川續(xù)斷皂苷乙對(duì)氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)影響

王 斌，李思聰，梁 歌，李金良，張 敏，袁定勝，李旭廷

(動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066)

氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)FC)是畜禽專用的新型廣譜抗菌藥，本品通過抑制肽?；D(zhuǎn)移酶活性而產(chǎn)生廣譜抑菌作用，抗菌譜廣，包括各種革蘭氏陽性、陰性菌和支原體等[1]。本品口服吸收迅速，分布廣泛，半衰期長(zhǎng)，血藥濃度高，血藥維持時(shí)間長(zhǎng)，在畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病防治中應(yīng)用廣泛[2]。川續(xù)斷皂苷乙是一種重要的五環(huán)三萜齊墩果烷類皂苷化合物，具有很好的心血管保護(hù)、抗氧化、保肝、抗炎、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)和抗骨質(zhì)疏松等多種生物活性[3-4]，已從忍冬屬植物山銀花、灰氈毛忍冬、華南忍冬、水銀花等發(fā)現(xiàn)該化合物的存在[5-6]。課題組開展了芍藥苷、白頭翁皂苷、甘草、黃芩苷等中獸藥制劑及單體成分對(duì)氟苯尼考代謝的影響研究[7-9]，本文開展川續(xù)斷皂苷乙在大鼠體內(nèi)對(duì)氟苯尼考代謝的影響研究，進(jìn)一步在基因和蛋白水平進(jìn)行確證，探討可能發(fā)生的藥動(dòng)學(xué)相互作用及其機(jī)制，從藥物代謝酶角度為川續(xù)斷皂苷乙的配伍規(guī)律提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為推動(dòng)中西結(jié)合藥動(dòng)學(xué)發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 健康清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重(200±20) g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(川)2013-24。整個(gè)試驗(yàn)期間，于室溫20～24 ℃下飼養(yǎng)，每天供給試驗(yàn)用SD大鼠專用飼料及純化水，采血前12 h限飼。

1.1.2 主要試驗(yàn)儀器 UltiMate3000高效液相色譜儀，美國戴安公司產(chǎn)品；ZGDCY-48S水浴氮吹儀，上海梓桂儀器有限公司產(chǎn)品；CQ250超聲洗滌器，上海超聲儀器廠產(chǎn)品；800B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；WH-3微型旋渦混合儀，上海瀘西分析儀器廠產(chǎn)品；MiniSpin Plus 個(gè)人型高速離心機(jī)，德國艾本德公司產(chǎn)品；StepOne型熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.1.3 藥品與試劑 川續(xù)斷皂苷乙(CAS Number：33289-85-9，含量99.82%)，中國食品藥品檢定研究院；氟苯尼考對(duì)照品(編號(hào)K0301703，含量為99.1%)，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)130555-201704)，中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；氟苯尼考原料藥(批號(hào)202012125，純度為98.9%)，浙江康牧藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈(色譜純)，艾萬拓化工產(chǎn)品貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品；乙酸乙酯等其余試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法 24只健康大鼠隨機(jī)分為2組，每組12只。試驗(yàn)組連續(xù)7 d每天灌服川續(xù)斷皂苷乙，根據(jù)《中國藥典》2015年版山銀花人的臨床劑量,計(jì)算實(shí)驗(yàn)大鼠臨床劑量約為1. 35 g/kg，根據(jù)藥典規(guī)定山銀花中川續(xù)斷皂苷乙的含量5%計(jì)算試驗(yàn)大鼠川續(xù)斷皂苷乙的用量約為60 mg/kg, 1 次/d，空白組則給予相應(yīng)體積的生理鹽水，禁食12 h后于第8天，氟苯尼考按劑量30 mg/kg(氟苯尼考原粉溶于10%PEG-400配制成1%溶液)分別灌服2個(gè)組的各6只大鼠，并于給藥后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h斷尾采集血液約0.1 mL，EDTA抗凝，4000 r/min離心5 min，分離血漿，置-20 ℃冰箱中保存待用。兩個(gè)組剩余各6只大鼠于第8天乙醚麻醉后放血處死，分離肝臟和空腸組織用冰生理鹽水漂洗濾干后凍存。

