流感樣病例中肺炎支原體感染與耐藥情況研究

涂鵬，竇海偉，史大偉，宛瑞杰，田秀君，袁青，陳小華，辛德莉

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是引起急性呼吸道感染（acute respiratory infection，ARI）的常見病原體，以發(fā)熱、咳嗽為主要表現(xiàn)，部分患者可出現(xiàn)肺外并發(fā)癥，危及生命。近年來臨床出現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致患者發(fā)熱、咳嗽和治療周期延長［1-2］。由于臨床癥狀及血常規(guī)檢測指標(biāo)與流行性感冒（以下簡稱“流感”）類似［3］，葉久紅等［4］對(duì)2015—2017年武漢市某三級(jí)甲等醫(yī)院1 197例流感樣病例（influenzalike illness，ILI）中MP進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)MP陽性率為14.54%。因此，本研究對(duì)2018—2020年我國北方地區(qū)冬季（2018年12月至2019年2月、2019年12月至2020年2月）ILI咽拭子標(biāo)本進(jìn)行流感病毒抗原、MP核酸及MP耐藥基因檢測，以期更好地了解ILI中流感病毒和MP感染及耐藥情況，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年12月至2019年2月、2019年12月至2020年2月濰坊、開封、哈爾濱、內(nèi)蒙古、北京、天津、銅川、咸陽、秦皇島、丹東、漢中、太原、本溪地區(qū)各1家，漯河地區(qū)2家，南陽地區(qū)2家，總共17家三級(jí)甲等醫(yī)院門診就診的915份ILI的咽拭子標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：以《全國流感監(jiān)測方案（2017年版）》［5］中ILI為標(biāo)準(zhǔn)，即發(fā)熱（體溫≥38 ℃），伴咳嗽或咽痛之一者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）病程＞72 h；（2）有明確細(xì)菌感染或明確診斷為其他疾病的患者；（3）新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）陽性。

1.2 研究方法

1.2.1 咽拭子標(biāo)本采集 采集咽拭子標(biāo)本采用尼龍材質(zhì)植絨拭子，所有入組病例同時(shí)采集2支咽拭子，一支立即進(jìn)行流感病毒抗原檢測并記錄結(jié)果，另一支放入咽拭子管中，置于-80 ℃或-20 ℃冰箱中冷凍保存，標(biāo)本統(tǒng)一經(jīng)冷鏈運(yùn)輸?shù)街行膶?shí)驗(yàn)室，集中進(jìn)行MP核酸及耐藥基因檢測。

1.2.2 流感病毒抗原檢測 采用甲型/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒（膠體金法）（杭州創(chuàng)新科技生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：AB180204/GB191003/GF200104），將采集的咽拭子浸在采樣管樣本抽提液中攪拌。從采樣管外側(cè)用手指擠壓棉棒數(shù)次，使樣本抽提液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，絞出液體進(jìn)行檢測。15min后觀察結(jié)果。

1.2.3 核酸提取 采取DNA/RNA病毒核酸提取試劑盒（北京卓誠惠生生物科技股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20200312）。將采集的咽拭子充分?jǐn)嚢杌靹颍?00 μl樣本加入到1.5 ml離心管中，加入10 μl蛋白酶K，6 μl Carrier RNA，再加入200 μl裂解液，旋渦震蕩混勻15 s，室溫靜置5 min；加入400 μl無水乙醇，震蕩15 s，室溫靜置5 min；將混合液轉(zhuǎn)移至離心柱中，12 000 rpm離心1 min；將離心柱放入新的收集管中，向離心柱中加入500 μl洗滌液，蓋上管蓋，12 000 rpm離心30 s；將離心柱放入新的收集管中，向離心柱加入500 μl漂洗液，蓋上管蓋，12 000 rpm離心30 s；將離心柱放入新的收集管中，12 000 rpm離心3 min；將離心柱放入新的RNase-Free離心管（1.5 ml）中，打開離心柱管蓋，室溫放置10 min，加入100 μl洗脫液，蓋上蓋子，室溫放置3 min，12 000 rpm離心1 min，收集洗脫液，放入-80 ℃冰箱保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測。

