小反芻獸疫病毒反向遺傳學(xué)研究進(jìn)展

王 煜，孫 淼，陳延飛，劉偉潔，薛青紅

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 100081)

小反芻獸疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起山羊、綿羊等小反芻獸的一種急性、熱性、接觸性傳染病，是OIE法定報告的動物傳染病，我國規(guī)定為Ⅰ類動物疫病[1]。據(jù)FAO推測，全球約有62.5%的小反芻動物受到小反芻獸疫的威脅，特別是非洲、亞洲和中東地區(qū)。2007年7月我國西藏地區(qū)首次發(fā)生疫情，2013年11月新疆地區(qū)再次發(fā)生，隨后疫情遍布全國大多數(shù)省份。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球每年因PPR導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)約30億美元，目前主要采用疫苗免疫接種對PPR進(jìn)行預(yù)防，2015年OIE、FAO聯(lián)合啟動了《全球小反芻獸疫控制與根除策略》,提出了到2030年在全球消滅PPR的目標(biāo)[2]。

1 小反芻獸疫病毒概述及復(fù)制特征

小反芻獸疫病毒屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)，同屬成員還包括麻疹病毒(Measles virus， MV)、牛瘟病毒(Rinderpest virus, RPV)、犬瘟熱病毒(Canine Distemper virus，CDV)、海豹瘟熱病毒(Phocine distemper virus,PDV)、鯨麻疹病毒(Cetacean morbillivirus,CMV)、海豚麻疹病毒(Dolphin morbillivirus,DMV)[3-4]。通過基因序列比對，可將PPRV分為四個基因型，但PPRV只發(fā)現(xiàn)一個血清型，其中基因I、II、III型主要流行于非洲，而我國小反芻獸疫流行毒株屬于基因Ⅳ型。PPRV是單股負(fù)鏈不分節(jié)段有囊膜的RNA病毒，絕大多數(shù)PPRV的核苷酸總數(shù)為15948 nt，RNA鏈從3’至5’依次分布著N-P-M-F-H-L 6個基因，共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白(Nucleoprotein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(Matrixprotein，M)、融合蛋白(Fusion protein，F(xiàn))、血凝素蛋白(Hemagglutinin protein，H)、大蛋白(Large protein，L)，此外PPRV P 基因有兩個重疊的開放性閱讀框(ORF)可編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白P和非結(jié)構(gòu)蛋白C、V蛋白[5]。

PPRV復(fù)制過程中其病毒粒子中單鏈核糖核苷酸(ssRNA)不能直接用作轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的模板，只有當(dāng)基因組ssRNA與核蛋白結(jié)合形成核衣殼復(fù)合物(RNPs)以后，才能被RNA依賴的RNA聚合酶識別并作為轉(zhuǎn)錄的模板轉(zhuǎn)錄成正鏈RNA，以此作為mRNA翻譯PPRV復(fù)制所需蛋白，與此同時，以正鏈RNA為模板生成負(fù)鏈的病毒基因組RNA。

與麻疹病毒屬其它成員一樣，PPRV基因組也遵循“六堿基原則”，即病毒基因組長度為6的倍數(shù)。但有研究表明，在微突變的PPRV微型基因組中插入或敲除一到兩個核苷酸，PPRV也能正常復(fù)制[6]，PPRV的這一獨(dú)特特征有別于其它嚴(yán)格遵守“六堿基原則”的麻疹病毒。

2 反向遺傳學(xué)概述及研究進(jìn)展

廣義的反向遺傳學(xué)指從生物基因組及所含生物信息出發(fā)，在獲得生物基因信息的基礎(chǔ)上，通過對基因的操作，如定點(diǎn)突變、插入、缺失、置換等，進(jìn)行生物基因結(jié)構(gòu)和功能的研究。目前，反向遺傳技術(shù)已經(jīng)成為推動植物學(xué)、動物學(xué)、微生物學(xué)研究發(fā)展的最前沿科學(xué)之一。

狹隘的反向遺傳學(xué)是指對微生物的反向遺傳操作和研究，目前已有很多病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)被建立起來，用以研究病毒的生命周期，了解病毒復(fù)制過程中的機(jī)制，創(chuàng)新了新型疫苗的研究手段，開創(chuàng)了病毒學(xué)研究的新局面。

