• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒桿菌的代謝工程構建

    2022-12-29 12:53:02李宇虹李貴榮楊文君孟燕王浚哲張成林
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年24期
    關鍵詞:血紅素脫氫酶丙酸

    李宇虹,李貴榮,楊文君,孟燕,王浚哲,張成林

    (天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)

    作為谷氨酸的重要衍生物,5-氨基乙酰丙酸在生物體內有重要的作用,如參與血紅素等四氫吡咯化合物的合成[1-2]。5-氨基乙酰丙酸具有促進植物生長、抑制昆蟲繁殖等生物活性,故被廣泛應用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等領域[3-4]。此外,5-氨基乙酰丙酸還作為光敏劑被應用于癌癥的光動力學診斷和治療[5-6]。

    5-氨基乙酰丙酸的規(guī)模生產(chǎn)主要采用化學法合成,但由于合成步驟復雜、得率低等因素限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和應用[7]。自從在微生物中發(fā)現(xiàn)其合成途徑以來,生物法合成5-氨基乙酰丙酸被廣泛關注。早期人們利用小球藻、類球紅細菌等微生物的自身途徑合成5-氨基乙酰丙酸,而后開展利用代謝工程等手段以大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌等為底盤細胞構建合成菌株[1-2,8]。目前生物法合成5-氨基乙酰丙酸主要包括基于C4途徑的前體物添加法和基于C5途徑的發(fā)酵法[1,9-10]。前者以甘氨酸和琥珀酰輔酶A或琥珀酸為前體,經(jīng)5-氨基乙酰丙酸合成酶催化合成5-氨基乙酰丙酸[10]。該方法使操作程序復雜化,且甘氨酸對細胞存在抑制作用,限制了其規(guī)?;a(chǎn)[11]。故人們將注意力轉向發(fā)酵法合成5-氨基乙酰丙酸。在C5途徑中,葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)生成α-酮戊二酸,然后經(jīng)4步反應生成5-氨基乙酰丙酸(圖1)[2,12-14]。與C4途徑相比,利用C5途徑合成5-氨基乙酰無需額外添加前體物,更易于操作。

    Glc-葡萄糖;PEP-磷酸烯醇式丙酮酸;Pyr-丙酮酸;OAA-草酰乙酸;AcCoA-乙酰輔酶A;CIT-檸檬酸;ICI-異檸檬酸;α-KG-α-酮戊二酸;SUCC-琥珀酸輔酶A;Glu-谷氨酸;GlutRNA-谷氨酸酰tRNA;GSA-谷氨酸-1-半醛;5-ALA-5-氨基乙酰丙酸;PBG-膽色素原;Heme-血紅素圖1 5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑及本研究主要策略Fig.1 C5 pathway for synthesis of 5-aminolevulinic acid and the strategies used in this study

    RAMZI等[15]首次在谷氨酸棒桿菌中構建了5-氨基乙酰丙酸合成途徑實現(xiàn)其直接發(fā)酵合成。YU等[16]發(fā)現(xiàn)血紅素的過量生成影響了5-氨基乙酰丙酸合成,并通過控制溶氧等方式抑制了血紅素的合成。ZHANG等[17]通過敲除谷氨酸高產(chǎn)菌株S914中的谷氨酸分泌蛋白、精氨酸和脯氨酸分泌蛋白編碼基因NCgl1221、lysE和putP以減少L-谷氨酸的消耗,從而提高5-氨基乙酰丙酸合成。KO等[18]利用α-酮戊二酸脫氫酶抑制蛋白OdhIT14A/T15A弱化谷氨酸棒桿菌α-酮戊二酸脫氫酶活性以提高α-酮戊二酸供應。ZHANG等[19]以大腸桿菌為宿主對C5途徑進行系統(tǒng)代謝工程改造,通過表達谷氨酰-tRNA還原酶編碼基因hemA和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶編碼基因hemL、增強磷酸吡哆醛供應、弱化5-氨基乙酰丙酸降解等策略獲得工程菌株,在3 L發(fā)酵罐中實驗發(fā)現(xiàn)5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到5.25 g/L。由此推測α-酮戊二酸供應和5-氨基乙酰丙酸的降解可能是影響5-氨基乙酰丙酸合成的關鍵要素。

    有前期研究中,我們通過增強前體物合成、增加輔酶供應等策略強化了5-氨基乙酰丙酸的合成。在此基礎上,本研究進一步考察限制5-氨基乙酰丙酸合成的因素,主要策略包括強化α-酮戊二酸合成、弱化α-酮戊二酸降解、動態(tài)調控血紅素的生成、增強5-氨基乙酰丙酸輸出等,為提升5-氨基乙酰丙酸的合成提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    KH2PO4等無機鹽,國藥集團試劑有限公司;基因組DNA純化試劑盒、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、QuickCut限制酶、RNAiso Plus、Titanium一步法RT-PCR試劑盒等,寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司;ClonExpress?Ⅱ One-Step Cloning Kit,南京諾唯贊生物科技有限公司。

