自閉癥中T細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的研究進(jìn)展①

申 晨 曹 霞 喻哲昊 李 萌 （昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，昆明 650000）

自閉癥是一組以社會(huì)交流障礙、語言和非語言交流障礙、興趣狹窄及行為重復(fù)刻板為主要特征的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。1943 年，美國霍布金斯醫(yī)院的兒童精神病學(xué)家KANNER 教授首次報(bào)道，并于2013年在美國精神病學(xué)診斷統(tǒng)計(jì)手冊第5版（DSM-Ⅴ）正式提出孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）的概念，并將兒童自閉癥、未分類的廣泛性發(fā)育障礙、阿斯伯格綜合征統(tǒng)稱為ASD。

ASD 病因不明，且發(fā)病率逐年提高，尚無特效治療手段，其中患者個(gè)體異質(zhì)性強(qiáng)，也成為早期篩查和診斷治療的一大難題。ASD 被認(rèn)為是環(huán)境和遺傳共同作用的結(jié)果，但仍未證實(shí)發(fā)病的病理機(jī)制和有效的臨床生物學(xué)指標(biāo)，診斷主要依據(jù)行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，存在較大局限。臨床病例顯示，ASD 患兒常伴有一種或多種自身免疫性疾病，家庭成員患有自身免疫病史的后代患ASD 的概率更高，且母體免疫激活已被認(rèn)為是ASD 的風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)在患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)多種針對自身組分的反應(yīng)性抗體存在，表現(xiàn)出自身免疫基礎(chǔ)［1-2］。近年來發(fā)現(xiàn)ASD 中樞和外周普遍存在不同程度的免疫失調(diào)，其中T 細(xì)胞及其細(xì)胞因子在其發(fā)生發(fā)展中顯現(xiàn)出越來越重要的作用。本文綜述了ASD中T細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞因子的研究進(jìn)展，探討ASD 中免疫調(diào)節(jié)體系的缺失造成的不同T 細(xì)胞表型激活及其對于疾病進(jìn)展的重要作用，為尋找潛在有效的生物學(xué)標(biāo)志物和ASD 個(gè)性化防治提供新思路。

1 T細(xì)胞簡述

T 淋巴細(xì)胞簡稱T 細(xì)胞，源自骨髓產(chǎn)生的淋巴干細(xì)胞，在胸腺中發(fā)育成熟，循環(huán)于次級淋巴組織間發(fā)揮免疫功能，是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要組成部分。T 細(xì)胞在胸腺中經(jīng)過陰性選擇和陽性選擇后，篩選具有自身主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex，MHC）限制和自身免疫耐受的T 細(xì)胞，并主要以幼稚的 CD4+或 CD8+T 單陽性 T 細(xì)胞向外周輸出，其表面的T 細(xì)胞受體（T cell receptor，TCR）決定T 細(xì)胞多樣性，遇到帶有相同抗原肽的抗原提呈細(xì)胞后，識別MHCⅡ類分子提呈的抗原決定簇的幼稚CD4+T 細(xì)胞分化為具有輔助效應(yīng)的T（helper T cell，Th）細(xì)胞亞群，分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子對抗病原體感染；識別MHCⅠ類分子的幼稚CD8+T細(xì)胞分化為對抗病毒和腫瘤的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）；同時(shí)在特定細(xì)胞因子環(huán)境下，分化成能抑制T 細(xì)胞過度增殖與活化的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg），預(yù)防自身免疫反應(yīng)。

