合成5-氨基乙酰丙酸谷氨酸棒桿菌的代謝工程構建

李宇虹，李貴榮，楊文君，孟燕，王浚哲，張成林

(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)

作為谷氨酸的重要衍生物，5-氨基乙酰丙酸在生物體內有重要的作用，如參與血紅素等四氫吡咯化合物的合成[1-2]。5-氨基乙酰丙酸具有促進植物生長、抑制昆蟲繁殖等生物活性，故被廣泛應用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等領域[3-4]。此外，5-氨基乙酰丙酸還作為光敏劑被應用于癌癥的光動力學診斷和治療[5-6]。

5-氨基乙酰丙酸的規(guī)模生產(chǎn)主要采用化學法合成，但由于合成步驟復雜、得率低等因素限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和應用[7]。自從在微生物中發(fā)現(xiàn)其合成途徑以來，生物法合成5-氨基乙酰丙酸被廣泛關注。早期人們利用小球藻、類球紅細菌等微生物的自身途徑合成5-氨基乙酰丙酸，而后開展利用代謝工程等手段以大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌等為底盤細胞構建合成菌株[1-2,8]。目前生物法合成5-氨基乙酰丙酸主要包括基于C4途徑的前體物添加法和基于C5途徑的發(fā)酵法[1,9-10]。前者以甘氨酸和琥珀酰輔酶A或琥珀酸為前體，經(jīng)5-氨基乙酰丙酸合成酶催化合成5-氨基乙酰丙酸[10]。該方法使操作程序復雜化，且甘氨酸對細胞存在抑制作用，限制了其規(guī)?；a(chǎn)[11]。故人們將注意力轉向發(fā)酵法合成5-氨基乙酰丙酸。在C5途徑中，葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)生成α-酮戊二酸，然后經(jīng)4步反應生成5-氨基乙酰丙酸(圖1)[2,12-14]。與C4途徑相比，利用C5途徑合成5-氨基乙酰無需額外添加前體物，更易于操作。

Glc-葡萄糖；PEP-磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr-丙酮酸；OAA-草酰乙酸；AcCoA-乙酰輔酶A；CIT-檸檬酸；ICI-異檸檬酸；α-KG-α-酮戊二酸；SUCC-琥珀酸輔酶A；Glu-谷氨酸；GlutRNA-谷氨酸酰tRNA；GSA-谷氨酸-1-半醛；5-ALA-5-氨基乙酰丙酸；PBG-膽色素原；Heme-血紅素圖1 5-氨基乙酰丙酸C5合成途徑及本研究主要策略Fig.1 C5 pathway for synthesis of 5-aminolevulinic acid and the strategies used in this study

RAMZI等[15]首次在谷氨酸棒桿菌中構建了5-氨基乙酰丙酸合成途徑實現(xiàn)其直接發(fā)酵合成。YU等[16]發(fā)現(xiàn)血紅素的過量生成影響了5-氨基乙酰丙酸合成，并通過控制溶氧等方式抑制了血紅素的合成。ZHANG等[17]通過敲除谷氨酸高產(chǎn)菌株S914中的谷氨酸分泌蛋白、精氨酸和脯氨酸分泌蛋白編碼基因NCgl1221、lysE和putP以減少L-谷氨酸的消耗，從而提高5-氨基乙酰丙酸合成。KO等[18]利用α-酮戊二酸脫氫酶抑制蛋白OdhIT14A/T15A弱化谷氨酸棒桿菌α-酮戊二酸脫氫酶活性以提高α-酮戊二酸供應。ZHANG等[19]以大腸桿菌為宿主對C5途徑進行系統(tǒng)代謝工程改造，通過表達谷氨酰-tRNA還原酶編碼基因hemA和谷氨酸-1-半醛氨基轉移酶編碼基因hemL、增強磷酸吡哆醛供應、弱化5-氨基乙酰丙酸降解等策略獲得工程菌株，在3 L發(fā)酵罐中實驗發(fā)現(xiàn)5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到5.25 g/L。由此推測α-酮戊二酸供應和5-氨基乙酰丙酸的降解可能是影響5-氨基乙酰丙酸合成的關鍵要素。

有前期研究中，我們通過增強前體物合成、增加輔酶供應等策略強化了5-氨基乙酰丙酸的合成。在此基礎上，本研究進一步考察限制5-氨基乙酰丙酸合成的因素，主要策略包括強化α-酮戊二酸合成、弱化α-酮戊二酸降解、動態(tài)調控血紅素的生成、增強5-氨基乙酰丙酸輸出等，為提升5-氨基乙酰丙酸的合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