    Ultimate 3000型高效液相色譜儀,美國ThermoFisher Scientific公司;PD-10脫鹽濾柱,英國GE Healthcare公司。

    1.2 菌株與質粒

    本研究所用的菌株和質粒如表1所示。大腸桿菌EscherichiacoliDH5α用于重組質粒的構建,E.coliW3110用于rhtA基因的擴增。

    表1 本研究所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

    1.3 引物

    本研究所用引物及其序列如表2所示。

    1.4 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH 7.0~7.5。

    BHIS培養(yǎng)基(g/L):BHI 37,山梨醇91,pH 7.0~7.5。

    種子培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中加入終質量濃度為0.5 g/L的葡萄糖,pH 7.0~7.5。

    改良CGXⅡ培養(yǎng)基:CGXⅡ培養(yǎng)基中加入終質量濃度為3 g/L的酵母粉,pH 7.0~7.5。

    表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

    1.5 質粒及菌株的構建

    以大腸桿菌E.coliW3110基因組DNA為模板,利用引物rhtA-1/rhtA-2擴增rhtA基因,產(chǎn)物經(jīng)電泳并純化后利用ClonExpress?Ⅱ One-Step Cloning Kit連接至經(jīng)線性化的pEC-XK99E質粒(經(jīng)限制性內切酶SacI酶切、電泳、回收并純化),轉化至E.coliDH5α[20-21]。挑取陽性菌落并提取重組質粒,分別利用EcoR I及EcoR I/Hind Ⅲ進行單、雙酶切驗證,以pEC-XK99E質粒為對照,將驗證正確的質粒命名為pEC-XK99E-rhtA。將pEC-XK-99E-rhtA電轉化至AL9,挑取陽性菌落進行菌落聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR),將驗證正確的重組菌株命名為AL10。采用同樣方法構建pEC-XK-99E-thrE和AL11。

    采用同源重組的方法進行基因的基因組整合或啟動子替換。以整合Ptuf-rhtA為例,利用引物cg2973-1/cg2973-2、cg2973-7/cg2973-8、cg2973-3/cg2973-4及cg2973-5/cg2973-6擴增cg2973上下游同源臂、Ptuf及rhtA,PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳并純化后利用ClonExpress?Ⅱ One-Step Cloning Kit連接至經(jīng)線性化的自殺質粒pK18mobsacB(經(jīng)限制性內切酶XbaI酶切、電泳、回收并純化),轉化至E.coliDH5α經(jīng)驗證后獲得pK18mobsacBcg2973∶∶Ptuf-rhtA。將pK18mobsacBcg2973∶∶Ptuf-rhtA電轉化至AL9[20-21],挑取陽性菌落利用引物cg2973-9/cg2973-10進行菌落PCR(以AL9為對照),將驗證正確的重組菌株命名為AL12。

    1.6 實時定量PCR

    收集發(fā)酵液,用RNAiso Plus提取總RNA并利用Titanium一步法RT-PCR試劑盒進行實時定量PCR檢測,數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法[22]。

    1.7 α-酮戊二酸脫氫酶活性測定

    收集發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min(4 ℃)離心10 min后收集細胞,用N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺鈉溶液(100 mmol/L,pH 7.0)洗滌3次后重懸。上述細胞重懸超聲破碎20 min后經(jīng)12 000 r/min(4 ℃)離心30 min,上清液經(jīng)脫鹽濾柱過濾。取100 μL濾液至含100 mmol/LN-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺鈉、5 mmol/L MgCl2、3 mmol/L半胱氨酸、3 mmol/L焦磷酸硫胺、0.2 mmol/L乙酰輔酶A及1 mmol/L NAD+的1 mL體系中,定時測定OD340值[23]。

    1.8 發(fā)酵實驗

    將菌株于BHIS液體培養(yǎng)基活化后,以15%(體積分數(shù))接種量接種至種子培養(yǎng)基,于32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)8~10 h,至OD600=10~12。將種子培養(yǎng)物以15%(體積分數(shù))接種量接種至含40 mL改良CGXⅡ培養(yǎng)基中,于32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h,發(fā)酵期間補加800 g/L葡萄糖,補加氨水使pH維持在7.0~7.5。上述培養(yǎng)中均含15 mg/L氯霉素。利用AL10和AL11發(fā)酵時,還需添加20 mg/L卡那霉素,發(fā)酵至8 h時添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylvbeta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)。