2 ASD中的T細(xì)胞失調(diào)

2.1 神經(jīng)炎癥與T 細(xì)胞 ASD 近年來研究的主要進(jìn)展之一就是發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥可能是ASD 的致病因素。有證據(jù)表明，在ASD 多個(gè)腦區(qū)中發(fā)現(xiàn)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而導(dǎo)致腦組織中的促炎因子 IL-1β、IL-6、IL-17 和 TNF-α 表達(dá)增多，介導(dǎo)病理損傷［3］。最新研究報(bào)道，在患者死后大腦腔隙的血管周圍，出現(xiàn)大量多灶性淋巴細(xì)胞浸潤，主要是以 CD8+T 細(xì)胞為主，CD4+和 CD3+標(biāo)記的 T 細(xì)胞次之［4］。作為我們認(rèn)知中的免疫豁免區(qū)，正常情況下T 細(xì)胞不會(huì)跨越血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）。而 FIORENTINO 等［5］通過分析 ASD 死后腦組織BBB 相關(guān)基因序列和蛋白譜，認(rèn)為ASD 的BBB功能受損，且和神經(jīng)炎癥相關(guān)，因此不難解釋T細(xì)胞的“越位”現(xiàn)象，同時(shí)CD8+T 細(xì)胞的腦內(nèi)優(yōu)勢提示可能存在潛在病毒感染。

在一項(xiàng)整合1 695 例自閉癥、精神分裂癥和雙相情感障礙患者腦樣本基因型和RNA 序列信息分析轉(zhuǎn)錄組調(diào)控異常的研究中，發(fā)現(xiàn)4 個(gè)模塊與神經(jīng)免疫過程直接相關(guān)，揭示了神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病NF-κB 炎癥信號通路模塊普遍上調(diào)，而ASD 在干擾素反應(yīng)和小膠質(zhì)細(xì)胞模塊中表達(dá)最強(qiáng)，表現(xiàn)出疾病特異性［6］。此外，NADEEM 等［7］通過分離培養(yǎng) ASD患兒T細(xì)胞，證實(shí)其T細(xì)胞中脂多糖主要受體TLR-4表達(dá)增加，激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致NADH氧化酶（NOX-2）和活性氧（ROS）產(chǎn)生過多。而T 細(xì)胞在腦部浸潤，也很可能通過神經(jīng)系統(tǒng)中大分子的過度氧化修飾而引發(fā)神經(jīng)炎癥。

2.2 ASD外周T細(xì)胞過度活化

2.2.1 T 細(xì)胞數(shù)量與激活狀態(tài)改變 1977 年STUBBS 等［8］通過植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）刺激ASD 患者淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，首次發(fā)現(xiàn)ASD中T 細(xì)胞數(shù)量減少，隨后越來越多的研究發(fā)現(xiàn)ASD中適應(yīng)性免疫應(yīng)答出現(xiàn)異常，以T 細(xì)胞為主表現(xiàn)在T細(xì)胞數(shù)量、活化狀態(tài)和相關(guān)細(xì)胞因子的改變。

ASD 外周T 細(xì)胞主要通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，早些年研究認(rèn)為ASD 患兒的易感性主要與CD4+T 細(xì)胞的減少相關(guān)，在鮮少報(bào)道的成人ASD 的檢測中，卻發(fā)現(xiàn)更多的是以CD8+T 細(xì)胞升高為主的免 疫 表 型 ，CD4/CD8 有 所 下 降［9-10］。 然 而 根 據(jù)ASHWOOD團(tuán)隊(duì)［11］的報(bào)道，與健康兒童相比，并未發(fā)現(xiàn) ASD 患兒 T 細(xì)胞或是 CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞數(shù)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，受單一時(shí)間點(diǎn)檢測局限，同時(shí)也提示ASD 免疫學(xué)表現(xiàn)的異質(zhì)性結(jié)果，但在同期研究中發(fā)現(xiàn)ASD中T細(xì)胞的激活狀態(tài)明顯發(fā)生改變。

