磁性納米材料在獸藥殘留檢測(cè)應(yīng)用中的研究進(jìn)展

陸彥蓉，楊婭林，殷曉陽(yáng)，李華明，彭大鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070)

近年，隨著科技水平的提升，納米粒子憑借其小尺寸、高比表面積和高反應(yīng)活性等性質(zhì)成為了獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，磁性納米粒子(Magnetic nanoparticles, MNPs)便是其中非常重要的一種，具有超順磁性和磁導(dǎo)向性的同時(shí)又具有超高的生物相容性。MNPs與免疫技術(shù)、分子印跡技術(shù)及傳感器技術(shù)等結(jié)合，或用作固定生物分子的載體，或用作信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和增強(qiáng)的電活性、光學(xué)標(biāo)記，在生物醫(yī)學(xué)、食品安全以及農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)等研究領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的潛力和商業(yè)前景。

1 磁性納米材料的概述

磁性納米材料主要包括粒徑小于100 nm的金屬(鐵、鎳、鈷)及其氧化物和合金等，鐵礦物或磁性鐵氧化物較鎳、鈷毒性低，為了保護(hù)人們的健康以及生態(tài)環(huán)境，目前更常用鐵礦物或磁性鐵氧化物制備MNPs。其中，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子磁學(xué)和化學(xué)性能突出，是各研究領(lǐng)域首選的磁性材料之一，目前其合成方法主要有共沉淀法、溶劑熱法、熱分解法以及微乳液法等，但是這些合成方法都存在各自的缺點(diǎn)。化學(xué)共沉淀法易使金屬離子不均勻沉淀，原料團(tuán)聚，制備分布間距較小的MNPs反應(yīng)條件極嚴(yán)格。溶劑熱法存在耗時(shí)長(zhǎng)，條件相對(duì)苛刻且產(chǎn)量有限等缺點(diǎn)[1]，熱分解法制備的MNPs親水性弱，生物相容性較差，試劑消耗種類多，成本較高[2]。微乳液法產(chǎn)量低、有機(jī)試劑用量大，不適用于批量生產(chǎn)，剩余的表面活性劑可能會(huì)對(duì)MNPs的性質(zhì)產(chǎn)生影響[3]。

此外，MNPs因比表面積較大，表面能高以及磁偶極的相互作用等特點(diǎn)而易發(fā)生團(tuán)聚、氧化，導(dǎo)致其原有的性質(zhì)和性能發(fā)生改變。現(xiàn)有研究表明，在MNPs表面修飾上合適的功能基團(tuán)，對(duì)其性能進(jìn)行優(yōu)化，一定程度上可解決MNPs易氧化團(tuán)聚等問(wèn)題。

如表1所示，科研人員可以直接或者利用化學(xué)反應(yīng)將殼聚糖、淀粉、聚乙烯醇等高分子聚合物包裹在MNPs的表面，使其保持良好的生物相容性；或是利用活性炭、碳納米管、石墨烯等碳材料自身的性質(zhì)改善納米顆粒的團(tuán)聚現(xiàn)象，防止MNPs氧化腐蝕并提高其吸附性能；此外，還可通過(guò)溶膠-凝膠反應(yīng)將二氧化硅等無(wú)機(jī)氧化物包覆在MNPs表面，增強(qiáng)其耐酸性和分散性，充分發(fā)揮磁性納米材料的優(yōu)點(diǎn)。

表1 功能化磁性納米粒子的應(yīng)用

2 磁性納米材料在樣品前處理的應(yīng)用

2.1 磁固相萃取 磁固相萃取(magnetic solid phase extraction, MSPE)是一種利用磁性材料或可磁化的材料作為吸附劑進(jìn)行樣本前處理的一種新型方法(表2)。磁性吸附劑直接加入到含待測(cè)物的樣品溶液中將其吸附至表面，在外部磁場(chǎng)作用下，使吸附有待測(cè)物的磁性吸附劑與其他組分分離后再利用洗脫液洗脫下待測(cè)物，最后借助外部磁場(chǎng)分離吸附劑與洗脫組分。在復(fù)雜基質(zhì)的分離和凈化中，磁性材料是最理想的吸附材料之一。