1.2.2 樣品的處理 精確取血漿0.1 mL于試管中，加入10 μL氯霉素內(nèi)標(biāo)液(500 μg/mL)和400 μL乙酸乙酯，渦動(dòng)混合2 min，4000 r/min離心10 min，吸取上層液于另一離心管中，然后再加入乙酸乙酯400 μL重復(fù)提取1次，合并兩次提取液。在40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?00 μL流動(dòng)相溶解，渦動(dòng)混合2 min，12000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶，取20 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白血漿180 μL，加入20 μL氟苯尼考系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成50、20、10、5.0、2.5、0.5、0.1、0.05 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按1.2.2項(xiàng)下方法處理樣品，以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對(duì)相應(yīng)氟苯尼考濃度作線性回歸，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：Agilen HC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(27∶73，V/V)；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)223 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.5 分析方法質(zhì)量控制 以血漿樣品高、中、低(0. 1、2. 5、20 μg/mL)3個(gè)濃度氟苯尼考考察方法的提取回收率和精密度，每個(gè)樣品做5個(gè)重復(fù)。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1 mRNA表達(dá)量 取100 mg組織用組織破碎儀進(jìn)行破碎，按照說明書用Trizol法提取組織總RNA。測(cè)定樣品OD260 nm/OD280 nm比值，確定RNA濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，利用premier5.0軟件設(shè)計(jì)大鼠CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和看家基因β-actin引物序列(由上海生工生物公司合成)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)上述基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平，PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA 模板2 μL；上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL；SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL；ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，55～61 ℃退火15 s；72 ℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)；60 ℃延伸1 min。結(jié)果采用相對(duì)定量分析，用ΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.7 大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白表達(dá)的測(cè)定 稱取0.1 g 肝臟組織，加入1 mL組織蛋白抽提試劑，研磨后冰上孵育20 min，于10000×g 離心15 min 提取蛋白，用BCA 法測(cè)定蛋白含量。每組蛋白上樣量為50 μg，120 V 恒壓電泳90 min。采用半干電轉(zhuǎn)，450 mA，100 min。用含5%脫脂奶粉和1%BSA的TBST封閉液，4 ℃封閉過夜，加入稀釋后的CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1和P-糖蛋白一抗及GADPH 抗體(1∶500)，4 ℃過夜，用TBST 在室溫下脫色搖床洗3 次。洗膜后加入量稀釋的二抗(1∶10000)，于室溫孵育50 min，用TBST 室溫脫色搖床洗3 次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性結(jié)果 以氟苯尼考與氯霉素峰面積的比值對(duì)相應(yīng)氟苯尼考濃度作線性回歸，得出氟苯尼考在質(zhì)量濃度為0.05～50 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.0309x+0.0078，相關(guān)系數(shù)R2=0.999。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 血漿藥物濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 方法回收率和精密度 測(cè)得方法回收率分別為(83.2±1.6)%、(84.1±2.3)%和(83.5±2.2)%，測(cè)得日內(nèi)RSD分別為4.6%、2.3%和6.1%，測(cè)定日間RSD分別為4.5%、2.1%和6.2%。按信噪比S/N=3計(jì)算，最低檢測(cè)限為0.02 μg/mL。