ERICKSON等［12］發(fā)現(xiàn)ASD患者的淋巴細(xì)胞細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）激活增加，ERK 被認(rèn)為是一種絲裂原活化激酶，該細(xì)胞外信號通路激活增加是ASD 淋巴細(xì)胞過度活化的非特異性標(biāo)志。此外T細(xì)胞活化的早期標(biāo)記物HLA-DR 和CD26 在ASD 中發(fā)現(xiàn)表達(dá)增加，提示ASD患者T細(xì)胞可能存在持續(xù)激活狀態(tài)［11］。2018 年 AHMAD 等［13］通過檢測 ASD 單個(gè)核細(xì)胞中表 達(dá) HLA-DR 的 CD4+、CD8+、CD28+、CXCR4+和CCR7+細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)ASD 患兒HLA-DR、共刺激因子和作用于初始T細(xì)胞的趨化因子受體表達(dá)水平顯著升高，再次證實(shí)以上猜想。另一方面，ASD 患者T 細(xì)胞CD95 表達(dá)減少，作為細(xì)胞凋亡信號，提示ASD中可能過度活躍的T細(xì)胞凋亡減少［14］。

2.2.2 適應(yīng)性免疫反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子異常 細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞經(jīng)刺激合成、分泌的一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白。在ASD 的研究中，普遍發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞因子分泌偏向于促進(jìn)炎癥發(fā)生。最新研究證實(shí)ASD表達(dá)IFN-γ、IL-6、IL-9、IL-22和GM-CSF的CD45 細(xì)胞顯著增加，同時(shí)針對ASD 促炎因子的薈萃分析，為ASD體內(nèi)更高濃度的IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的存在提供更有力的證據(jù)［15-16］。

雖然在ASD 個(gè)體中產(chǎn)生的細(xì)胞因子表型不盡相同，但這種紊亂與其異常行為直接相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)ASD 體內(nèi)高表達(dá)的IFN-γ與其刻板行為和交流障礙密切相關(guān)［12］。同時(shí)近年來多有報(bào)道ASD 患者Th2細(xì)胞分化傾向，證實(shí)其特征性細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-13 在患者血清中升高，且具有這類特征的ASD 患兒發(fā)育評分較低［17-18］。在新生兒血斑檢測中，IL-4的升高增加了ASD的發(fā)病率，并與其嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，同時(shí)還顯示出增加智力障礙的風(fēng)險(xiǎn)［19-20］。在被確診為ASD 的母體血清和羊水中也發(fā)現(xiàn)IL-4 明顯升高，提示其在早期發(fā)育中影響胎兒乃至出生后兒童的正常發(fā)育［21-22］。

Th17 是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)獨(dú)特的CD4+T 細(xì)胞亞群，主要產(chǎn)生IL-17、IL-21 和IL-22，已經(jīng)證實(shí)在多種自身免疫病中發(fā)揮作用。ASD中Th17亞群升高，IL-17明顯高于健康對照組，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的同時(shí)，證實(shí)這些改變與ASD 異常行為呈正相關(guān)［23］。同時(shí)IL-17可穿越胎盤屏障，在嬰兒大腦中起作用，導(dǎo)致皮質(zhì)和行為異常，在早期的母體免疫激活中可能發(fā)揮重要作用［24］。ASD 患者腸道微生物還顯示出 Th17 極化傾向，合并腸道問題共病的ASD患兒Th17和IL-17顯著升高，未合并腸道問題的ASD 兒童則表現(xiàn)為以IL-13+CD4+T 細(xì)胞為特征的Th2 亞群優(yōu)勢，兩組顯示出無差異性IFN-γ 升高。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，拮抗IL-6 可以阻斷CD4+T 細(xì)胞中上調(diào)的IL-17a 信號傳導(dǎo)，提示治療的潛在靶點(diǎn)［25］。

與此同時(shí)，T 細(xì)胞活化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和不同的 T 細(xì)胞亞群，即 Th1（T-bet）、Th2（GATA-3）、Th17（RORγt）在ASD 患兒中均有增加，表明ASD 存在免疫障礙的同時(shí)，并未支持單一細(xì)胞極化傾向的論證，由此推測效應(yīng)T 細(xì)胞的普遍激活狀態(tài)可能與缺乏充分的調(diào)控機(jī)制有關(guān)［26］。

2.3 Treg 體系缺陷 Treg 是一類具有抑制T 細(xì)胞作用的調(diào)節(jié)性CD4 T 細(xì)胞亞群，主要通過分泌IL-10、TGF-β 和 IL-35 參與自身免疫耐受的建立，同時(shí)在外周不同組織中適度調(diào)節(jié)T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。

