從動物模型的視角研究多發(fā)性硬化髓鞘保護和再生的小膠質(zhì)細胞靶點①

丁智斌 宋麗娟 王 青 柴 智 尉杰忠 馬存根

（山西中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室，神經(jīng)生物學研究中心，太原 030024）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以慢性炎癥髓鞘脫失和神經(jīng)變性為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）炎癥脫髓鞘疾病，其主要病理表現(xiàn)為血腦屏障完整性破壞，外周免疫細胞浸潤到CNS 形成炎癥病灶，進而啟動自身免疫機制導致髓鞘破壞、軸索損傷，出現(xiàn)運動、感覺和自主神經(jīng)功能異常［1］。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）具備諸多MS 病理學和臨床特征，被廣泛用于MS 的研究。雙環(huán)己酮草酰二腙（cuprizon，CPZ）模型和腦立體定位注射溶血卵磷脂（lysolecithin，LPC）模型則作為毒物介導的脫髓鞘動物模型，被廣泛用于髓鞘保護和再生的機制研究。這3種模型都存在小膠質(zhì)細胞的普遍參與，且小膠質(zhì)細胞能夠通過多種機制影響少突膠質(zhì)細胞（oligodendrocytes，OLs）的分化、成熟，進而在疾病的髓鞘脫失和再生中發(fā)揮重要作用。近年來研究顯示，活化的小膠質(zhì)細胞既可以損傷髓鞘、加速疾病進程，又可以保護髓鞘、促進疾病恢復。因此，本文對活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞在MS 模型中的雙方面作用的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 小膠質(zhì)細胞的靜態(tài)與活化

小膠質(zhì)細胞是在早期發(fā)育過程中定植于CNS的固有免疫細胞，其在調(diào)節(jié)神經(jīng)前體細胞遷移、維持神經(jīng)元功能、修剪神經(jīng)突觸、促進OLs分化和髓鞘形成等過程中發(fā)揮著重要作用［2］。小膠質(zhì)細胞還可調(diào)控少突膠質(zhì)前體細胞（oligodendrocyte progenitor cells，OPCs）的數(shù)量來維持腦白質(zhì)的完整。在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面，小膠質(zhì)細胞還可合成大量識別微生物和內(nèi)源性配體的相關(guān)蛋白，實時監(jiān)視內(nèi)環(huán)境中損傷相關(guān)分子模式和病原相關(guān)分子模式等損傷相關(guān)介質(zhì)的變化并做出反應(yīng)。

當小膠質(zhì)細胞受脂多糖、髓鞘/細胞碎片或血腦屏障泄漏等內(nèi)源性/外源性刺激時，一方面發(fā)生胞體增大、突起回縮等形態(tài)改變，另一方面出現(xiàn)吞噬、釋放以及遷移等功能的變化，把這種受到刺激后形態(tài)和功能發(fā)生改變的細胞稱為激活態(tài)的小膠質(zhì)細胞。根據(jù)表面受體和功能的不同，將激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞分為利弊雙重極化的兩種類型，即細胞毒性M1型或細胞保護性 M2 型［3］。M1 型小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)MHC-Ⅱ、iNOS、CD16/32、CD86 等細胞表面分子的表達增多，而M2 型小膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)Arg-1、MY1、P2X4R、FIZZ1、CD206、CD209 等細胞表面分子的表達增高［4-5］。激活后，M1 型小膠質(zhì)細胞上調(diào)并分泌IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-18 等致炎因子而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用，損傷CNS 正常髓鞘和細胞；而 M2 型上調(diào)并分泌 IL-4、IL-10、TGF-β、PDGF、BDNF、GDNF、IGF-1、miR-124 等保護性介質(zhì)而發(fā)揮抗炎作用，維持CNS 微環(huán)境平衡，保護髓鞘和滋養(yǎng)神經(jīng)元［4，6-7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，M1 和 M2 表型小膠質(zhì)細胞同時存在于脫髓鞘動物模型中，且M1/M2 比例失調(diào)是決定疾病是否復發(fā)的關(guān)鍵因素。