KH2PO4等無機鹽，國藥集團試劑有限公司；基因組DNA純化試劑盒、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、QuickCut限制酶、RNAiso Plus、Titanium一步法RT-PCR試劑盒等，寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；ClonExpress?Ⅱ One-Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司。

Ultimate 3000型高效液相色譜儀，美國ThermoFisher Scientific公司；PD-10脫鹽濾柱，英國GE Healthcare公司。

1.2 菌株與質粒

本研究所用的菌株和質粒如表1所示。大腸桿菌EscherichiacoliDH5α用于重組質粒的構建，E.coliW3110用于rhtA基因的擴增。

表1 本研究所用菌株和質粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.3 引物

本研究所用引物及其序列如表2所示。

1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7.0～7.5。

BHIS培養(yǎng)基(g/L)：BHI 37，山梨醇91，pH 7.0～7.5。

種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入終質量濃度為0.5 g/L的葡萄糖，pH 7.0～7.5。

改良CGXⅡ培養(yǎng)基：CGXⅡ培養(yǎng)基中加入終質量濃度為3 g/L的酵母粉，pH 7.0～7.5。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.5 質粒及菌株的構建

以大腸桿菌E.coliW3110基因組DNA為模板，利用引物rhtA-1/rhtA-2擴增rhtA基因，產(chǎn)物經(jīng)電泳并純化后利用ClonExpress?Ⅱ One-Step Cloning Kit連接至經(jīng)線性化的pEC-XK99E質粒(經(jīng)限制性內切酶SacI酶切、電泳、回收并純化)，轉化至E.coliDH5α[20-21]。挑取陽性菌落并提取重組質粒，分別利用EcoR I及EcoR I/Hind Ⅲ進行單、雙酶切驗證，以pEC-XK99E質粒為對照，將驗證正確的質粒命名為pEC-XK99E-rhtA。將pEC-XK-99E-rhtA電轉化至AL9，挑取陽性菌落進行菌落聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)，將驗證正確的重組菌株命名為AL10。采用同樣方法構建pEC-XK-99E-thrE和AL11。

采用同源重組的方法進行基因的基因組整合或啟動子替換。以整合Ptuf-rhtA為例，利用引物cg2973-1/cg2973-2、cg2973-7/cg2973-8、cg2973-3/cg2973-4及cg2973-5/cg2973-6擴增cg2973上下游同源臂、Ptuf及rhtA，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳并純化后利用ClonExpress?Ⅱ One-Step Cloning Kit連接至經(jīng)線性化的自殺質粒pK18mobsacB(經(jīng)限制性內切酶XbaI酶切、電泳、回收并純化)，轉化至E.coliDH5α經(jīng)驗證后獲得pK18mobsacBcg2973∶∶Ptuf-rhtA。將pK18mobsacBcg2973∶∶Ptuf-rhtA電轉化至AL9[20-21]，挑取陽性菌落利用引物cg2973-9/cg2973-10進行菌落PCR(以AL9為對照)，將驗證正確的重組菌株命名為AL12。

1.6 實時定量PCR

收集發(fā)酵液，用RNAiso Plus提取總RNA并利用Titanium一步法RT-PCR試劑盒進行實時定量PCR檢測，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法[22]。

1.7 α-酮戊二酸脫氫酶活性測定

收集發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min(4 ℃)離心10 min后收集細胞，用N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺鈉溶液(100 mmol/L，pH 7.0)洗滌3次后重懸。上述細胞重懸超聲破碎20 min后經(jīng)12 000 r/min(4 ℃)離心30 min，上清液經(jīng)脫鹽濾柱過濾。取100 μL濾液至含100 mmol/LN-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺鈉、5 mmol/L MgCl2、3 mmol/L半胱氨酸、3 mmol/L焦磷酸硫胺、0.2 mmol/L乙酰輔酶A及1 mmol/L NAD+的1 mL體系中，定時測定OD340值[23]。

1.8 發(fā)酵實驗

將菌株于BHIS液體培養(yǎng)基活化后，以15%(體積分數(shù))接種量接種至種子培養(yǎng)基，于32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)8～10 h，至OD600=10～12。將種子培養(yǎng)物以15%(體積分數(shù))接種量接種至含40 mL改良CGXⅡ培養(yǎng)基中，于32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵期間補加800 g/L葡萄糖，補加氨水使pH維持在7.0～7.5。上述培養(yǎng)中均含15 mg/L氯霉素。利用AL10和AL11發(fā)酵時，還需添加20 mg/L卡那霉素，發(fā)酵至8 h時添加終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylvbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)。