2.3 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 試驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠均按單劑量(30 mg/kg)給予氟苯尼考后，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的氟苯尼考血藥濃度，其血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2所示，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表2，結(jié)果表明，試驗(yàn)組AUC(0-∞)為34.468±3.346 mg/L·h，與對(duì)照組25.764±3.967 mg/L·h相比顯著增加(P<0.05)，平均駐留時(shí)間MRT0-∞為4.308±1.206 h，與對(duì)照組3.019±0.550相比顯著增加(P<0.05)；半衰期T1/2為3.208±0.860 h，與對(duì)照組1.824±0.266 h相比顯著增加(P<0.05)，達(dá)峰濃度(Cmax)為10.144±1.538 mg/L，與對(duì)照組7.358±1.158 mg/L相比顯著增加(P<0.05)，對(duì)照組清除率CL為0.759±0.192 L/h·kg，與對(duì)照組1.190±0.199 L/h·kg相比顯著降低(P<0.05)。達(dá)峰時(shí)間Tmax和表觀分布容積(Vd)，試驗(yàn)組和對(duì)照組之間差異不顯著。

圖2 試驗(yàn)組和對(duì)照組在大鼠體內(nèi)的氟苯尼考(30 mg/kg)的血藥濃度-時(shí)間曲線

表2 試驗(yàn)組和對(duì)照組在大鼠體內(nèi)的氟苯尼考(30 mg/kg)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.4 川續(xù)斷皂苷乙對(duì)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空腸CYP3A1、MDR1 的mRNA表達(dá)影響 如圖3(A)可知，試驗(yàn)組肝臟CYP1A2和CYP2C11 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，分別降低68.8%和55.0%(P<0.05)，CYP3A1和MDR1 與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。由圖3(B)可知，試驗(yàn)組空腸MDR1 mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比，降低43.2%(P<0.05)，CYP3A1與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)。

圖3 大鼠口服川續(xù)斷皂苷乙對(duì)肝臟(A)中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、MDR1和空腸(B)中CYP3A1、MDR1 mRNA表達(dá)的影響 (n=6)

2.5 川續(xù)斷皂苷乙對(duì)大鼠肝臟CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp和空腸CYP3A1、P-gp蛋白表達(dá)的影響 由圖4(A)和圖4(B)可知，試驗(yàn)組肝臟中CYP1A2和CYP2C11蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比分別降低38.71%和26.64%(P<0. 05)，CYP3A1、P-gp差異不顯著；由圖5(A)和圖5(B)可知，空腸中P-gp表達(dá)量與對(duì)照組相比下降50.93%(P<0.05)，CYP3A1也降低，但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 川續(xù)斷皂苷乙對(duì)肝臟中CYP1A2、CYP2C11、CYP3A1、P-gp蛋白表達(dá)的影響 (n=6)

圖5 大鼠口服川續(xù)斷皂苷乙對(duì)空腸中CYP3A1和P-gp蛋白表達(dá)的影響 (n=6)

3 討 論

藥物的相互作用(drug-drug interaction, DDI)指在一定時(shí)間內(nèi)先后服用兩種或兩種以上藥物后所產(chǎn)生的復(fù)合效應(yīng)，其中，代謝性藥物的藥物相互作用發(fā)生率最高，約占藥代動(dòng)力學(xué)相互作用的40%，可引起療效增強(qiáng)甚至產(chǎn)生不良反應(yīng)，或療效減弱甚至治療失敗[10]。本試驗(yàn)采用川續(xù)斷皂苷乙(60 mg/kg)連續(xù)大鼠灌胃7 d，給予氟苯尼考，試驗(yàn)組的聯(lián)用后Cmax值與對(duì)照組相比顯著增加(P<0.05)，Tmax與對(duì)照組之間差異不顯著，表明川續(xù)斷皂苷乙增加了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的吸收程度，但對(duì)吸收速度無明顯影響。同時(shí)，藥物代謝過程中也發(fā)生了相互作用，川續(xù)斷皂苷乙與氟苯尼考聯(lián)用后，MRT0-∞和T1/2與對(duì)照組相比顯著增加，CL與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)，表明川續(xù)斷皂苷乙延緩了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的代謝速度，降低了氟苯尼考的清除速率，AUC0-∞顯著增加，是由于氟苯尼考的吸收程度增加，代謝減慢共同導(dǎo)致。