2 M1型小膠質(zhì)細胞與髓鞘脫失

在EAE 模型中，M1 型小膠質(zhì)細胞發(fā)生形態(tài)和基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，加速髓鞘脫失、神經(jīng)元死亡，進而加速疾病進程。研究顯示，NF-κB 信號通路、ROCK 信號通路與M1表型的極化、致炎因子的產(chǎn)生密切相關(guān)［8-9］。當病原刺激與小膠質(zhì)細胞TLR4 受體識別后活化胞內(nèi)IκB 激酶復合體，進而露出核定位區(qū)的NF-κB 轉(zhuǎn)移至核內(nèi)并識別特定序列，促使小膠質(zhì)細胞M1表型有關(guān)的炎癥基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。M1型小膠質(zhì)細胞高表達iNOS 促使細胞內(nèi)ROS 和RNS 含量增高，釋放大量的 TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23等致炎因子和CCL2、CCL20等趨化性細胞因子，進而激活并趨化外周Th1、Th2、Th17和巨噬細胞向CNS 浸潤，導致炎癥的進行性放大。此外，STAT 和 Notch 信號通路也可激活 NF-κB 通路促使M1 表型細胞增多［10］。上述通路的激活最終導致CNS髓鞘脫失、神經(jīng)元功能異常和死亡。

在CPZ 模型中，造模6 周后腦內(nèi)可見明顯的髓鞘脫失和小膠質(zhì)細胞聚集，后者高表達iNOS、NF-κB，提示CPZ 模型的小膠質(zhì)細胞主要向M1 表型極化［11］。同時，M1 型小膠質(zhì)細胞也可釋放蛋白酶、促炎細胞因子和自由基等介質(zhì)激發(fā)CNS 炎性反應(yīng)，加速外周T 細胞向腦內(nèi)浸潤，進而加重對OLs 和神經(jīng)元的損傷，促使疾病進展［12］。

在LPC 模型中，也發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞向M1 表型極化，并出現(xiàn)外周T細胞和巨噬細胞向CNS的浸潤，加重了髓鞘的脫失和疾病進展［13］。

綜上所述，極化的M1 型細胞在脫髓鞘模型中具有破壞髓鞘、抑制OLs分化成熟、加速神經(jīng)元變性死亡的特點，常加速脫髓鞘疾病的進展。

3 M2型小膠質(zhì)細胞與髓鞘再生

小膠質(zhì)細胞除了有促進脫髓鞘、加重疾病進展等負面作用外，其促進髓鞘再生的作用近些年來也備受研究者們關(guān)注。M2 型小膠質(zhì)細胞既可吞噬清除損傷的髓鞘和細胞碎片減輕二次免疫應(yīng)答，又以分泌抗炎及再生因子等方式改善CNS 炎癥微環(huán)境，促使OPCs的招募、分化和成熟，進而再生髓鞘。

在EAE 恢復期，高表達嘌呤能P2X4R 的小膠質(zhì)細胞抑制促炎因子和iNOS基因表達，促進CD206基因表達，增強髓鞘碎片清除能力，提示恢復期P2X4R 高表達的小膠質(zhì)細胞主要向M2 表型極化，進而改善微環(huán)境，促進OPCs 分化成熟和髓鞘再生［14］。另外，M2 型小膠質(zhì)細胞也可通過分泌Activin A、Gal-3、IGF-1 等細胞因子和 MMPs 促進OPC的招募和分化，促進髓鞘再生［15］。

CPZ模型研究發(fā)現(xiàn)，胼胝體部位的M2型小膠質(zhì)細胞高表達吞噬相關(guān)基因，推測M2 型小膠質(zhì)細胞可能通過清除代謝產(chǎn)物改善微環(huán)境，進而促進髓鞘修復和再生［16］。此外，小膠質(zhì)細胞還可向脫髓鞘部位聚集并招募OPCs，促進病變區(qū)域髓鞘堿性蛋白和髓鞘相關(guān)糖蛋白mRNA 表達上調(diào)［17］。目前研究發(fā)現(xiàn)，TREM2 與小膠質(zhì)細胞吞噬作用密切相關(guān)。在EAE 和 CPZ 模型中，TREM2 的高表達可促進小膠質(zhì)細胞吞噬髓鞘/細胞碎片，限制炎癥和促進組織修復［18-19］。相反，在LPC 模型中，小膠質(zhì)細胞的耗盡導致了崩解的髓鞘碎片清除障礙、OPCs向病變部位的招募延遲和髓鞘再生的延遲［20］。

綜上所述，極化的M2 型細胞在脫髓鞘模型中通過清除髓鞘碎片、分泌抗炎和髓鞘再生因子等途徑促進OPCs 分化成熟、髓鞘修復和再生，使神經(jīng)沖動傳導、神經(jīng)元及軸突的代謝功能得以恢復。