1.9 檢測與分析方法

菌體生物量以OD600值計，吸取1 mL發(fā)酵液適當稀釋后利用分光光度計測定。用分光光度法測定5-氨基乙酰丙酸濃度，吸取1 mL發(fā)酵液于溫室條件下經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清液，再次離心后適當稀釋備用。配制1 mL反應體系，其中含上述上清液、0.25 mL乙酰丙酮以及0.5 mL的乙酸鈉緩沖液(1 mol/L，pH 4.6)，于沸水中水浴15 min后冷卻至室溫。取1 mL上述反應液與等體積二甲氨基苯甲醛混合，30 min后測定554 nm處吸光度[24]。取1 mL發(fā)酵液的上清液與等體積二甲氨基苯甲醛混合，30 min后測定555 nm處吸光度以測定膽色素原濃度[25]。用熒光法測定血紅素濃度，取1 mL發(fā)酵液的上清液與等體積草酸溶液(2 mol/L)混合，測定662 nm處吸光度，激發(fā)光波長為400 nm[26]。

2 結果與分析

2.1 過表達icd基因對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

在三羧酸循環(huán)中，關鍵酶異檸檬酸脫氫酶(由icd基因編碼)催化異檸檬酸合成α-酮戊二酸，同時生成NADPH，二者均為5-氨基乙酰丙酸合成所需[27]。在出發(fā)菌株AL6中，已表達檸檬酸合酶編碼基因gltA，故推測在此基礎上表達icd基因可進一步將代謝流引向α-酮戊二酸，同時提高NADPH的供應，從而有利于5-氨基乙酰丙酸的合成。為考察表達icd基因對菌株合成5-氨基乙酰丙酸的影響，將icd基因的啟動子替換為強啟動子Ptuf。將pK18-Picd∶∶Ptuf轉化至AL6，經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖2所示，從AL6和重組菌中獲得堿基數(shù)約為1 200、1 600 bp的片段，分別與Picd替換前后堿基數(shù)一致(分別為1 179、1 621 bp)。表明啟動子替換成功，將其命名為AL7。

搖瓶發(fā)酵實驗考察AL7的特性，結果如圖3-a所示。AL7較出發(fā)菌株AL6的生物量略有提高，其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量達到1.36 g/L，較AL6提高18.3%。該結果表明過表達icd基因可增強三羧酸循環(huán)代謝流從而為5-氨基乙酰丙酸的合成提供更多的α-酮戊二酸。

M-Marker;1-AL6菌落PCR;2-第1次重組菌株菌落PCR;3-AL7菌落PCR圖2 AL7菌落PCR鑒定圖譜Fig.2 Map for PCR identification of AL7

2.2 弱化α-酮戊二酸脫氫酶活性對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

過表達icd基因后AL7的生物量較AL6高，表明增加的α-酮戊二酸除用于5-氨基乙酰丙酸合成外還用于生長。α-酮戊二酸可分別由谷氨酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶催化生成L-谷氨酸和琥珀酰CoA，其中L-谷氨酸是合成5-氨基乙酰丙酸的前體物。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸脫氫酶對α-酮戊二酸的米氏常數(shù)(Km=5.7 mmol/L)遠高于α-酮戊二酸脫氫酶(Km=0.02～0.13 mmol/L)，故α-酮戊二酸優(yōu)先用于琥珀酰CoA的合成[27]。因此，調節(jié)α-酮戊二酸節(jié)點代謝流的分配對5-氨基乙酰丙酸的合成至關重要。有報道表明，通過敲除α-酮戊二酸脫氫酶E1亞基編碼基因odhA失活α-酮戊二酸脫氫酶可以顯著抑制菌體生長[11]。近年來，隨著對谷氨酸棒桿菌系統(tǒng)生物學研究的不斷深入，已發(fā)現(xiàn)多種不同轉錄強度的啟動子。CHENG等[28]以綠色熒光蛋白編碼基因gfp為報告基因，測定了來源于谷氨酸棒狀桿菌的多個啟動子的轉錄強度，發(fā)現(xiàn)4-羥基-2,3,4,5-四氫二吡啶甲基酸還原酶基因dapB的啟動子為弱啟動子。

