TGF-β1介導的Smad和ERK信號通路在腎纖維化中的研究進展

郭 帥 方 敬 陳志強 （河北中醫(yī)學院，石家莊 050000）

腎纖維化是慢性腎臟疾病的最終共同途徑，以細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度沉積為主要特征，與患者的長期預后密切相關(guān)。TGF-β1是目前公認的最強的致纖維化生長因子之一，可以通過增加ECM 合成，抑制ECM 降解，促進腎細胞與基質(zhì)的黏附，引起炎癥細胞的浸潤，介導腎固有細胞的凋亡、肥大、脫離及表型轉(zhuǎn)換等導致腎纖維化。TGF-β1 所介導的信號通路分為Smad 依賴途徑及Smad 非依賴途徑，其中Smad 非依賴途徑以ERK 信號通路為主。TGF-β1/Smad 及 TGF-β1/ERK 信號通路相互交叉協(xié)作調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達，誘導腎纖維化。

1 TGF-β1

TGF-β1是TGF-β超家族的成員，其家族還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長分化因子、米勒抑制物質(zhì)、抑制素、活化素等［1］。TGF-β 是一種廣譜生長因子，可調(diào)節(jié)許多基本的生物學過程，包括細胞生長、分化、黏附、增殖組織修復和凋亡。在哺乳動物中存在TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3 3 種亞型。TGF-β1 是與腎纖維化最相關(guān)的亞型，可由所有類型的腎細胞和浸潤炎癥細胞分泌。細胞分泌的TGF-β1 都是以無活性的潛活 TGF-β1 復合物（LTGF-β1）形式存在，這種復合物主要包括潛活相關(guān)蛋白（LAP）、成熟TGF-β1 多肽和TGF-β1 結(jié)合蛋白（LTBP），當暴露于各種刺激［包括pH值、活性氧、纖溶酶、組織蛋白酶、整聯(lián)蛋白和血小板反應蛋白（TSP）-1等］，TGF-β1從潛在復合物中釋放出來，成為有活性的TGF-β1，與其細胞表面受體結(jié)合［2］。TGF-β1 受體屬于跨膜蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，有3種類型，TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ）、Ⅱ型受體（TβRⅡ）和Ⅲ型受體（TβRⅢ），其中TβRⅠ和TβRⅡ是TGF-β信號通路激活的必需分子。成熟的TGF-β1與TβRⅡ結(jié)合以募集TβRⅠ，啟動Smad 依賴性和Smad 非依賴性信號途徑，介導生物學效應［3］。

越來越多的證據(jù)表明，TGF-β1在實驗性動物模型和人類腎纖維化中發(fā)揮重要作用，TGF-β1在纖維化腎臟中均顯著上調(diào)，且與原發(fā)病無關(guān)。TGF-β1誘導腎臟纖維化的主要機制包括：①誘導Ⅰ型及Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白（FN）等ECM 的合成［4-5］；②減少金屬蛋白酶（MMP）的合成和增加金屬蛋白酶抑制劑的合成來抑制ECM 降解［6］；③誘導腎系膜細胞、上皮細胞及內(nèi)皮細胞肥大、增殖、凋亡、脫離等［7］；④促進成纖維細胞、周細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞等向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)分化［8-9］；⑤改變整聯(lián)蛋白的表達并調(diào)節(jié)其在細胞表面的相對比例，促進細胞與ECM的黏附［10］。