4 靶向小膠質(zhì)細胞極化抑制脫髓鞘、促進髓鞘修復和再生

在動物實驗中，芬戈莫得（fingolimod，F(xiàn)TY720）不僅可以抑制 M1 表型細胞產(chǎn)生IL-1β、IL-6、TNF-α等致炎因子，還可以誘導M2 表型細胞分泌BDNF、GDNF 等營養(yǎng)相關(guān)因子，進而促進髓鞘再生、保護神經(jīng)元并改善臨床癥狀，應(yīng)為靶向小膠質(zhì)細胞的藥物，但它是作為S1P受體激動劑而獲批的，目前已被用于MS 的疾病修飾治療［21］。因此，嚴格地說，目前臨床上尚無批準的靶向小膠質(zhì)細胞改善髓鞘脫失、促進髓鞘再生的治療方法。令人興奮的是，動物模型研究發(fā)現(xiàn)，一些藥物可能具有靶向小膠質(zhì)細胞的極化保護并促進髓鞘再生的特性，給藥物的研究帶來了一線曙光。

4.1 EAE 模型中的小膠質(zhì)細胞 Rho 激酶抑制劑鹽酸法舒地爾一方面能夠抑制小膠質(zhì)細胞NF-κB信號通路和致炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的分泌，另一方面還能夠促使小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生IL-10，提示鹽酸法舒地爾可以促使M1 促炎型細胞向M2 抗炎型細胞轉(zhuǎn)化，進而改善EAE 的病理和臨床表現(xiàn)［22］。同樣，體外研究證實鹽酸法舒地爾能夠誘導脂多糖刺激的BV2 細胞上調(diào)CD206 等分子的表達，下調(diào)CD16/32 等分子的表達，促使其向抗炎M2 表型轉(zhuǎn)化［23］。

在EAE 中，小膠質(zhì)細胞激活抑制劑拉喹莫德能夠抑制M1 型小膠質(zhì)細胞iNOS 的表達，降低NO 水平，進而保護髓鞘和神經(jīng)元軸突［24］。表達miR-124的小膠質(zhì)細胞在EAE 模型中明顯減少，而過表達miR-124 可促進小膠質(zhì)細胞的抗炎反應(yīng)，抑制EAE疾病進展。如毛喉素能夠使M2表型分子（miR-124、Arg-1）上調(diào)，M1 表型分子（iNOS）下調(diào)，而促進疾病恢復［7］。間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能夠顯著增加M2 表型細胞產(chǎn)生 IL-10 和 TGF-β 等保護因子，抑制M1 表型細胞產(chǎn)生 TNF-α 和 IL-12 等毒性因子，進而減少髓鞘脫失，改善EAE 小鼠行為學評分［25］。同源核基因MSX3 的過表達能夠促進M1 表型細胞向M2表型細胞轉(zhuǎn)化，進而防止炎癥脫髓鞘，促進髓鞘再生，改善EAE 小鼠的臨床評分［26］。特異性表達于小膠質(zhì)細胞的IRAK-M 通過下調(diào)TLR4 信號通路顯著延遲EAE 的發(fā)生，可能與極化的M2 表型細胞增多相關(guān)［27］。TNP-ATP 通過阻斷嘌呤能 P2X4R 信號能夠促使極化的M1 表型細胞增多，抑制其吞噬清除功能，加重EAE 模型的臨床評分；相反，變構(gòu)調(diào)節(jié)因子伊維菌素能夠激活P2X4R，促使小膠質(zhì)細胞向M2表型極化，進而增強小膠質(zhì)細胞吞噬清除髓鞘碎片，促進髓鞘再生［14］。