表2 磁固相萃取在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

如表2所示，相對(duì)于與傳統(tǒng)的樣品前處理方法，MSPE可以簡(jiǎn)單高效地實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中痕量獸藥殘留的萃取，與高效液相檢測(cè)儀、膠體金試紙條等結(jié)合使用可對(duì)獸藥殘留實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測(cè)。Xin He等[9]將磁性石墨烯作為提取牛乳、雞肉以及雞蛋中氟喹諾酮類藥物的新型吸附劑，然后再結(jié)合高效液相色譜法檢測(cè)其殘留量，檢測(cè)限為0.05～0.3 μg/kg，加標(biāo)樣品的回收率為82.4～108.5%。這種提取方法顯示出對(duì)7種氟喹諾酮類藥物的高吸收能力(>6800納克)和高富集因子(68～79倍)。此外，這種吸收劑可以重復(fù)使用至少40次。結(jié)果表明，該方法具有高吸收容量、高回收率、高富集效果、高靈敏度、滿意的純化效果和良好的重復(fù)使用性。Kesheng Wu等[11]采用微乳液法合成了新型磺化聚苯乙烯磁性納米球，并用于預(yù)濃縮豬肉中的克倫特羅，與膠體金免疫層析測(cè)定法相結(jié)合檢測(cè)豬肉中的克倫特羅殘留，并通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜證實(shí)了其結(jié)果。此外，相較于克倫特羅傳統(tǒng)的樣品前處理方法，提取時(shí)間縮短了3倍。Jianme Wang等[14]利用選擇性加速溶劑萃取法對(duì)畜禽糞便樣品進(jìn)行初步純化后利用MSPE提高純化效果，在最佳條件下對(duì)樣品中的33種抗生素進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，加標(biāo)回收率為60.3%～110.0%，檢出限為0.2～3.5 μg/kg。此外，研究中還利用在30個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)所采集的畜禽糞便對(duì)新建立的方法進(jìn)行測(cè)試，并證實(shí)了其在實(shí)際樣品中的檢測(cè)獸藥殘留的可行性。

雖然目前已有商品化磁性吸附劑，但成本較高，另外MSPE發(fā)展時(shí)間較短，技術(shù)不夠成熟，萃取效果易受萃取、洗脫試劑的種類，反應(yīng)時(shí)間以及樣品溶液的體積、pH值等諸多因素的影響，萃取性能也會(huì)隨時(shí)間下降。

2.2 磁性分子印跡技術(shù) 磁性分子印跡技術(shù)將磁分離與分子印跡結(jié)合，首先使模板分子(目標(biāo)分子)、功能單體與交聯(lián)劑共同反應(yīng)，將功能基團(tuán)固定在聚合物的剛性結(jié)構(gòu)里，模板分子經(jīng)洗脫后形成具有可特異性識(shí)別目標(biāo)分子的固定孔穴結(jié)構(gòu)的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)，最后將其偶聯(lián)在磁性材料周?chē)?，便可制備出磁性分子印跡聚合物 (magnetic molecularly imprinted polymers, MMIPs)。

如表3所示，基于MIPs的磁性識(shí)別程序?yàn)閺姆浅?fù)雜的基質(zhì)和生物樣品中提取獸藥殘留物質(zhì)帶來(lái)了高靈敏度和高選擇性，MMIPs既保留了MIPs與目標(biāo)分子特異性高效偶聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又改善了MIPs較難與樣品基質(zhì)分離的問(wèn)題，簡(jiǎn)化了離心、過(guò)濾等操作。Yuxia Huang等[15]分別采用本體聚合法和溶膠-凝膠法制備了兩種MMIPs對(duì)牛奶中己烯雌酚進(jìn)行提取，并結(jié)合高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法的檢出限均為2.0 μg/L，回收率分別為88.3%～97.6%和90.5%～103.5%，MMIPs的吸附容量是磁性分子非印跡聚合物的1.78倍，具有較高的精密度和靈敏度，且前處理簡(jiǎn)單。Kunsa-Ngiem等[17]基于微波加熱誘導(dǎo)聚合和乙烯基功能化Fe3O4合成了新的MMIP，為提取雞飼料中氯霉素提供了一種新的方法，與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合檢測(cè)限可達(dá)0.12 μg/kg，與以往的研究相比，檢測(cè)限更低，樣品處理更簡(jiǎn)單，此外，MMIP可至少重復(fù)使用5次。因此，MMIP是一種很有前途的復(fù)雜動(dòng)物源性食品檢測(cè)方法。