研究表明有ASD 患者出現(xiàn)Foxp3+Treg系統(tǒng)性缺陷，循環(huán)CD4+CD25highTreg 頻率顯著降低，且 Treg 減少導(dǎo)致抗炎因子IL-10和TGF-β分泌減少，與疾病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，顯示出更糟的行為變化［23，27］。此外，在Treg 細(xì)胞中發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子Helios 也出現(xiàn)改變，證實(shí)與健康兒童相比，ASD 患兒Helios mRNA 和蛋白表達(dá)水平較低，且CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、Tim-3+細(xì)胞和 CXCR3+細(xì)胞中 Helios下調(diào)，提示免疫功能障礙［28］。在最近的ASD 分組研究中也發(fā)現(xiàn)Treg和表達(dá)IL-10+的CD4+細(xì)胞有下降趨勢，表明T 細(xì)胞調(diào)節(jié)受限的共性現(xiàn)象［29］。同時(shí)在ASD 中發(fā)現(xiàn)IL-35 分泌減少，作為Treg 發(fā)揮免疫抑制作用所必需的效應(yīng)因子，IL-35的濃度水平與ASD的嗜睡、過度活動(dòng)以及不當(dāng)語言成反比［30］。有趣的是，由于Treg 和Th17共用一個(gè)前體細(xì)胞和一套TGF初始信號，正常情況分化為Treg，而炎癥狀態(tài)下分化為Th17，因此Treg 的缺失，很大程度促進(jìn)了Th17 的炎癥性激活。綜上表明Treg 體系的缺陷可能是導(dǎo)致T 細(xì)胞亞群出現(xiàn)不同程度過度激活的重要因素，進(jìn)而引發(fā)ASD的相關(guān)癥狀表現(xiàn)。

3 小結(jié)與展望

ASD 患者普遍存在免疫紊亂，以T 細(xì)胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫為例，ASD 患者可能缺少適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答機(jī)制。由于缺乏正常人調(diào)控T細(xì)胞增殖和分化的完整Treg 體系，T 細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的激活表型導(dǎo)致ASD 長期的炎癥狀態(tài)，其異常表型與ASD 患者的行為和發(fā)育密切相關(guān)，表明T 細(xì)胞在ASD 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，因此恢復(fù)其調(diào)節(jié)機(jī)制很可能有利于ASD 癥狀的改善。但是免疫失調(diào)并不是ASD 的全體現(xiàn)象，因?yàn)锳SD 異質(zhì)性強(qiáng)，遺傳背景和環(huán)境因素尚不清楚，且當(dāng)前研究又受限于樣本量小的問題，很難得出共性結(jié)果。然而存在免疫失調(diào)的ASD 患者很可能是一類特殊的亞組，研究探索的相關(guān)免疫指標(biāo)有機(jī)會(huì)用于ASD 的早期篩查和靶向治療。雖然越來越多的證據(jù)顯示免疫功能障礙在ASD 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，但其中關(guān)聯(lián)尚未可知，仍存在許多問題等待解答。

不過近些年通過免疫調(diào)節(jié)治療改善ASD 行為的報(bào)道并不少見。如應(yīng)用具有一定免疫抑制作用的抗精神病藥物利培酮，聯(lián)合塞來昔布和環(huán)氧合酶-2選擇性非甾體類抗炎藥物，改善ASD 的刻板行為和社會(huì)戒斷的有效性報(bào)道，以及通過靜注丙種球蛋白改善免疫指標(biāo)和不良行為的成功案例，都表明免疫治療這條路是可行的［31-32］。隨著動(dòng)物模型的介入，應(yīng)用不同干預(yù)措施幫助確定ASD 發(fā)展及惡化的相關(guān)機(jī)制，以及通過聚類分析進(jìn)行ASD 亞組分型的研究手段，都可以塑造未來的ASD 研究假說，為逐步揭示ASD的病理機(jī)制打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。