4.2 CPZ模型中的小膠質(zhì)細胞 在CPZ模型中，通過誘導TLR2 耐受可促使小膠質(zhì)細胞由促炎型M1（iNOS）表型向抗炎型M2（Arg-1）表型轉(zhuǎn)變，進而增強CPZ 模型小鼠髓鞘的修復［28］。鹽酸法舒地爾能夠抑制M1 表型細胞的NF-κB 信號通路和促炎因子的釋放，但是否調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2 表型的極化尚未闡述［11］。17β-雌二醇能夠抑制 M1 型小膠質(zhì)細胞數(shù)量并延遲其激活，進而發(fā)揮髓鞘保護作用［29］。米諾環(huán)素可抑制M1 型小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生TNF-α 等促炎因子來減輕對髓鞘的破壞［30］。黃體酮干預(yù)CPZ模型鼠，一方面可以下調(diào)病變區(qū)域iNOS、CD86、MHC-Ⅱ和 TNF-α 等 M1 型小膠質(zhì)細胞 mRNA 的表達，另一方面還可上調(diào)CD206、Arg-1和TGF-β等M2型小膠質(zhì)細胞mRNA 的表達，提示黃體酮能夠促進M1 型小膠質(zhì)細胞向M2 表型轉(zhuǎn)化，進而發(fā)揮保護和促進髓鞘再生的作用［31］。吡喃［3，2-a］咔唑生物堿Claulansine F 衍生物CZ-7 能夠促進小膠質(zhì)細胞向M2表型極化并吞噬清除胼胝體區(qū)域的髓鞘碎片，進而促進了髓鞘再生［32］。丙酮酸乙酯能夠抑制M1 表型細胞的NF-κB 和TLR-4 等信號通路，誘使小膠質(zhì)細胞向M2 表型極化，增強小膠質(zhì)細胞的遷移和吞噬髓鞘碎片的能力，進而改善炎癥微環(huán)境，促進OLs前體細胞分化成熟［33］。

有趣的是，柳氮磺胺吡啶能夠調(diào)節(jié)miR-136-5p和lncRNA HOTAIR 等小膠質(zhì)細胞內(nèi)源性RNA 的平衡來抑制M1 型小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)，進而促進OLs 的分化和髓鞘再生［34］；抑癌蛋白 M 受體在小膠質(zhì)細胞表達明顯增多，并且抑癌蛋白M 可以誘導胼胝體區(qū)域的小膠質(zhì)細胞高表達CD206，提示抑癌蛋白M 體內(nèi)具有促使小膠質(zhì)細胞向M2 表型極化，進而促進髓鞘再生［35］；電針刺激能夠誘導小膠質(zhì)細胞向胼胝體部位聚集，增強其吞噬清除髓鞘碎片的能力，并促進小膠質(zhì)細胞高表達CD206 和Arg-1 等細胞表面分子，提示多種方法可以誘導小膠質(zhì)細胞向M2表型極化并增強其吞噬清除髓鞘碎片的作用［36］。

4.3 LPC 模型中的小膠質(zhì)細胞 LPC 誘導的模型研究顯示，半乳糖凝集素1 能夠促使小膠質(zhì)細胞向M2表型轉(zhuǎn)化并增強其吞噬清除髓鞘碎片的能力，進而促進OLs 分化成熟和髓鞘再生［37］。同樣，干擾長鏈非編碼RNA GAS5 在促使小膠質(zhì)細胞表達CD206、IGF-1等M2表型特異性分子的同時，也抑制了TNF-α、IL-1β等M1表型特異性分子的表達，提示干擾該RNA 可促使小膠質(zhì)細胞向M2 表型轉(zhuǎn)變，改善LPC 模型小鼠髓鞘脫失，可能成為脫髓鞘疾病治療的一個新方向［38］。

5 結(jié)語

綜上所述，小膠質(zhì)細胞在MS 脫髓鞘動物模型中扮演著雙重作用，一方面致炎癥M1 表型細胞的通路激活，分泌大量的炎癥物質(zhì)，加劇髓鞘脫失和神經(jīng)元丟失；另一方面，一些小分子調(diào)控小膠質(zhì)細胞向M2 表型極化進而發(fā)揮抗炎、清除髓鞘碎片和分泌再生因子等維持CNS 內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，保護并再生髓鞘。由于小膠質(zhì)細胞在脫髓鞘疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，M1/M2 型是處于動態(tài)變化之中，所以通過藥物靶向小膠質(zhì)細胞M1/M2 表型極化保護髓鞘，促進OPCs 分化成熟進而再生髓鞘，可能成為未來治療MS 等脫髓鞘疾病的靶標。然而，在脫髓鞘疾病中，各種分子是怎樣調(diào)控小膠質(zhì)細胞M1/M2 表型的？如何才能高效地抑制M1 型小膠質(zhì)細胞并促進M2 型小膠質(zhì)細胞等仍是當今面臨的一大難題?？傊?，進一步探討藥物對小膠質(zhì)細胞表型極化的具體調(diào)控機制將為今后治療CNS 脫髓鞘疾病提供新的途徑。