表3 磁性分子印跡聚合物在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

但是目前磁性分子印跡技術(shù)也存在一些問(wèn)題，MMIPs的制備方法具有局限性，實(shí)際應(yīng)用中缺少合適的功能單體、交聯(lián)劑；合成分子印跡物時(shí)未能將模板洗脫干凈，在檢測(cè)低濃度甚至痕量待測(cè)物時(shí)存在模板泄露，引入較大誤差；相對(duì)于其他磁固相萃取吸附劑重復(fù)使用次數(shù)較少。

3 磁性納米材料在獸藥殘留檢測(cè)中的研究進(jìn)展

3.1 磁免疫層析試紙條 磁免疫層析技術(shù)是利用表面修飾有抗體的功能化MNPs作為標(biāo)記物，與含有相應(yīng)抗原的待測(cè)物特異性結(jié)合，通過(guò)肉眼觀察標(biāo)記物顏色，或在外加磁場(chǎng)條件下測(cè)定被富集的MNPs磁信號(hào)對(duì)待測(cè)物進(jìn)行殘留檢測(cè)的免疫分析方法。

閆靈芝[21]呋喃唑酮代謝物的衍生物為目標(biāo)分析物，以膠體金和磁性材料為標(biāo)記材料建立了兩種免疫層析試紙條，目測(cè)觀察的檢測(cè)限分別為1 μg/L和0.5 μg/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗體通過(guò)化學(xué)鍵與磁珠偶聯(lián)，較膠體金、乳膠顆粒等的物理吸附更穩(wěn)定，形成的免疫磁珠響應(yīng)性無(wú)明顯變化，分散性良好，標(biāo)記過(guò)程中可使用磁分離，較離心更加簡(jiǎn)便。此外，磁免疫層析試紙條的特異性良好，與其他類抗生素不存在交叉反應(yīng)，而且MNPs的使用提高了檢測(cè)的靈敏度。黃薇[23]對(duì)8種不同來(lái)源的MNPs進(jìn)行了性能對(duì)比，篩選出兩種可用于免疫層析試紙條的磁珠，并考察了不同鹽濃度以及pH對(duì)二者性能的影響，最后成功建立了檢測(cè)氯霉素的磁免疫層析試紙條，檢測(cè)限可達(dá)4 μg/L以下。相對(duì)于傳統(tǒng)膠體金試紙條的光學(xué)信號(hào)，磁信號(hào)可貫穿NC膜，不會(huì)受外界光反射、折射等干擾，生物樣品也幾乎不表現(xiàn)磁性，生物背景干擾小，因而磁免疫層析試紙條有更高的靈敏度，但是我國(guó)對(duì)于其的研究仍處于初步階段，如表4所示，有關(guān)獸藥殘留檢測(cè)的研究屈指可數(shù)，市場(chǎng)上也未有商品化的磁免疫層析試紙條。

表4 磁免疫層析在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

目前阻礙磁免疫層析試紙條發(fā)展的原因可能是磁珠合成方法不如膠體金簡(jiǎn)單、成熟，可用于免疫層析試紙條的商品化磁珠較少，價(jià)格昂貴；其次，磁珠偶聯(lián)抗體的方法較膠體金標(biāo)記抗體更為復(fù)雜嚴(yán)格；另外，磁信號(hào)檢測(cè)儀較昂貴、便攜式的小型檢測(cè)儀還未普及，不適用于一般的養(yǎng)殖戶。

3.2 磁生物傳感器 生物傳感器是指以酶、抗體、細(xì)胞等為代表的生物活性單元作為敏感原件去識(shí)別待測(cè)目標(biāo)物，將生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換成人們可以理解的光學(xué)、電化學(xué)、磁學(xué)等信號(hào)的分析工具或系統(tǒng)。

目前，磁性材料正朝著多功能材料的方向發(fā)展，可基于其超順磁性、大比表面積、酶活性以及磁/光/電特性等單獨(dú)或者同時(shí)參與生物傳感器的樣品富集和分離、信號(hào)讀出以及檢測(cè)信號(hào)放大等過(guò)程，在生物傳感器領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力。