    1.9 檢測與分析方法

    菌體生物量以OD600值計,吸取1 mL發(fā)酵液適當稀釋后利用分光光度計測定。用分光光度法測定5-氨基乙酰丙酸濃度,吸取1 mL發(fā)酵液于溫室條件下經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清液,再次離心后適當稀釋備用。配制1 mL反應體系,其中含上述上清液、0.25 mL乙酰丙酮以及0.5 mL的乙酸鈉緩沖液(1 mol/L,pH 4.6),于沸水中水浴15 min后冷卻至室溫。取1 mL上述反應液與等體積二甲氨基苯甲醛混合,30 min后測定554 nm處吸光度[24]。取1 mL發(fā)酵液的上清液與等體積二甲氨基苯甲醛混合,30 min后測定555 nm處吸光度以測定膽色素原濃度[25]。用熒光法測定血紅素濃度,取1 mL發(fā)酵液的上清液與等體積草酸溶液(2 mol/L)混合,測定662 nm處吸光度,激發(fā)光波長為400 nm[26]。

    2 結果與分析

    2.1 過表達icd基因對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

    在三羧酸循環(huán)中,關鍵酶異檸檬酸脫氫酶(由icd基因編碼)催化異檸檬酸合成α-酮戊二酸,同時生成NADPH,二者均為5-氨基乙酰丙酸合成所需[27]。在出發(fā)菌株AL6中,已表達檸檬酸合酶編碼基因gltA,故推測在此基礎上表達icd基因可進一步將代謝流引向α-酮戊二酸,同時提高NADPH的供應,從而有利于5-氨基乙酰丙酸的合成。為考察表達icd基因對菌株合成5-氨基乙酰丙酸的影響,將icd基因的啟動子替換為強啟動子Ptuf。將pK18-Picd∶∶Ptuf轉化至AL6,經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖2所示,從AL6和重組菌中獲得堿基數(shù)約為1 200、1 600 bp的片段,分別與Picd替換前后堿基數(shù)一致(分別為1 179、1 621 bp)。表明啟動子替換成功,將其命名為AL7。

    搖瓶發(fā)酵實驗考察AL7的特性,結果如圖3-a所示。AL7較出發(fā)菌株AL6的生物量略有提高,其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量達到1.36 g/L,較AL6提高18.3%。該結果表明過表達icd基因可增強三羧酸循環(huán)代謝流從而為5-氨基乙酰丙酸的合成提供更多的α-酮戊二酸。

    M-Marker;1-AL6菌落PCR;2-第1次重組菌株菌落PCR;3-AL7菌落PCR圖2 AL7菌落PCR鑒定圖譜Fig.2 Map for PCR identification of AL7

    2.2 弱化α-酮戊二酸脫氫酶活性對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

    過表達icd基因后AL7的生物量較AL6高,表明增加的α-酮戊二酸除用于5-氨基乙酰丙酸合成外還用于生長。α-酮戊二酸可分別由谷氨酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶催化生成L-谷氨酸和琥珀酰CoA,其中L-谷氨酸是合成5-氨基乙酰丙酸的前體物。研究發(fā)現(xiàn),谷氨酸脫氫酶對α-酮戊二酸的米氏常數(shù)(Km=5.7 mmol/L)遠高于α-酮戊二酸脫氫酶(Km=0.02~0.13 mmol/L),故α-酮戊二酸優(yōu)先用于琥珀酰CoA的合成[27]。因此,調節(jié)α-酮戊二酸節(jié)點代謝流的分配對5-氨基乙酰丙酸的合成至關重要。有報道表明,通過敲除α-酮戊二酸脫氫酶E1亞基編碼基因odhA失活α-酮戊二酸脫氫酶可以顯著抑制菌體生長[11]。近年來,隨著對谷氨酸棒桿菌系統(tǒng)生物學研究的不斷深入,已發(fā)現(xiàn)多種不同轉錄強度的啟動子。CHENG等[28]以綠色熒光蛋白編碼基因gfp為報告基因,測定了來源于谷氨酸棒狀桿菌的多個啟動子的轉錄強度,發(fā)現(xiàn)4-羥基-2,3,4,5-四氫二吡啶甲基酸還原酶基因dapB的啟動子為弱啟動子。

    為減少α-酮戊二酸轉化為琥珀酰CoA的代謝流,擬將odhA基因啟動子PodhA替換為PdapB以期弱化其表達從而降低α-酮戊二酸脫氫酶活性。采用重疊PCR擴增PodhA同源臂片段,并連接至自殺質粒pK18mobsacB,獲得重組質粒pK18-PodhA∶∶PdapB。將pK18-PodhA∶∶PdapB轉化至AL7,經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖4所示,從AL7和重組菌中獲得堿基數(shù)約為1 400、1 600 bp的片段,分別與PodhA替換前后堿基數(shù)一致(分別為1 400、1 583 bp)。表明啟動子替換成功,將其命名為AL8。