1.2.4 MP及其耐藥基因檢測 應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法擴(kuò)增ILI標(biāo)本MP的23SrRNA基因，上游引物序列5'-GACACCCGTTAGGCGCAA-3'，下游引物序列5'-CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACAGC-3'，目的片段長度為186 bp。反應(yīng)體系：5×Prime STAR Buffer 10 μl，dNTP Mix 4 μl， 上 下 游 引 物 各 2 μl，高保真酶 0.25 μl，模版 DNA 5 μl。DEPC 水 27 μl。反應(yīng)條件：98℃變性2 min；98℃ 10 s、55℃ 10 s、72℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司應(yīng)用DNA直接測序法測序，測得序列與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）已登錄的標(biāo)準(zhǔn)株23SrRNA基因進(jìn)行比對(duì)［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或 Fisher's確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 915份ILI標(biāo)本中男性標(biāo)本425份，女性標(biāo)本490份。兒童標(biāo)本（＜18歲）578份，其中男性標(biāo)本285份，女性標(biāo)本293份；年齡0～18歲，平均（5.0±3.0）歲。成人標(biāo)本（≥18歲）337份，其中男性標(biāo)本140份，女性標(biāo)本197份；年齡18～74歲，平均（37.6±13.6）歲。

2.2 流感病毒抗原檢測結(jié)果 915份ILI標(biāo)本中流感病毒抗原檢測陽性率為45.25%（414/915），其中單純甲型流感病毒占91.06%（377/414），單純乙型流感病毒占8.94%（37/414），未見甲型、乙型流感病毒混合感染病例。兒童ILI標(biāo)本中流感病毒抗原檢測陽性率為44.29%（256/578），其中單純甲型流感病毒占91.80%（235/256），單純乙型流感病毒占8.20%（21/256）［7］；成人ILI標(biāo)本中流感病毒抗原檢測陽性率為46.88%（158/337），其中單純甲型流感病毒占89.87%（142/158），單純乙型流感病毒占10.13%（16/158）；兒童流感病毒抗原檢測陽性率與成年人比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.577，P=0.447）。

2.3 MP及其耐藥基因檢測結(jié)果 915份ILI標(biāo)本中MP陽性率為11.91%（109/915），其中兒童ILI標(biāo)本中MP陽性率為4.34%（25/578），成人ILI標(biāo)本中MP陽性率為24.93%（84/337）；成人ILI標(biāo)本中MP陽性率高于兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=86.094，P＜0.001）。109份MP陽性標(biāo)本中77.98%（85/109）存在耐藥基因位點(diǎn)突變，突變位點(diǎn)為23SrRNA 結(jié)構(gòu)域V區(qū)2063 A到G或者2064 A到G，22.02%（24/109）為敏感株，74.31%（81/109）存在A2063G位點(diǎn)突變，1.83%（2/109）存在A2064G位點(diǎn)突變，1.83%（2/109）存在A2063G位點(diǎn)和A2064G位點(diǎn)共同突變。兒童MP陽性標(biāo)本中48.00%（12/25）存在A2063G位點(diǎn)突變，8.00%（2/25）存在A2064G位點(diǎn)突變，8.00%（2/25）存在A2063G位點(diǎn)和A2064G位點(diǎn)共同突變，36.00%（9/25）為敏感株；成人MP陽性標(biāo)本中82.14%（69/84）存在A2063G位點(diǎn)突變，17.86%（15/84）為敏感株，未見A2064G位點(diǎn)突變；成人MP A2063G位點(diǎn)突變陽性率高于兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.765，P=0.001）。

2.4 流感病毒與MP混合感染情況 915份ILI標(biāo)本中流感病毒與MP混合感染陽性率為2.84%（26/915），其中兒童ILI標(biāo)本中流感病毒與MP混合感染陽性率為1.73%（10/578），成人ILI標(biāo)本中流感病毒與MP混合感染陽性率為4.75%（16/337）；成人ILI標(biāo)本中流感病毒與MP混合感染陽性率高于兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.022，P=0.008）。915份ILI標(biāo)本中甲型流感病毒與MP混合感染陽性率為2.40%（22/915），乙型流感病毒與MP混合感染陽性率為0.44%（4/915）。成人ILI標(biāo)本中甲型流感病毒與MP混合感染陽性率高于兒童，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔3.86%（13/337）與1.56%（9/578），χ2=4.801，P=0.028〕； 而 兩 組 MP與 乙型流感病毒混合感染陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔0.89%（3/337）與0.17%（1/578），P=0.144〕。