2 TGF-β1/Smads信號通路與腎纖維化

Mad 蛋白和Sam 蛋白同處于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體下游，因此將Mad 蛋白和Sam 蛋白及其類似物統(tǒng)稱為 Smad 蛋白。Smad 是 TGF-β1 信號轉(zhuǎn)導過程中重要的胞內(nèi)下游分子，將TGF-β1 信號由膜受體傳導至細胞核，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)8 種Smads，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可分為：①受體 激 活 Smads（R-Smads），包 括 Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8；②普通 Smads（Co-Smads），包括 Smad4；③抑制性 Smads（Ⅰ-Smads），包括Smad6 和 Smad7。Smad2、Smad3、Smad4 和 Smad7 參與TGF-β1 信號通路。TGF-β1 與 TβRⅡ結(jié)合激活TβRⅠ，導致Smad2 和Smad3 磷酸化，激活的Smad2和Smad3與Smad4形成復合物，易位到細胞核中，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。Smad7 是Smads 家族中的抑制性蛋白，由TGF-β1誘導產(chǎn)生，在正常情況下，Smad7可以通過競爭TβRⅠ、阻止Smad2/3 磷酸化、招募E3連接酶Smurf1/2 或Nedd4-2 到TβRⅠ致TβRⅠ的泛素化降解等多種方式，阻止TGF-β1 信號通路的過度活化，從而起到負反饋的作用。

TGF-β1/Smad 信號通路與腎纖維化密切相關(guān)。TGF-β1/Smad信號的激活顯著促進了腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化［11］。Smad2 和 Smad3 在實驗性動物模型和人類腎纖維化中均被過度激活［12-13］。多項研究表明，Smad2 和 Smad3 在 TGF-β1 介導的信號通路中具有相反的功能。在不同病因所引起的腎纖維化模型中，敲除Smad3 基因可以明顯緩解腎纖維化程度［14］。Smad3 的過表達抑制成纖維細胞中MMP-1的活性［15］。Smad3可以直接結(jié)合到膠原蛋白的啟動子區(qū)域以誘導其合成［16］。以上研究均表明Smad3 具有致病性。雖然Smad2 和Smad3 的結(jié)構(gòu)具有90%以上的相似性，但Smad2 在腎纖維化中起保護作用。敲除Smad2 基因加重了UUO 小鼠的腎纖維化，而Smad2 的過表達減弱了腎小管上皮細胞中TGF-β1 誘導的Smad3 磷酸化和Ⅰ型膠原蛋白的表達［17］。Smad4 是將 Smad2/3 易位到細胞核中的關(guān)鍵分子。在小鼠及細胞實驗中，敲除Smad4基因，均可減輕ECM 的積累。進一步的研究表明，敲除Smad4基因是通過降低Smad3 反應性啟動子活性并抑制Smad3 與 Col1A2 啟動子的結(jié)合而減弱腎纖維化［18］。Smad7是TGF-β1信號通路重要的負反饋調(diào)節(jié)因子，在纖維化腎臟中，Smad7 的水平明顯降低［19］。體內(nèi)外實驗均表明，Smad7 基因過表達能抑制TGF-β 介導的腎纖維化，而Smad7 基因敲除加重腎纖維化［20-21］。以上研究結(jié)果表明，Smad2和Smad3既有共性又有其各自起作用的方式，在腎纖維化中的作用不盡相同，有待進一步研究。Smad4促進腎纖維化，Smad7 抗腎纖維化。總之，Smad 依賴的信號通路在傳導TGF-β1信號介導腎纖維化中發(fā)揮重要作用。

3 TGF-β1/ERK信號通路與腎纖維化

細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）屬于絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPK）。MAPK 是一個在真核生物中保守性很高的蛋白絲/蘇氨酸激酶家族，調(diào)控著代謝、基因表達、增殖、運動等多種細胞活動。迄今為止，已在哺乳動物中鑒定出5 種不同的MAPK：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1 和 2（ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶 1、2 和3（JNK1/2/3）、p38、ERK3/4 及 ERK5。研究最廣泛的是ERK1/2、JNK1/2/3和p38激酶。盡管每個MAPK 都有獨有的特征，但有相同的信號傳導模式，每個MAPK 家族都由一組3 個順序起作用的激酶組成：MAPKK 激酶（MAPKKK）、MAPK 激酶（MAPKK）和MAPK。MAPKKK 是絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化的MAPKKK 可磷酸化MAPKK 而將其激活，活化的MAPKK 將 MAPK 磷酸化而激活，活化的 MAPK 可以轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，通過磷酸化作用激活多種關(guān)鍵酶、轉(zhuǎn)錄因子等，使細胞對外來信號產(chǎn)生生物學應答。