    搖瓶發(fā)酵實驗結果表明,與AL7相比,AL8生物量降低13.2%,但其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量提高41.2%,達到1.92 g/L(圖3-a)。酶活性實驗結果表明,AL8的α-酮戊二酸脫氫酶活性較AL7降低33.3%(圖3-b)。上述結果說明弱啟動子PdapB有效降低了odhA的轉錄致使α-酮戊二酸脫氫酶降低,從而使得一部分代謝流由生長轉移至5-氨基乙酰丙酸的合成。

    2.3 弱化5-氨基乙酰丙酸脫水酶編碼基因hemB減少副產(chǎn)物生成

    5-氨基乙酰丙酸可經(jīng)5-氨基乙酰丙酸脫水酶催化生成膽色素原,后者經(jīng)數(shù)步反應生成血紅素。在AL8發(fā)酵過程中,發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液顏色逐漸變紅,暗示有血紅素生成。經(jīng)檢測,發(fā)酵液中膽色素原和血紅素質量濃度分別達到12.35、5.31 mg/L。由于血紅素是菌體生長必需物質,故不能通過敲除hemB等基因阻斷膽色素原和血紅素的合成。ZHANG等[17]通過將hemB自身核糖體結合位點序列替換為翻譯強度較弱的核糖體結合位點以弱化5-氨基乙酰丙酸向膽色素原的代謝,使得5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量提高18.5%。YU等[16]在5-氨基乙酰丙酸脫水酶C端加入SsrA標簽以動態(tài)降解該酶,使得膽色素原濃度降低約40%。在前期研究中發(fā)現(xiàn)來源于谷氨酸棒桿菌的乙醛脫氫酶啟動子(PCP_2836)屬于生長依賴型啟動子,其轉錄強度在對數(shù)中后期顯著下降[29]。故將hemB基因的啟動子替換為PCP_2836以期動態(tài)調控hemB轉錄,提高5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量并降低膽色素原和血紅素的積累。

    采用重疊PCR擴增PCP_2836同源臂同源片段,并連接至自殺質粒pK18mobsacB,獲得重組質粒pK18-PhemB∶∶PCP_2836。將pK18-PhemB∶∶PCP_2836轉化至AL8,經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖5所示,從AL8和重組菌中獲得堿基數(shù)約為1 200、1 500 bp的片段,分別與PhemB替換前后堿基數(shù)一致(分別為1 168、1 427 bp)。表明啟動子替換成功,將其命名為AL9。

    M-Marker;1-AL8菌落PCR;2-第1次重組菌株菌落PCR;3-AL9菌落PCR圖5 AL9菌落PCR鑒定圖譜Fig.5 Map for PCR identification of AL9

    與AL8相比,AL9生物量未見顯著變化,其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量提高12.0%,達到2.15 g/L(圖6-a)。發(fā)酵液中膽色素原和血紅素質量濃度分別達到1.69、0.24 mg/L,較AL8降低86.3%和95.5%(圖6-b)。實時定量PCR結果表明,hemB的轉錄水平在發(fā)酵16 h后逐漸降低(圖6-c)。上述結果表明,利用PCP_2836實現(xiàn)了對hemB基因轉錄的動態(tài)調控,從而弱化了5-氨基乙酰丙酸向血紅素的代謝流,進而提高其產(chǎn)量。

    2.4 增強輸出對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

    研究表明來源于大腸桿菌的蘇氨酸輸出蛋白(由rhtA編碼)能夠識別5-氨基乙酰丙酸,并將其輸出至胞外[8]。谷氨酸棒桿菌亦含有蘇氨酸輸出蛋白(由thrE編碼)[30]。為考察蘇氨酸輸出蛋白對5-氨基乙酰丙酸合成的影響,擴增rhtA和thrE基因并分別連接至表達質粒pEC-XK99E,獲得pEC-XK99E-rhtA和pEC-XK99E-thrE。將二者分別轉化至大腸桿菌E.coliDH5α,經(jīng)篩選后挑取單菌落并提取質粒進行酶切驗證。如圖7-a所示,經(jīng)單酶切的pEC-XK99E-rhtA堿基數(shù)約為8 000 bp,與pEC-XK99E和rhtA堿基數(shù)之和一致(分別為7 018、888 bp);該質粒經(jīng)雙酶切分別獲得堿基數(shù)約為7 000、900 bp的片段,表明pEC-XK99E-rhtA構建成功。同理證明pEC-XK99E-thrE構建成功(圖7-b)。分別將質粒pEC-XK99E-rhtA和pEC-XK99E-thrE轉化至AL9,獲得菌株AL10和AL11。搖瓶實驗結果表明,AL10和AL11的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量分別達到2.51、2.32 g/L,較AL9提高16.7%和7.9%(圖8),說明過表達蘇氨酸輸出蛋白有利于5-氨基乙酰丙酸的輸出,且rhtA效果優(yōu)于thrE。