3 討論

流感病毒和MP是ARI的重要病原，任何年齡、任何季節(jié)均可發(fā)病，我國北方地區(qū)以秋、冬季多見［1-3］。甲型和乙型流感每年呈現(xiàn)季節(jié)性流行特點(diǎn)，其中甲型流感可引起全球大流行［3，5］。根據(jù)國家流感中心發(fā)布的流感監(jiān)測周報(bào)［8］，2018—2019年我國北方地區(qū)第48周（2018-11-26至2018-12-02）進(jìn)入流感冬季流行季，2019—2020年我國北方地區(qū)第52周（2019-12-23至2019-12-29）進(jìn)入流感冬季流行季，均以甲型流感為主。本研究915份ILI標(biāo)本中流感病毒抗原檢測陽性率為45.25%（414/915），其中甲型流感病毒占91.06%（377/414），乙型流感病毒占8.94%（37/414），未見甲型、乙型流感病毒混合感染病例。與國家流感中心發(fā)布的甲型流感為主的結(jié)果一致。MP每3～7年出現(xiàn)地區(qū)周期性流行，流行時(shí)間可長達(dá)1年，流行年份的發(fā)病率是非流行年份的數(shù)倍［1-2］。由于MP感染的臨床表現(xiàn)與流行季節(jié)流感類似，葉久紅等［4］對(duì)2015—2017年武漢市某三甲醫(yī)院1 197例ILI病原學(xué)檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，MP陽性率為14.54%，其中0～13歲年齡組患者M(jìn)P陽性率為20.53%，14～64歲年齡組患者M(jìn)P陽性率為0.24%。王海濱等［9］對(duì)2017年北京市朝陽區(qū)ILI病原譜分析發(fā)現(xiàn)MP陽性率為1.51%，5～14歲、15～24歲、25～59歲、＞59歲年齡組患者M(jìn)P陽性率分別為0、1.83%、1.51%、1.21%。史大偉等［10］對(duì)2018—2019年冬、春季北京地區(qū)兒童ILI病原學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MP陽性率為1.06%?？椎麓ǖ龋?1］對(duì)2015—2017年上海地區(qū)成人ARI病原學(xué)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)MP檢出陽性率為5.33%，＜60歲成人組MP檢出陽性率高于≥ 60歲組。秦迪等［12］對(duì)2018年北京市西城區(qū)ARI病原學(xué)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)＞14歲組MP陽性率為3.07%，并且MP陽性率在10—12月最高。本研究915份ILI標(biāo)本中MP陽性率為11.91%（109/915），其中兒童ILI標(biāo)本中MP陽性率為4.34%（25/578），高于北京地區(qū)［9-10］兒童ILI標(biāo)本中MP陽性率，低于武漢地區(qū)［4］兒童ILI標(biāo)本中MP陽性率；成人ILI標(biāo)本中MP陽性率為24.93%（84/337），高于現(xiàn)有文獻(xiàn)［11-12］的陽性率。MP陽性率差異原因可能與研究標(biāo)本來源、標(biāo)本采集時(shí)間、患者年齡有關(guān)，本研究標(biāo)本來自河南省、河北省、黑龍江省、山東省、內(nèi)蒙古自治區(qū)等地，標(biāo)本采集時(shí)間多在12月至次年2月，為流感病毒、MP高發(fā)季節(jié)，超過80%的患者年齡在6～55歲。

MP缺乏細(xì)胞壁，臨床治療MP感染主要選擇抑制或影響蛋白質(zhì)和核酸合成的藥物，如大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氟喹諾酮類。兒童處于生長發(fā)育期，四環(huán)素類、喹諾酮類等抗生素的使用受到限制，因此大環(huán)內(nèi)酯類抗生素作為治療兒童肺炎支原體肺炎的首選藥物。自2001年日本從臨床分離出對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的MP菌株［13］以來，全球陸續(xù)報(bào)道MP耐藥情況，我國一直處于較高水平［14］。目前認(rèn)為23SrRNA耐藥突變是MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥的主要機(jī)制。CAO等［15］對(duì)既往大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥肺炎支原體肺炎的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述，發(fā)現(xiàn)23SrRNA基因A2063G突變最普遍，其次是A2064G，A2063T、A2063C、A1290G、C2617A和A2067G較少見。辛德莉等［16］對(duì)MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，23SrRNA基因發(fā)生A2063G、A2064G位點(diǎn)突變的MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）均升高。ZHAO等［17］報(bào)道2008—2012年北京地區(qū)MP耐藥陽性率分別為68.9%、90.0%、98.4%、95.4%和97.0%，其中A2063G位點(diǎn)突變率為97.1%，A2064G位點(diǎn)突變率為2.5%，A2063T位點(diǎn)突變率為0.4%。竇海偉等［18］報(bào)道2016年北京地區(qū)兒童MP耐藥陽性率為66%，其中A2063G位點(diǎn)突變率為93.84%，A2064G位點(diǎn)突變率為6.16%。本研究MP耐藥陽性率為77.98%，與文獻(xiàn)［16-18］報(bào)道相似，提示我國MP耐藥仍處于較高水平。MP 23SrRNA基因檢測中A2063G位點(diǎn)突變率為95.30%（81/85），A2064G位點(diǎn)突變率為2.35%（2/85），A2063G/A2064G位點(diǎn)共同突變率為2.35%（2/85），MP 23SrRNA基因檢測中耐藥位點(diǎn)突變率與文獻(xiàn)［16-18］報(bào)道相似，但本研究兒童ILI標(biāo)本中還發(fā)現(xiàn)2份A2063G/A2064G同時(shí)突變的標(biāo)本，提示MP 23SrRNA基因存在多個(gè)位點(diǎn)突變的情況。