ERK 是較大的絲裂原活化蛋白激酶家族的成員。ERK1 和ERK2 的結(jié)構(gòu)有84%相同，因此，常使用ERK1/2 進行指代。ERK1/2 調(diào)節(jié)細胞周期進程、增殖、胞質(zhì)分裂、轉(zhuǎn)錄、分化、衰老、死亡、遷移、GAP連接形成、肌動蛋白、微管網(wǎng)絡(luò)、神經(jīng)突延伸和細胞黏附等。ERK1/2 信號的畸變已被廣泛用于多種疾病，包括多種癌癥、糖尿病、病毒感染和心血管疾病等。MAPK 可以被生長因子、細胞因子、激素、高滲、壓力及理化刺激等激活，但一般來說，ERK1 和ERK2 會優(yōu)先響應生長因子被激活［22］。細胞外生長因子（如表皮生長因子EGF、血小板衍生因子PDGF等）與其各自的跨膜受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合后形成二聚體，激活受體酪氨酸激酶活性，受體自身絡(luò)氨酸殘基磷酸化，形成SH2 結(jié)合位點，結(jié)合含有SH2 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白 Grb2，Grb2 的 2 個 SH3 結(jié)構(gòu)域與SOS 分子中的脯氨酸序列結(jié)合，SOS 活化之后SOS 結(jié)合 Ras 蛋白，促進 Ras 釋放 GDP、結(jié)合 GTP，Ras-GTP 可引起 Raf（MAPKKK）、MEK（MAPKK）和ERK（MAPK）的順序募集和激活。Raf 的激活機制非常復雜，需要Ras 的結(jié)合、多次磷酸化/去磷酸化事件及Raf 二聚體的形成，至今尚未完全闡明［23］。Raf是一組絲氨酸/蘇氨酸激酶（A-Raf、B-Raf、C-Raf），其中C-Raf 是研究最廣泛也是功能最多的激酶，其調(diào)節(jié)作用復雜且仍待闡明［24］?；罨腞af 與雙特異性激酶MEK（MEK1、MEK2）結(jié)合并使其磷酸化，繼而在其活化環(huán)保守的Thr-Glu-Tyr（T183-E-Y185）基序內(nèi)使ERK 磷酸化。盡管MEK1和MEK2具有廣泛的同源性，但研究表明，MEK1 激活的ERK2 優(yōu)先聚集在細胞核中［25］。然后，活性 ERK1/2 從 MEK1/2 中釋放出來，可以易位進入細胞核或在細胞質(zhì)中磷酸化100多種具有多種功能的底物［26］。

ERK 信號通路是TGF-β 介導腎纖維化的另一重要信號通路。與前文所介紹的RTK 類似，被活化的TβRⅡ-TGF-β1-TβRⅠ三聚體在Tyr和Ser上募集并直接磷酸化ShcA，觸發(fā)了與Grb2 和SOS 的締合，從而激活了Ras-ERK 途徑。然而，有研究表明，在成纖維細胞中，TGF-b 激活Erk 途徑與經(jīng)典的Ras/Raf/ERK 途徑并不同，Ras 可能仍參與其中，但起次要作用，C-Raf 激活主要通過 Pak2 發(fā)生［27］。大量研究表明，ERK 信號通路在不同原因所致的腎纖維化動物模型及人類中呈激活狀態(tài)，抑制該通路可以緩解腎纖維化［28-29］。ERK 途徑可通過抑制腎小管EMT改善腎間質(zhì)纖維化［30］。TGF-β1 通過 ERK1/2 途徑，導致腎小管細胞膠原沉積和腎纖維化。TGF-β1 可激活體外培養(yǎng)的足細胞ERK1/2，并誘導間質(zhì)MMP-9的表達和活化，導致基底膜的損傷，最終引起腎小球硬化［31］。ERK1/2 抑制劑 PD98059 可以抑制鼠腎小球系膜細胞結(jié)締組織生長因子的表達，從而減輕腎纖維化［32］。以上研究結(jié)果表明，TGF-β1通過活化ERK 信號通路介導腎小管上皮細胞EMT，增加ECM的分泌，抑制ECM 的降解，促進腎纖維化。總之，TGF-β1/ERK 信號通路在腎纖維化中作用不容忽視。