    a-菌株5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量及生物量;b-副產(chǎn)物質量濃度;c-AL9中hemB相對轉錄強度圖6 菌株AL8和AL9發(fā)酵特性Fig.6 Characteristics of AL8 and AL9

    a-AL10和pEC-XK99E-rhtA鑒定圖譜(M-Marker;1-AL10菌落PCR;2-pEC-XK99E經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;3-pEC-XK99E-rhtA經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;4-pEC-XK99E-rhtA經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切) b-AL11和pEC-XK99E-thrE鑒定圖譜(M-Marker;1-AL11菌落PCR;2-pEC-XK99E經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;3-pEC-XK99E-thrE經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;4-pEC-XK99E-thrE經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切) c-AL12鑒定圖譜(M-Marker;1-AL9菌落PCR;2-第1次重組菌株菌落PCR;3-AL12菌落PCR) 圖7 AL10、AL11和A12鑒定圖譜Fig.7 Map for PCR identification of AL10, AL11, and AL12

    由圖8可知,AL10和AL11的生物量分別較AL9降低12.2%和15.9%,推測可能是質粒增加了菌株的代謝負擔。由于過表達rhtA基因的效果優(yōu)于thrE,故采用基因組整合的方式過表達該rhtA基因,以期減小菌體代謝負擔。利用重疊PCR擴增cg2973同源臂片段及強啟動子Ptuf,并連接至自殺質粒pK18mobsacB,獲得重組質粒pK18-cg2973∶∶Ptuf-rhtA。將pK18-cg2973∶∶Ptuf-rhtA轉化至AL9,經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖7-c 所示,從AL9和重組菌中分別獲得堿基數(shù)約為1 100、2 000 bp的片段,與Ptuf-rhtA整合前后堿基數(shù)一致(分別為1 169、2 067 bp)。表明Ptuf-rhtA整合成功,將其命名為AL12。AL12的發(fā)酵特性如圖8所示,其生物量明顯高于AL10,與AL9無顯著差異;其5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到2.69 g/L,分別比AL9、AL10和AL11高21.5%、7.2%和15.9%。綜上所述,采用基因組整合的方式對菌株代謝壓力較小,優(yōu)于質粒過表達的方式。

    圖8 AL10、AL11和A12的發(fā)酵特性Fig.8 Characteristics of AL10, AL11, and AL12

    3 結論

    本研究首先通過表達icd基因強化α-酮戊二酸的合成并利用弱啟動子下調odhA基因轉錄進而弱化α-酮戊二酸脫氫酶活性,為5-氨基乙酰丙酸的合成提供了前體物。然后利用生長依賴型啟動子動態(tài)調控hemB轉錄,降低了5-氨基乙酰丙酸向血紅素的代謝流。在此基礎上證明谷氨酸棒桿菌蘇氨酸輸出蛋白ThrE具有輸出5-氨基乙酰丙酸的功能,大腸桿菌蘇氨酸輸出蛋白RhtA效果更佳;采用基因組整合過表達rhtA的方式效果更好。獲得的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵,其5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到2.69 g/L,與已報道的谷氨酸棒桿菌C5途徑合成5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量接近。本研究證明調控α-酮戊二酸脫氫酶和5-氨基乙酰丙酸脫水酶是高效合成5-氨基乙酰丙酸的關鍵,故在后續(xù)研究中,擬進一步探索對其精準調控的策略(如利用感受胞內代謝物的啟動子、群體感應系統(tǒng)等)。此外,NADPH供應也是合成5-氨基乙酰丙酸的瓶頸,后續(xù)擬利用輔因子工程等策略提高其供應,以期進一步提高其合成效率。

