粒子的體外抗消化性分析

在0～60 min模擬胃液消化階段，BSA-GO的粒徑增加最大(從1 692 nm迅速增加到3 285.55 nm，圖6)，可能是BSA-GO經(jīng)過胃液水解后，胃液中的鹽離子屏蔽了蛋白質(zhì)表面電荷，使分子間靜電斥力降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集[26]。BSA-OSAS-GO納米粒子在胃液消化過程中的粒徑增加幅度要遠(yuǎn)小于BSA和Mix-GO納米粒子。這可能由于BSA經(jīng)過糖基化后，不容易被胃蛋白酶水解[27]；也可能是BSA-OSAS在經(jīng)過胃蛋白酶消化過程中，先消化OSAS外殼從而延緩了蛋白質(zhì)被消化聚集；還有可能是BSA-OSAS-GO納米粒子初始電位絕對(duì)值較高，納米顆粒之間的靜電斥力較大，體系較穩(wěn)定(圖2-b)。在60～180 min模擬腸液消化階段，3種納米粒子的粒徑都出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，其中BSA-OSAS-GO粒徑最小為641.55 nm。這表明經(jīng)過腸液消化后，其在胃液中形成的聚集體大部分發(fā)生解離，使溶液中的納米粒子粒徑減小。綜上，BSA-OSAS為載體的納米粒子在消化過程中，能起到緩慢消化的效果。

a-25 ℃自然光；b-25 ℃避光；c-4 ℃避光圖5 貯藏條件對(duì)谷維素的殘留率的影響Fig.5 Effect of storage conditions on the retention rate of γ-oryzanol

圖6 模擬胃腸消化過程中谷維素納米顆粒的粒徑變化Fig.6 Changes in average particle size of γ-oryzanol nanoparticles during in vitro digestion

2.7 谷維素納米粒子的生物可及度分析

未包埋的谷維素經(jīng)過胃腸道消化后，其生物可及度為(9.94±0.59)%。谷維素經(jīng)過納米粒子包埋后，BSA-OSAS-GO的生物可及度(40.23±1.04)%顯著高于Mix-GO(28.99±0.75)%和BSA-GO(23.16±0.96)%(P<0.05)，其原因可能是糖基化作用使得BSA-OSAS-GO納米粒子在消化系統(tǒng)中更加穩(wěn)定(圖6)，從而促進(jìn)了結(jié)晶谷維素在膠束化過程中的溶解[28]。因此，BSA-OSAS-GO納米粒子能顯著提高谷維素的生物可及度，且BSA-OSAS-GO的提升效果要優(yōu)于Mix-GO和BSA-GO。

3 結(jié)論與討論

本文利用干法美拉德反應(yīng)制備了BSA-OSAS，研究了BSA、Mix和BSA-OSAS糖基化產(chǎn)物負(fù)載谷維素的納米粒子的理化性質(zhì)和生物可及度。BSA-OSAS與谷維素質(zhì)量比為40∶1時(shí)，BSA-OSAS納米粒子對(duì)谷維素的包埋率最大為84.46%。相較于對(duì)照組(BSA-GO，Mix-GO)，BSA-OSAS-GO納米粒子能夠更加有效地保護(hù)谷維素，提高其抗氧化性(DPPH自由基清除率為55.44%，ABTS陽(yáng)離子自由基清除率為49.81%)并減緩了外界條件對(duì)谷維素的影響(在4 ℃避光，25 ℃避光和25 ℃ 自然光照下分別貯藏15 d，谷維素的殘留率分別為84.45%，76.96%和72.75%)。此外，BSA-OSAS-GO納米粒子在體外模擬胃腸道中能夠起到緩慢消化的效果且提高了谷維素的生物可及度(40.23%)，進(jìn)一步拓寬了其在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用。在今后的研究中，可探究利用不同的多糖進(jìn)行糖基化，將結(jié)果與本文對(duì)比，比較不同多糖接枝蛋白納米粒子對(duì)谷維素的保護(hù)效果，以期為拓寬其應(yīng)用提供一定的技術(shù)參考。