流感病毒可同時(shí)混合其他病毒、支原體、細(xì)菌等不同病原感染。部分患者可因出現(xiàn)肺炎等并發(fā)癥進(jìn)展為重癥流感，出現(xiàn)多臟器功能衰竭而死亡。羅麗娟等［19］對(duì)2017—2019年上海地區(qū)兒童甲型流感病毒感染的臨床特征分析，發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒與MP混合感染陽性率為3.51%。許東風(fēng)等［20］對(duì)2017年南陽地區(qū)臨床722例排除細(xì)菌感染的急性上呼吸道感染患者進(jìn)行流感病毒及MP導(dǎo)致呼吸道感染的流行病學(xué)特點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，流感病毒與MP混合感染陽性率為3.05%（22/722），＜16歲、16～30歲、＞30～50歲和＞50歲流感病毒與MP混合感染陽性率分別為4.76%、4.62%、0.61%和2.04%。鐘慧君等［21］對(duì)深圳地區(qū)2017年臨床1 193例發(fā)熱患兒進(jìn)行流感病毒和MP感染的臨床特征分析，發(fā)現(xiàn)流感病毒與MP混合感染陽性率為7.29%（87/1 193），與單純MP感染組相比，流感病毒與MP混合感染組患兒出現(xiàn)咳嗽、咳痰癥狀明顯增多；與單純流感病毒感染組和單純MP感染組相比，流感病毒與MP混合感染組體溫處于中、高熱狀態(tài)的患兒較多，患兒發(fā)熱時(shí)間和住院時(shí)間更長，單核細(xì)胞百分比和中性粒細(xì)胞百分比升高，淋巴細(xì)胞百分比降低，IgG、IgA、IgM、C3和C4陽性占比較高。而關(guān)于成人流感病毒與MP混合感染的相關(guān)報(bào)道較少。本研究ILI標(biāo)本中流感病毒與MP混合感染陽性率為2.84%，兒童ILI標(biāo)本中流感病毒與MP混合感染陽性率為1.73%，其中甲型流感病毒與MP混合感染陽性率為1.56%。兒童流感病毒與MP混合感染陽性率低于文獻(xiàn)［19-21］中的混合感染陽性率，可能與本研究標(biāo)本來源不同有關(guān)。成人ILI標(biāo)本中流感病毒與MP混合感染陽性率為4.75%（16/337），其中甲型流感病毒與MP混合感染陽性率為3.86%（13/337），與文獻(xiàn)［20］報(bào)道類似。

綜上所述，2018—2020年我國北方地區(qū)冬季流感以甲型流感為主。ILI標(biāo)本中可見MP感染，成人MP陽性率高于兒童。我國MP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率仍處于較高水平，以MP 23SrRNA基因A2063G位點(diǎn)突變最為常見，同時(shí)可見A2063G/A2064G位點(diǎn)共同突變。部分患者可見流感病毒與MP混合感染。對(duì)于ILI應(yīng)進(jìn)行多病原檢測，了解ILI的病原分布情況，流感治療時(shí)應(yīng)兼顧其他病原治療。對(duì)于MP感染的患者應(yīng)進(jìn)行MP耐藥檢測，了解MP耐藥情況。充分了解病原分布及耐藥情況有助于臨床合理用藥，降低抗生素耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。

由于本研究僅納入了2018—2020年冬季北方17家三級(jí)甲等醫(yī)院門診ILI標(biāo)本，無法針對(duì)全年的ILI進(jìn)行分析研究。下一步將開展對(duì)于全年不同季節(jié)ILI中肺炎支原體感染情況的分析。

作者貢獻(xiàn)：涂鵬進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫論文；史大偉、宛瑞杰進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；袁青進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；竇海偉、田秀君進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；陳小華進(jìn)行論文的修訂及英文的修訂；辛德莉負(fù)責(zé)文章的構(gòu)思、質(zhì)量控制及審校；涂鵬、辛德莉?qū)ξ恼抡w負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。