P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和細(xì)胞色素P450酶系介導(dǎo)的藥物相互作用，是中西藥聯(lián)用發(fā)生藥動(dòng)學(xué)相互作用最主要的因素，也是最常見的原因。P-糖蛋白可把其底物藥物從腸上皮細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)回腸腔，使藥物吸收減少，生物利用度降低[11]。細(xì)胞色素P450酶系受到誘導(dǎo)或抑制，會(huì)影響藥物在動(dòng)物體內(nèi)的代謝，造成藥效學(xué)的改變[10]。川續(xù)斷皂苷乙是一種重要的五環(huán)三萜齊墩果烷類皂苷化合物，已有研究表明，類似三萜結(jié)構(gòu)的中藥單體對(duì)人和動(dòng)物的藥物代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)酶有不同程度的影響。如薩礎(chǔ)拉等[12]采用大鼠外翻腸囊模型研究了三七皂苷有效組分中人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1，發(fā)現(xiàn)其具有明顯的P-gp底物轉(zhuǎn)運(yùn)特性并可競(jìng)爭(zhēng)性抑制P-gp底物外排。Liu R[13]等研究發(fā)現(xiàn)，三七總皂苷可下調(diào)CYP1A2蛋白的表達(dá)，柴胡皂苷處理后的肝細(xì)胞，能夠明顯誘導(dǎo)CYP1A2的mRNA表達(dá)和增強(qiáng)CYP1A2的活性[14]，人參皂苷Rc、Re、Rf和Rg1可以誘導(dǎo)CYP1A1 mRNA與蛋白水平的表達(dá)[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，川續(xù)斷皂苷乙連續(xù)大鼠灌胃7 d，可抑制空腸中MDR1的mRNA表達(dá)量和P-糖蛋白的表達(dá)量，這可能是造成氟苯尼考藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax增加，引起氟苯尼考在腸道內(nèi)的吸收程度增大的主要原因。同時(shí)，肝臟中CYP1A2和CYP2C11的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)和相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平降低，可能是造成了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的代謝減慢，引起藥動(dòng)學(xué)參數(shù)MRT0-∞和T1/2增加的主要原因。

綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙是山銀花的主要成分，綠原酸對(duì)CYP450酶活性和P-gp活性影響的研究已有報(bào)道[16-17]，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙對(duì)CYP450酶及P-gp活性影響未見研究報(bào)道。山銀花和金銀花俗稱銀花，生產(chǎn)實(shí)踐中兩者常常并用、混用，很多獸用成方制劑，如銀黃口服液、雙黃連口服液、銀翹散等，都含有銀花成分，在獸醫(yī)臨床上配合氟苯尼考等抗菌藥物治療畜禽感染性疾病，取得較好的治療效果。本試驗(yàn)開展川續(xù)斷皂苷乙對(duì)氟苯尼考代謝的影響研究，對(duì)拓展川續(xù)斷皂苷乙及山銀花在畜牧健康養(yǎng)殖中應(yīng)用具有現(xiàn)實(shí)意義。

綜上所述，川續(xù)斷皂苷乙連續(xù)灌胃一周對(duì)氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的吸收和代謝有一定的影響，加快了氟苯尼考在大鼠體內(nèi)的吸收程度和減緩了代謝，提示臨床上兩者合用有潛在增效作用，但獸醫(yī)臨床兩者藥物同時(shí)使用的藥效學(xué)結(jié)果有待進(jìn)一步加以確證。氟苯尼考藥代學(xué)的改變可能與川續(xù)斷皂苷乙抑制了大鼠肝臟中CYP1A2和CYP2C11的表達(dá)以及空腸中P-gp的表達(dá)有關(guān)。本研究為川續(xù)斷皂苷乙的臨床應(yīng)用及川產(chǎn)道地藥材山銀花的進(jìn)一步開發(fā)提供了基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。