4 TGF-β1 介導的 Smads 和 ERK 信號通路在腎纖維化中的相互關(guān)系

TGF-β1 既能誘導經(jīng)典的 Smad2/3 信號，又能誘導非經(jīng)典的C-Raf-MEK1/2-ERK1/2信號，2條信號通路相互作用產(chǎn)生細胞增殖、分化、遷移、生長停滯、凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化等多種生物學反應［33-34］。已有大量研究表明，Smad 與ERK 信號轉(zhuǎn)導之間的存在串擾。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β 誘導的ERK 信號通路可促進Smad2/3磷酸化［35］。另外，TGF-β誘導的Ras/ERK MAPK 信號誘導 TGF-β1，并放大 TGF-β 反應。Ras-ERK途徑與TGF-β協(xié)同誘導Smad依賴的Snail1表達，這是EMT 通過抑制E-鈣黏著蛋白表達所必需的［36］。進一步研究表明，在 Smad2 和 Smad3 的連接子區(qū)域內(nèi)，有幾個潛在的ERK 磷酸化位點，ERK 介導的接頭區(qū)域磷酸化增加了受體磷酸化的Smad2和Smad3 的半衰期，而且還增加了Smad 轉(zhuǎn)錄活性的持續(xù)時間［27］。Smad2/3 的快速磷酸化，可被 ERK1/2 或p38MAPK抑制劑阻斷［37］。以上結(jié)果均表明，TGF-β1介導的ERK 信號和Smad 信號之間是相互協(xié)同的。但也有一些研究有相反的意見，表型正常的間充質(zhì)細胞中發(fā)現(xiàn)了TGF-β 誘導的ERK 激活，但在正常的上皮細胞中沒有發(fā)現(xiàn)［27］。ERK 會磷酸化Smad2/3的接頭區(qū)域，該區(qū)域被TGF-β 激活，從而抑制了Smad2/3 的核轉(zhuǎn)運和 Smad 的依賴性轉(zhuǎn)錄［38］。在原代培養(yǎng)的肺泡上皮細胞及其細胞系中，Ras-ERK 通路會干擾 TGF-β1 誘導的 Smad 信號介導的 EMT［39］。磷酸化的連接子區(qū)域，還顯示出抑制Smad核易位和信號傳導［40］。以上研究引起本課題組進一步思考，可能 TGF-β1/ERK 途徑對 TGF-β1/Smad 的正負調(diào)控作用因細胞類型而產(chǎn)生差異，但具體的分子機制仍需深入研究。

圖1 TGF-β1介導的Smad和ERK信號通路在腎纖維化中的作用Fig.1 Role of Smad and ERK signaling pathway mediated by TGF-β1 in renal fibrosis

5 結(jié)語

綜上所述，TGF-β1 所介導的 Smad 信號和 ERK信號從多個方面參與了腎纖維化的形成。2 條通路并不是簡單的線性傳導，而是受到多種蛋白的調(diào)控，且通路之間相互作用，使機制變的更為復雜。雖然目前已經(jīng)開發(fā)了TGF-β1、Ras、Raf、MEK和一些下游靶標的抑制劑，但許多抑制劑仍在臨床試驗中。因此應對TGF-β1 信號深入研究，揭示TGF-β1/Smads和TGF-β1/ERK信號通路間的本質(zhì)聯(lián)系，認識到機制的關(guān)鍵，開發(fā)特定的抑制劑，造福于腎纖維化患者。