    猜你喜歡
    血紅素脫氫酶丙酸
    人11β-羥基類固醇脫氫酶基因克隆與表達的實驗研究
    食品中丙酸鈉、丙酸鈣測定方法的改進
    乙醇脫氫酶的克隆表達及酶活優(yōu)化
    K/γ-Al2O3催化丙酸甲酯合成甲基丙烯酸甲酯
    化工進展(2015年3期)2015-11-11 09:07:41
    血紅素氧合酶-1與急性腎損傷研究新進展
    2-18F-氟丙酸在正常小鼠體內的生物學分布
    血紅素加氧酶-1對TNF-α引起內皮細胞炎癥損傷的保護作用
    H3PW12O40/Y-β催化丙酸異戊酯的綠色合成
    應用化工(2014年3期)2014-08-16 13:23:50
    急性白血病患者乳酸脫氫酶水平的臨床觀察
    鴨心蘋果酸脫氫酶的分離純化及酶學性質
    食品科學(2013年23期)2013-03-11 18:30:10
    一级,二级,三级黄色视频| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲美女搞黄在线观看| av有码第一页| 精品国产乱码久久久久久小说| 国国产精品蜜臀av免费| 久久久久精品性色| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 欧美日韩亚洲高清精品| 久久鲁丝午夜福利片| a级毛片在线看网站| 七月丁香在线播放| 插阴视频在线观看视频| 国产爽快片一区二区三区| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲精品,欧美精品| 精品久久国产蜜桃| 亚洲欧美一区二区三区国产| 两个人免费观看高清视频 | 国产日韩欧美视频二区| 亚洲国产精品999| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲精品色激情综合| 国产免费一区二区三区四区乱码| 伊人久久国产一区二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| videossex国产| 成年av动漫网址| 不卡视频在线观看欧美| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产视频内射| 亚洲在久久综合| 国产黄色免费在线视频| 久久精品国产自在天天线| 成人国产av品久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 能在线免费看毛片的网站| 一本大道久久a久久精品| 精品一区二区三区视频在线| a级毛色黄片| 亚洲精品一区蜜桃| 人妻 亚洲 视频| 亚洲成色77777| 午夜日本视频在线| 人人妻人人澡人人看| 久久久久久伊人网av| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国国产精品蜜臀av免费| 精品一区在线观看国产| 偷拍熟女少妇极品色| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一级二级三级毛片免费看| 国产高清国产精品国产三级| 一级毛片我不卡| 国产乱人偷精品视频| av福利片在线观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国模一区二区三区四区视频| 男女无遮挡免费网站观看| 永久网站在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩精品有码人妻一区| 精品午夜福利在线看| 久久久精品94久久精品| 99热国产这里只有精品6| 亚洲精品视频女| 亚洲美女视频黄频| 亚洲国产欧美在线一区| 91精品国产国语对白视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 十八禁高潮呻吟视频 | h日本视频在线播放| 色94色欧美一区二区| 高清视频免费观看一区二区| 18+在线观看网站| av在线老鸭窝| 久久精品国产亚洲av天美| 久久久久久久国产电影| 91精品国产九色| 日本黄色片子视频| 午夜激情福利司机影院| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产在线男女| 精品视频人人做人人爽| 免费人成在线观看视频色| 在线观看一区二区三区激情| videos熟女内射| 久久久国产欧美日韩av| 久热久热在线精品观看| 国产美女午夜福利| 国产淫片久久久久久久久| 美女cb高潮喷水在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 嫩草影院入口| 伦理电影免费视频| 日韩大片免费观看网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲av福利一区| 2018国产大陆天天弄谢| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品成人在线| 交换朋友夫妻互换小说| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99国产精品免费福利视频| 亚洲国产精品999| 99国产精品免费福利视频| 成年人免费黄色播放视频 | 国产精品.久久久| 不卡视频在线观看欧美| 国产在线视频一区二区| 久久久久国产网址| 大陆偷拍与自拍| 日本免费在线观看一区| 久久国产精品大桥未久av | 日日摸夜夜添夜夜爱| 精品国产国语对白av| 亚洲精品国产av成人精品| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日本欧美国产在线视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产精品一区www在线观看| 国产精品伦人一区二区| 精品亚洲成国产av| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看 | 国内精品宾馆在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久精品国产亚洲网站| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲图色成人| 97在线人人人人妻| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久99蜜桃精品久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 日本91视频免费播放| 99视频精品全部免费 在线| 中国三级夫妇交换| 人妻人人澡人人爽人人| 成年av动漫网址| 国产毛片在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 在线观看免费日韩欧美大片 | 成人特级av手机在线观看| 国内精品宾馆在线| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产精品福利在线免费观看| 久久久精品94久久精品| 亚洲综合精品二区| 18禁动态无遮挡网站| 免费看不卡的av| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲欧洲国产日韩| 9色porny在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 久热久热在线精品观看| 国产欧美日韩精品一区二区| 五月开心婷婷网| 亚洲精品视频女| 狂野欧美激情性bbbbbb| 麻豆乱淫一区二区| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 中国三级夫妇交换| 亚洲av不卡在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产精品一区二区在线不卡| av在线老鸭窝| 欧美日韩在线观看h| 99九九在线精品视频 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | a级一级毛片免费在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 久久久久国产精品人妻一区二区| 久久久国产精品麻豆| 久久久国产一区二区| 一级av片app| 免费观看在线日韩| 国产免费视频播放在线视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 成人美女网站在线观看视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99热全是精品| 国产免费福利视频在线观看| 一二三四中文在线观看免费高清| av专区在线播放| 国产一区二区在线观看日韩| 