由于基因組結(jié)構(gòu)相對簡單，反向遺傳學(xué)在RNA病毒的研究中應(yīng)用最為廣泛，其核心是建立病毒的感染性克隆，即病毒的人工構(gòu)建。了解病毒的基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)調(diào)控模式是開展RNA病毒反向遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)[7]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，這項技術(shù)隨后也應(yīng)用于DNA病毒的研究，病毒DNA可以直接進(jìn)入細(xì)胞合成感染性病毒粒子。1976年研究人員通過在體外轉(zhuǎn)染突變過的猴空泡病毒40 (Simian vacuolating virus 40 or Simian virus 40，SV40)DNA實現(xiàn)了“體外拯救”[8]。1978年，科學(xué)家們將QB噬菌體全長cDNA克隆到載體上并轉(zhuǎn)染大腸桿菌，成功拯救出具有感染性的子代噬菌體[9]。這一突破性進(jìn)展為其他RNA病毒的反向遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。1981年，脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus，PV)感染性克隆的成功構(gòu)建拉開了動物RNA病毒反向遺傳學(xué)研究的序幕[10]。

相對于DNA病毒和正鏈RNA病毒，負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳學(xué)研究比較滯后。由于其基因組RNA不是復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的模板，必須與核衣殼蛋白、RNA依賴性RNA聚合酶等形成核糖核蛋白復(fù)合物(RNPs)，才能進(jìn)行正常的復(fù)制，完成病毒粒子的包裝，而這在體外是難以實現(xiàn)的。除此之外，構(gòu)建負(fù)鏈RNA病毒的全長cDNA必須明確基因組末端序列。綜上所述，體外拯救具有感染性的負(fù)鏈RNA病毒存在一定難度[11-12]。直到1989年，Luytjes W等成功拯救出一種嵌合的流感病毒，打開了負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳學(xué)研究的大門[13]。

3 PPRV反向遺傳學(xué)研究進(jìn)展

關(guān)于MV、RPA、CDV的反向遺傳操作系統(tǒng)的研究早已見諸報道[14-16]，而PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)的建立則相對較晚。2007年Bailey D等人[17]構(gòu)建了小反芻獸疫病毒微型基因組系統(tǒng)，這一體系證實了PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)的可行性，并且證明了PPRV不像其他副粘病毒一樣嚴(yán)格遵守“六堿基原則” 。微型基因組一般保留病毒的順式作用元件和調(diào)控區(qū)(一般為病毒基因組兩端非編碼區(qū))，多使用GFP、CAT、X-gal等報告基因代替中間編碼區(qū)，而且都是將報告基因反向連入啟動子下游，以避免非特異性表達(dá)。PPRV體外拯救基本元件包括反基因組轉(zhuǎn)錄全長cDNA載體以及三個反式作用輔助病毒蛋白：核衣殼N，磷蛋白P和大蛋白L。Yununs等人建立了PPRV體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在體外持續(xù)地轉(zhuǎn)錄出病毒所有蛋白的mRNA，并表現(xiàn)出梯度轉(zhuǎn)錄特性，與病毒自然感染細(xì)胞的情況相似[18]。翟軍軍[19]構(gòu)建了PPRV全長cDNA克隆，進(jìn)行了PPRV DNA疫苗的研發(fā)和免疫學(xué)研究。直到2012年，Hu等人[20]通過RNA聚合酶II啟動子驅(qū)動病毒全長基因組轉(zhuǎn)錄的方式，第一次成功地從PPRV全長cDNA克隆中拯救出了能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的重組病毒，其體外復(fù)制能力與親本病毒相當(dāng)。2015年Muniraju M等人[21]也成功拯救出PPRV，該拯救系統(tǒng)采用人工合成的質(zhì)粒，包含全長PPRV反基因組序列和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因序列。該研究通過插入EGFP基因獲得了陽性標(biāo)記的重組病毒，通過突變H基因上C77位點(diǎn)獲得了陰性標(biāo)記的重組病毒，為PPRV鑒別感染和免疫(DIVA)標(biāo)記疫苗的研發(fā)提供了新的思路和方法。在上述兩個成功拯救PPRV的系統(tǒng)中，親本毒均為PPRV Nigeria 75/1 疫苗株，被拯救的重組PPRV病毒與親本毒在Vero細(xì)胞上的生長曲線沒有明顯差別且產(chǎn)生相同的細(xì)胞病變(CPE)。Hu等人重組rPPRV-GFP病毒通過病毒中和試驗(VNT)可以更快速、更高通量地檢測PPRV中和抗體效價。Muniraju M等用重組病毒候選疫苗(rPPRV-C77)與親本毒疫苗同時免疫山羊，都對致死劑量的PPRV攻擊提供了完全保護(hù)。2019年Liu F等人[22]也建立了PPRV反向遺傳系統(tǒng)，拯救的PPRV能在體外高效表達(dá)EGFP。研究通過檢測表達(dá)EGFP的細(xì)胞比例，比較了BHK21、F81、MDBK、RK13、MDCK、PK15、Vero和GT等8個哺乳動物細(xì)胞系對拯救病毒的易感性，最終確定Vero最易感，PK15最不易感。