為減少α-酮戊二酸轉化為琥珀酰CoA的代謝流，擬將odhA基因啟動子PodhA替換為PdapB以期弱化其表達從而降低α-酮戊二酸脫氫酶活性。采用重疊PCR擴增PodhA同源臂片段，并連接至自殺質粒pK18mobsacB，獲得重組質粒pK18-PodhA∶∶PdapB。將pK18-PodhA∶∶PdapB轉化至AL7，經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖4所示，從AL7和重組菌中獲得堿基數(shù)約為1 400、1 600 bp的片段，分別與PodhA替換前后堿基數(shù)一致(分別為1 400、1 583 bp)。表明啟動子替換成功，將其命名為AL8。

搖瓶發(fā)酵實驗結果表明，與AL7相比，AL8生物量降低13.2%，但其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量提高41.2%，達到1.92 g/L(圖3-a)。酶活性實驗結果表明，AL8的α-酮戊二酸脫氫酶活性較AL7降低33.3%(圖3-b)。上述結果說明弱啟動子PdapB有效降低了odhA的轉錄致使α-酮戊二酸脫氫酶降低，從而使得一部分代謝流由生長轉移至5-氨基乙酰丙酸的合成。

2.3 弱化5-氨基乙酰丙酸脫水酶編碼基因hemB減少副產(chǎn)物生成

5-氨基乙酰丙酸可經(jīng)5-氨基乙酰丙酸脫水酶催化生成膽色素原，后者經(jīng)數(shù)步反應生成血紅素。在AL8發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液顏色逐漸變紅，暗示有血紅素生成。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中膽色素原和血紅素質量濃度分別達到12.35、5.31 mg/L。由于血紅素是菌體生長必需物質，故不能通過敲除hemB等基因阻斷膽色素原和血紅素的合成。ZHANG等[17]通過將hemB自身核糖體結合位點序列替換為翻譯強度較弱的核糖體結合位點以弱化5-氨基乙酰丙酸向膽色素原的代謝，使得5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量提高18.5%。YU等[16]在5-氨基乙酰丙酸脫水酶C端加入SsrA標簽以動態(tài)降解該酶，使得膽色素原濃度降低約40%。在前期研究中發(fā)現(xiàn)來源于谷氨酸棒桿菌的乙醛脫氫酶啟動子(PCP_2836)屬于生長依賴型啟動子，其轉錄強度在對數(shù)中后期顯著下降[29]。故將hemB基因的啟動子替換為PCP_2836以期動態(tài)調控hemB轉錄，提高5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量并降低膽色素原和血紅素的積累。

采用重疊PCR擴增PCP_2836同源臂同源片段，并連接至自殺質粒pK18mobsacB，獲得重組質粒pK18-PhemB∶∶PCP_2836。將pK18-PhemB∶∶PCP_2836轉化至AL8，經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖5所示，從AL8和重組菌中獲得堿基數(shù)約為1 200、1 500 bp的片段，分別與PhemB替換前后堿基數(shù)一致(分別為1 168、1 427 bp)。表明啟動子替換成功，將其命名為AL9。

M-Marker;1-AL8菌落PCR;2-第1次重組菌株菌落PCR;3-AL9菌落PCR圖5 AL9菌落PCR鑒定圖譜Fig.5 Map for PCR identification of AL9

與AL8相比，AL9生物量未見顯著變化，其5-氨基乙酰丙酸的產(chǎn)量提高12.0%，達到2.15 g/L(圖6-a)。發(fā)酵液中膽色素原和血紅素質量濃度分別達到1.69、0.24 mg/L，較AL8降低86.3%和95.5%(圖6-b)。實時定量PCR結果表明，hemB的轉錄水平在發(fā)酵16 h后逐漸降低(圖6-c)。上述結果表明，利用PCP_2836實現(xiàn)了對hemB基因轉錄的動態(tài)調控，從而弱化了5-氨基乙酰丙酸向血紅素的代謝流，進而提高其產(chǎn)量。

2.4 增強輸出對5-氨基乙酰丙酸合成的影響

研究表明來源于大腸桿菌的蘇氨酸輸出蛋白(由rhtA編碼)能夠識別5-氨基乙酰丙酸，并將其輸出至胞外[8]。谷氨酸棒桿菌亦含有蘇氨酸輸出蛋白(由thrE編碼)[30]。為考察蘇氨酸輸出蛋白對5-氨基乙酰丙酸合成的影響，擴增rhtA和thrE基因并分別連接至表達質粒pEC-XK99E，獲得pEC-XK99E-rhtA和pEC-XK99E-thrE。將二者分別轉化至大腸桿菌E.coliDH5α，經(jīng)篩選后挑取單菌落并提取質粒進行酶切驗證。如圖7-a所示，經(jīng)單酶切的pEC-XK99E-rhtA堿基數(shù)約為8 000 bp，與pEC-XK99E和rhtA堿基數(shù)之和一致(分別為7 018、888 bp)；該質粒經(jīng)雙酶切分別獲得堿基數(shù)約為7 000、900 bp的片段，表明pEC-XK99E-rhtA構建成功。同理證明pEC-XK99E-thrE構建成功(圖7-b)。分別將質粒pEC-XK99E-rhtA和pEC-XK99E-thrE轉化至AL9，獲得菌株AL10和AL11。搖瓶實驗結果表明，AL10和AL11的5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量分別達到2.51、2.32 g/L，較AL9提高16.7%和7.9%(圖8)，說明過表達蘇氨酸輸出蛋白有利于5-氨基乙酰丙酸的輸出，且rhtA效果優(yōu)于thrE。