日韩亚洲欧美综合| 性高湖久久久久久久久免费观看| 在线观看国产h片| 又爽又黄a免费视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日本欧美国产在线视频| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 九色成人免费人妻av| 嘟嘟电影网在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 丝袜喷水一区| 亚洲欧洲国产日韩| 超碰97精品在线观看| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| av天堂久久9| av黄色大香蕉| 久久精品国产自在天天线| 男人爽女人下面视频在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 免费av中文字幕在线| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品成人在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 十八禁网站网址无遮挡 | 欧美+日韩+精品| 亚洲精品色激情综合| 91精品国产九色| 午夜福利网站1000一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| av视频免费观看在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成人午夜精彩视频在线观看| 在线观看三级黄色| 新久久久久国产一级毛片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲熟女精品中文字幕| 在线观看国产h片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品人妻久久久久久| 免费人妻精品一区二区三区视频| 青春草亚洲视频在线观看| 免费黄色在线免费观看| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 多毛熟女@视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 人人妻人人看人人澡| 久久99一区二区三区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 观看美女的网站| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲第一av免费看| 插逼视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 免费看不卡的av| 国产精品国产三级专区第一集| 一区二区三区四区激情视频| 久久精品国产a三级三级三级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 看非洲黑人一级黄片| 91在线精品国自产拍蜜月| 免费在线观看成人毛片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产欧美亚洲国产| 精华霜和精华液先用哪个| 久久 成人 亚洲| 亚洲av不卡在线观看| 少妇高潮的动态图| 色吧在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 午夜影院在线不卡| 亚洲av.av天堂| 久久久久久久大尺度免费视频| 欧美精品一区二区大全| 在线 av 中文字幕| 免费观看av网站的网址| 黄色毛片三级朝国网站 | 99九九线精品视频在线观看视频| 久热这里只有精品99| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 中文字幕制服av| 日韩一本色道免费dvd| av国产精品久久久久影院| 午夜影院在线不卡| 欧美xxⅹ黑人| 97在线视频观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产精品成人在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产乱来视频区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩在线观看h| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品第二区| 另类亚洲欧美激情| 成人亚洲欧美一区二区av| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产亚洲一区二区精品| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 日本与韩国留学比较| 水蜜桃什么品种好| a级毛片在线看网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 色网站视频免费| 国产亚洲最大av| 观看免费一级毛片| 大陆偷拍与自拍| 国产成人精品婷婷| 国产一级毛片在线| 亚洲av欧美aⅴ国产| 午夜免费鲁丝| 久久久久久久久久久丰满| 99视频精品全部免费 在线| 极品人妻少妇av视频| 国产 精品1| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产免费一区二区三区四区乱码| 久久国产精品大桥未久av | 日本免费在线观看一区| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产av精品麻豆| 黄色毛片三级朝国网站 | 99久国产av精品国产电影| 黑丝袜美女国产一区| 91精品伊人久久大香线蕉| 精品视频人人做人人爽| freevideosex欧美| 高清不卡的av网站| 少妇精品久久久久久久| 日韩一本色道免费dvd| 国产综合精华液| 亚洲国产成人一精品久久久| 亚洲成色77777| 中国三级夫妇交换| 高清毛片免费看| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产精品久久久久久精品古装| 在线看a的网站| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品三级大全| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久99一区二区三区| 国产在视频线精品| 国产免费福利视频在线观看| av女优亚洲男人天堂| 我的老师免费观看完整版| 男人和女人高潮做爰伦理| 永久网站在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜日本视频在线| 少妇熟女欧美另类| 日本与韩国留学比较| 国产亚洲一区二区精品| av免费观看日本| 丝袜在线中文字幕| 少妇人妻 视频| 九九爱精品视频在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 午夜精品国产一区二区电影| 日本wwww免费看| 久热久热在线精品观看| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲人成网站在线播| 看非洲黑人一级黄片| 成年av动漫网址| 亚洲美女视频黄频| 老女人水多毛片| 久久久久视频综合| 日韩一区二区视频免费看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产精品三级大全| 人妻少妇偷人精品九色| 欧美日本中文国产一区发布| 多毛熟女@视频| 久久久精品免费免费高清| 精品一区在线观看国产| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 大陆偷拍与自拍| 国产在视频线精品| 欧美精品一区二区大全| 国产乱来视频区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 高清欧美精品videossex| 日韩成人伦理影院| 少妇人妻一区二区三区视频| 美女福利国产在线| 成年女人在线观看亚洲视频| 最黄视频免费看| 午夜精品国产一区二区电影| 久久久久久伊人网av| 丝瓜视频免费看黄片| 国产黄频视频在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 日本黄色片子视频| 国产男女超爽视频在线观看| 一级毛片电影观看| 一级av片app| 黄片无遮挡物在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲av男天堂| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲国产av新网站| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 