磁性材料在生物傳感器中的應(yīng)用過(guò)去大多僅作為分離探針富集待測(cè)物，檢測(cè)結(jié)果時(shí)再更換成電化學(xué)或者熒光等其他信號(hào)分子，這樣的轉(zhuǎn)換會(huì)增加檢測(cè)步驟的復(fù)雜性，而近年磁生物傳感器逐漸將磁分離和磁信號(hào)的分析結(jié)合為一體，如表5所示，磁弛豫開(kāi)關(guān)生物傳感器(MRS)便是其中最經(jīng)典的例子之一。Yongzhen Dong等[24]以負(fù)載Gd3+的磁性納米粒子作為探針，通過(guò)整合磁分離和磁弛豫開(kāi)關(guān)開(kāi)發(fā)了一種多價(jià)磁性生物傳感器。作為一種過(guò)渡金屬離子，Gd3+在d軌道上有多個(gè)不成對(duì)的電子，可以感應(yīng)出一個(gè)強(qiáng)的波動(dòng)磁場(chǎng)，因此可以減少橫向弛豫時(shí)間(T2)產(chǎn)生一個(gè)強(qiáng)磁信號(hào)，能夠在0.1～100 ng/mL的線性范圍內(nèi)檢測(cè)萊克多巴胺，檢測(cè)限為20 pg/mL，與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比，靈敏度提高了25倍。Zhilong Wang等[25]報(bào)道了一種依賴于錳(ⅶ)/錳(ⅱ)相互轉(zhuǎn)換和橫向弛豫速率(R2)的低場(chǎng)核磁共振相應(yīng)變化的磁性免疫傳感器，能夠以高靈敏度檢測(cè)PBS和豬尿樣品中的萊克多巴胺，檢測(cè)限可達(dá)8.1 pg/mL。與使用其他順磁離子如鐵(ⅲ)/鐵(ⅱ)或銅(ⅱ)/銅(ⅰ)的磁傳感器相比，錳(ⅶ)沒(méi)有磁信號(hào)，而錳(ⅱ)具有強(qiáng)磁信號(hào)，基于錳(ⅶ)/錳(ⅱ)相互轉(zhuǎn)化的方法的不僅可以開(kāi)發(fā)具有高信號(hào)背景比的無(wú)背景磁性免疫傳感器，靈敏度也更高。這種錳介導(dǎo)的磁性免疫傳感器不僅保持了良好的穩(wěn)定性，而且大大提高了傳統(tǒng)順磁離子介導(dǎo)的磁性傳感器的靈敏度，為靈敏、穩(wěn)定和方便的生物分析提供了一個(gè)有前途的平臺(tái)。

表5 磁生物傳感器在獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

但是，待測(cè)物結(jié)合前后的粒徑、表面結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量、MNPs或待測(cè)物的濃度等對(duì)MRS的檢測(cè)結(jié)果都有較大的影響，在檢測(cè)獸藥殘留小分子時(shí)，獸藥小分子通常只有1個(gè)可以和抗體特異性結(jié)合的位點(diǎn)，磁信號(hào)變化微弱，導(dǎo)致傳統(tǒng)MRS靈敏度無(wú)法對(duì)小分子目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)痕量檢測(cè)。此外，這種電磁傳感技術(shù)目前也無(wú)法進(jìn)行高通量分析。

4 展 望

近年，隨著人們對(duì)納米材料興趣的加深，磁性納米材料與獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用也逐漸廣泛，但是目前主要應(yīng)用于樣品前處理，與免疫層析、傳感技術(shù)等結(jié)合作為信號(hào)探針使用的研究尚在初步階段，而且MNPs易團(tuán)聚、氧化，性質(zhì)不夠穩(wěn)定，商品化磁珠較少且價(jià)格昂貴，另外磁信號(hào)檢測(cè)儀的來(lái)源主要依賴進(jìn)口。針對(duì)以上問(wèn)題，未來(lái)的研究?jī)?nèi)容和方向可參考以下幾點(diǎn)：繼續(xù)改進(jìn)MNPs的合成和修飾方法，尋找平價(jià)原料或簡(jiǎn)化合成步驟，制備更加穩(wěn)定的功能化MNPs的同時(shí)降低成本；將MNPs與檢測(cè)技術(shù)更好的結(jié)合，一步實(shí)現(xiàn)樣品處理和目標(biāo)物分析；注重與其他交叉學(xué)科的融合，推動(dòng)檢測(cè)儀器的智能化和便攜化，共同促進(jìn)獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。