a-菌株5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量及生物量;b-副產(chǎn)物質量濃度;c-AL9中hemB相對轉錄強度圖6 菌株AL8和AL9發(fā)酵特性Fig.6 Characteristics of AL8 and AL9

a-AL10和pEC-XK99E-rhtA鑒定圖譜(M-Marker;1-AL10菌落PCR;2-pEC-XK99E經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;3-pEC-XK99E-rhtA經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;4-pEC-XK99E-rhtA經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切) b-AL11和pEC-XK99E-thrE鑒定圖譜(M-Marker;1-AL11菌落PCR;2-pEC-XK99E經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;3-pEC-XK99E-thrE經(jīng)EcoR Ⅰ單酶切;4-pEC-XK99E-thrE經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切) c-AL12鑒定圖譜(M-Marker;1-AL9菌落PCR;2-第1次重組菌株菌落PCR;3-AL12菌落PCR) 圖7 AL10、AL11和A12鑒定圖譜Fig.7 Map for PCR identification of AL10, AL11, and AL12

由圖8可知，AL10和AL11的生物量分別較AL9降低12.2%和15.9%，推測可能是質粒增加了菌株的代謝負擔。由于過表達rhtA基因的效果優(yōu)于thrE，故采用基因組整合的方式過表達該rhtA基因，以期減小菌體代謝負擔。利用重疊PCR擴增cg2973同源臂片段及強啟動子Ptuf，并連接至自殺質粒pK18mobsacB，獲得重組質粒pK18-cg2973∶∶Ptuf-rhtA。將pK18-cg2973∶∶Ptuf-rhtA轉化至AL9，經(jīng)兩輪重組、篩選后挑取單菌落進行菌落PCR驗證。結果如圖7-c 所示，從AL9和重組菌中分別獲得堿基數(shù)約為1 100、2 000 bp的片段，與Ptuf-rhtA整合前后堿基數(shù)一致(分別為1 169、2 067 bp)。表明Ptuf-rhtA整合成功，將其命名為AL12。AL12的發(fā)酵特性如圖8所示，其生物量明顯高于AL10，與AL9無顯著差異；其5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到2.69 g/L，分別比AL9、AL10和AL11高21.5%、7.2%和15.9%。綜上所述，采用基因組整合的方式對菌株代謝壓力較小，優(yōu)于質粒過表達的方式。

圖8 AL10、AL11和A12的發(fā)酵特性Fig.8 Characteristics of AL10, AL11， and AL12

3 結論

本研究首先通過表達icd基因強化α-酮戊二酸的合成并利用弱啟動子下調odhA基因轉錄進而弱化α-酮戊二酸脫氫酶活性，為5-氨基乙酰丙酸的合成提供了前體物。然后利用生長依賴型啟動子動態(tài)調控hemB轉錄，降低了5-氨基乙酰丙酸向血紅素的代謝流。在此基礎上證明谷氨酸棒桿菌蘇氨酸輸出蛋白ThrE具有輸出5-氨基乙酰丙酸的功能，大腸桿菌蘇氨酸輸出蛋白RhtA效果更佳；采用基因組整合過表達rhtA的方式效果更好。獲得的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵，其5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量達到2.69 g/L，與已報道的谷氨酸棒桿菌C5途徑合成5-氨基乙酰丙酸產(chǎn)量接近。本研究證明調控α-酮戊二酸脫氫酶和5-氨基乙酰丙酸脫水酶是高效合成5-氨基乙酰丙酸的關鍵，故在后續(xù)研究中，擬進一步探索對其精準調控的策略(如利用感受胞內代謝物的啟動子、群體感應系統(tǒng)等)。此外，NADPH供應也是合成5-氨基乙酰丙酸的瓶頸，后續(xù)擬利用輔因子工程等策略提高其供應，以期進一步提高其合成效率。