高清午夜精品一区二区三区| 中国国产av一级| 成人美女网站在线观看视频| 午夜av观看不卡| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲性久久影院| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲av不卡在线观看| 欧美xxⅹ黑人| 成人影院久久| 欧美97在线视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 在线精品无人区一区二区三| 精品国产一区二区久久| 免费在线观看成人毛片| av福利片在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 夫妻午夜视频| 国产成人freesex在线| 99久久综合免费| 久久人妻熟女aⅴ| 熟女人妻精品中文字幕| 深夜a级毛片| 欧美成人午夜免费资源| 啦啦啦在线观看免费高清www| 久久毛片免费看一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 五月开心婷婷网| 美女cb高潮喷水在线观看| 美女大奶头黄色视频| 在线观看www视频免费| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 精品一区在线观看国产| 大香蕉久久网| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲精品自拍成人| 中文字幕亚洲精品专区| 成人国产av品久久久| 黄色一级大片看看| 插阴视频在线观看视频| 亚洲精品自拍成人| 国产精品久久久久久久久免| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成年女人在线观看亚洲视频| 综合色丁香网| 国产av码专区亚洲av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久精品国产亚洲av天美| 在线观看三级黄色| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美三级亚洲精品| 99热这里只有是精品在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 深夜a级毛片| 日韩一区二区三区影片| 22中文网久久字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 一区二区av电影网| 91精品国产九色| 久久99精品国语久久久| 简卡轻食公司| 亚洲av日韩在线播放| 日韩免费高清中文字幕av| 久久女婷五月综合色啪小说| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产成人一区二区在线| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久久久久久久久丰满| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产精品一二三区在线看| 制服丝袜香蕉在线| 我要看黄色一级片免费的| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 秋霞在线观看毛片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 简卡轻食公司| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一级毛片我不卡| 亚洲中文av在线| 久久6这里有精品| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 青青草视频在线视频观看| 日韩电影二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 又爽又黄a免费视频| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久久久久久大尺度免费视频| 在线观看免费日韩欧美大片 | 国产成人aa在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 成人无遮挡网站| 黄色一级大片看看| 天堂8中文在线网| 久久久欧美国产精品| 2018国产大陆天天弄谢| 精品久久久噜噜| 亚洲av福利一区| 国产一区有黄有色的免费视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 九九爱精品视频在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美成人午夜免费资源| 一级毛片电影观看| 亚洲成色77777| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产精品福利在线免费观看| 日本黄色片子视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 性色av一级| 免费人妻精品一区二区三区视频| 在线免费观看不下载黄p国产| av网站免费在线观看视频| 下体分泌物呈黄色| 又大又黄又爽视频免费| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 丝瓜视频免费看黄片| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲成色77777| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲国产精品999| 美女cb高潮喷水在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 国产成人精品一,二区| 久久青草综合色| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 草草在线视频免费看| 国产又色又爽无遮挡免| 99九九在线精品视频 | 国产乱人偷精品视频| av一本久久久久| 国产av精品麻豆| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲精品日本国产第一区| 日本午夜av视频| 精品视频人人做人人爽| 99久久综合免费| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费黄频网站在线观看国产| 精品少妇久久久久久888优播| 边亲边吃奶的免费视频| av线在线观看网站| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲欧美精品自产自拍| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品欧美亚洲77777| 久久国产精品大桥未久av | 久久久久久伊人网av| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲精品日本国产第一区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 春色校园在线视频观看| 日韩中字成人| 少妇的逼水好多| 午夜福利影视在线免费观看| 日本午夜av视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 午夜老司机福利剧场| 国产 一区精品| 久热这里只有精品99| 插阴视频在线观看视频| 观看av在线不卡| 成人午夜精彩视频在线观看| 插阴视频在线观看视频| 69精品国产乱码久久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 婷婷色综合www| 精品国产乱码久久久久久小说| 人人妻人人看人人澡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产极品粉嫩免费观看在线 | av天堂中文字幕网| 欧美3d第一页| √禁漫天堂资源中文www| 国产av码专区亚洲av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产视频首页在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 欧美性感艳星| 中文天堂在线官网| 伊人久久国产一区二区| 大码成人一级视频| 人人妻人人看人人澡| 国产综合精华液| 黄色日韩在线| 曰老女人黄片| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 色哟哟·www|