研究者根據(jù)副粘病毒基因組遺傳穩(wěn)定的特點(diǎn)，常利用反向遺傳技術(shù)制備重組副粘病毒載體疫苗和DIVA疫苗，已成為當(dāng)今疫苗研發(fā)的重要方向。胡倩倩等人[23]構(gòu)建了能夠表達(dá)藍(lán)舌病毒VP5和VP7蛋白的重組PPRV，接種山羊可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對BTV和PPRV的抗體。Yin C等人[24]構(gòu)建了能夠表達(dá)口蹄疫病毒VP1蛋白的重組PPRV(rPPRV/VP1)，rPPRV/VP1接種山羊后對口蹄疫病毒的攻擊產(chǎn)生明顯的保護(hù)，結(jié)果表明rPPRV/VP1可作為PPRV和FMDV活載體疫苗的候選株。雖然已有成功建立的PPRV反向遺傳系統(tǒng)，但至今未有公開報道拯救出的PPRV應(yīng)用在PPR的防控和疫病的根除。

4 PPRV拯救策略

4.1 副粘病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的分類 目前，副粘病毒反向遺傳操作系統(tǒng)主要分為兩種：一種是基于T7 RNA聚合酶建立的反向遺傳操作系統(tǒng)，另一種是基于RNA聚合酶II建立的反向遺傳操作系統(tǒng)。兩個操作系統(tǒng)的建立都必須以轉(zhuǎn)錄出精確的全長序列為基礎(chǔ)。研究表明，負(fù)鏈RNA病毒在體外進(jìn)行拯救的過程中，病毒基因組前導(dǎo)序列和尾部序列的突變會影響RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，兩端的非編碼區(qū)在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中起著關(guān)鍵性作用。研究人員構(gòu)建副粘病毒基因組全長cDNA克隆時，為避免外來核苷酸在體外轉(zhuǎn)錄過程中插入RNA模板的5’端和3’端，會在兩端引入具有自我剪切功能的核酶序列。比如在病毒序列5’端和3’端分別引入丁肝核酶(HDVRZ)和錘頭狀核酶(HHRZ)，兩種核酶轉(zhuǎn)錄完成后，可分別在5’首端堿基之前和3’末端堿基之后發(fā)生特異性剪切，從而得到完整且準(zhǔn)確的基因組末端序列[25-26]，此方法在拯救負(fù)鏈RNA病毒中應(yīng)用較為廣泛。

T7 RNA聚合酶是一種依賴DNA的RNA聚合酶，其對噬菌體T7啟動子序列具有高特異性，能夠特異性地轉(zhuǎn)錄位于T7啟動子下游的的DNA。在副黏病毒的反向遺傳學(xué)研究中，通常在病毒基因組cDNA的5’端插入T7啟動子，這就要求宿主細(xì)胞提供T7 RNA聚合酶以配合轉(zhuǎn)染質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。因此需要篩選出能穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的特定細(xì)胞系，或者利用重組的T7 RNA聚合酶痘苗病毒提前感染宿主細(xì)胞獲得外源性T7 RNA聚合酶。以上策略操作復(fù)雜且轉(zhuǎn)染細(xì)胞易受干擾，尤其對拯救具有嚴(yán)格細(xì)胞適應(yīng)性的病毒而言影響更大。

為了解決上述問題，研究人員開發(fā)了一個基于人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的系統(tǒng)，即在病毒基因組cDNA的5’端插入CMV啟動子代替T7啟動子，利用真核細(xì)胞自身表達(dá)的RNA聚合酶II直接識別CMV啟動子。CMV系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是避免產(chǎn)生由于引入外源性T7 RNA聚合酶而引起宿主細(xì)胞發(fā)生CPE，或由于增加了共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的數(shù)量而降低系統(tǒng)性能的問題。由于RNA聚合酶II位于細(xì)胞核的核質(zhì)內(nèi)，最初認(rèn)為驅(qū)動CMV啟動子的RNA聚合酶II系統(tǒng)用于拯救核復(fù)制病毒效果會更好。而后研究表明CMV系統(tǒng)也可用于拯救其他非核復(fù)制病毒，如2011年Li等人將NDV的I系苗Mukteswar毒株全長序列分別置于T7啟動子和CMV啟動子后，都獲得了具有感染性的病毒粒子，并且采用CMV啟動子拯救系統(tǒng)的拯救效率顯著高于前者[27]。至于采用T7啟動子還是CMV啟動子主要取決于實驗室現(xiàn)有的條件，目前市場已有成熟穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的細(xì)胞系，在極大提高病毒拯救效率的同時也避免了由于引入外源T7 RNA聚合酶輔助拯救病毒而引起的CPE的難題。

4.2 參考NDV的拯救策略 在傳統(tǒng)的副粘病毒反向遺傳學(xué)研究中，病毒拯救依賴于將含有病毒基因組全長序列的質(zhì)粒分別與三個含有N、P和L基因獨(dú)立克隆的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞。

下面將從副粘病毒科NDV反向遺傳學(xué)最新研究進(jìn)展中分析可能用于拯救PPRV的策略，有望促進(jìn)PPRV反向遺傳技術(shù)的發(fā)展。2008年Gao等人[28]在基于RNA聚合酶I系統(tǒng)之上，將NDV弱毒株B1株三個外部基因和三個內(nèi)部基因克隆到帶有T7啟動子的轉(zhuǎn)錄載體上，然后將兩個含有全長序列的轉(zhuǎn)錄載體和三個輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，拯救出的重組NDV生長特性與親本毒一致。副粘病毒基因組大小為15～16kb，構(gòu)建全長cDNA克隆時容易發(fā)生突變，如果能將全長基因組分節(jié)段克隆到兩個質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄將提高病毒拯救效率。Gao等人[28]的研究為PPRV拯救提供了一條新思路。2020年Wang N等人[29]建立了一種簡單可靠的NDV反向遺傳操作系統(tǒng)，研究構(gòu)建的一個NDV基因組全長質(zhì)粒采用T7啟動子驅(qū)動，其他三個輔助質(zhì)粒系統(tǒng)采用CMV啟動子驅(qū)動，同時構(gòu)建了一個不使用輔助病毒就能夠增強(qiáng)表達(dá)T7 RNA聚合酶的質(zhì)粒，通過五個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染成功拯救出重組NDV病毒。

2017年Liu等人[30]開展了雙質(zhì)粒拯救系統(tǒng)的研究，雙質(zhì)粒系統(tǒng)是一種新方法，其創(chuàng)新點(diǎn)在于構(gòu)建了一個輔助質(zhì)粒，其中包含了可編碼三個病毒復(fù)制所需蛋白(N、P和L)的翻譯盒，每個翻譯盒都有一個合適的啟動子(T7或CMV)和終止子(T7T或Poly-A tail)，根據(jù)拯救策略的不同，可選擇性地使用或不使用外源性T7 RNA聚合酶。另外，研究人員還構(gòu)建了病毒全長反基因組的質(zhì)粒，將其與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，拯救出感染性病毒。與傳統(tǒng)的四質(zhì)粒系統(tǒng)相比，雙質(zhì)粒系統(tǒng)具有更高的拯救效率，并且適用于四質(zhì)粒系統(tǒng)無法拯救的病毒[30-31]。

除了以上多質(zhì)粒拯救系統(tǒng)外，還有基于單質(zhì)粒的拯救系統(tǒng)。單股負(fù)鏈RNA病毒的反向遺傳操作系統(tǒng)的建立依賴于含有病毒基因組全長cDNA的質(zhì)粒和含有病毒復(fù)制相關(guān)基因的輔助質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。Peeters B[32]提出了一種新的拯救策略，即利用單個質(zhì)粒拯救NDV，無需使用輔助質(zhì)粒。這種方法是將T7或CMV啟動子序列插入或替換病毒復(fù)制基因的亞基因組RNA的非編碼區(qū)，位置的選擇應(yīng)確保編碼病毒復(fù)制必要蛋白的亞基因組RNA轉(zhuǎn)錄，從而形成RNPs復(fù)合物，同時還要避免干擾病毒基因組中增強(qiáng)下游基因表達(dá)的基本元件。由于病毒復(fù)制策略的相似性，單質(zhì)粒系統(tǒng)理論上也可適用于大多數(shù)非節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒。

目前，對已經(jīng)拯救出的PPRV反向遺傳系統(tǒng)進(jìn)行分析，科研人員均采用四質(zhì)粒拯救體系，其中Hu等人采用CMV啟動子對病毒進(jìn)行拯救，直接將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PPRV易感細(xì)胞中，完成病毒組裝釋放；而Muniraju M和Liu F等人則采用T7啟動子對病毒進(jìn)行拯救，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到改造過帶有T7聚合酶的真核細(xì)胞系中，完成病毒的組裝。PPRV反向遺傳技術(shù)的應(yīng)用大多集中在將一段外源基因插入PPRV基因組中，做成基因聯(lián)苗。由于PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)尚不成熟，病毒拯救困難。因此，建立穩(wěn)定可靠的PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)對研究其致病機(jī)制十分重要。

5 展 望

通過反向遺傳操作技術(shù)，將病毒RNA轉(zhuǎn)換為DNA,在DNA分子水平上對病毒基因組進(jìn)行研究改造，可應(yīng)用于DIVA疫苗和抗病毒藥物的研發(fā)，具有廣闊的前景。未來基于PPRV的反向遺傳學(xué)平臺，一方面可以解析PPRV致病機(jī)理、免疫逃逸機(jī)制、病毒復(fù)制機(jī)制等病毒學(xué)問題；另一方面還可以開發(fā)更加安全、有效的新型疫苗，為臨床防治該病提供較好的理論基礎(chǔ)和技術(shù)平臺。