甘薯長喙殼菌對咯菌腈的敏感基線及咯菌腈對甘薯黑斑病的防治效果

張德勝, 喬 奇, 白瑞英, 田雨婷, 王 爽, 王永江, 趙付枚, 張振臣

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護研究所，河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北南部作物有害生物綜合治理重點實驗室，鄭州 450002)

甘薯黑斑病由甘薯長喙殼菌Ceratocystis fimbriataEllis et Halsted 侵染引起，在甘薯苗期、大田生長期和薯塊儲藏階段均可發(fā)生，每年由該病造成的產(chǎn)量損失約為5%～10%，并嚴重影響薯塊品質(zhì)，是甘薯的主要病害之一[1]。近年來，甘薯鮮食和深加工產(chǎn)業(yè)隨著其抗癌、降脂等營養(yǎng)保健價值被大眾認同而發(fā)展迅速[2]，人們對薯塊品質(zhì)的要求進一步提高，對黑斑病的防治也愈加重視。施用殺菌劑是防治甘薯黑斑病的重要手段，而我國現(xiàn)階段登記用于甘薯黑斑病的防治藥劑僅有甲基硫菌靈、代森銨、乙蒜素、大蒜素和多菌靈5 種[3]，而多菌靈對甘薯黑斑病菌抑菌效果下降[4]，且與甲基硫菌靈有交互抗性[5-6]。盡管三唑類殺菌劑三唑酮、粉唑醇、苯醚甲環(huán)唑和戊唑醇[7-10]，無內(nèi)吸作用的氟啶胺和百菌清[9,11]，以及苯并咪唑類殺菌劑噻菌靈等先后被嘗試用于對甘薯黑斑病的防治[9,12]，但因殘留、用藥方式及防治效果、以及缺乏充分試驗等原因，仍未解決生產(chǎn)中防治甘薯黑斑病的藥劑匱乏問題。為了促進合理輪換用藥、延緩抗藥性產(chǎn)生、減少黑斑病導(dǎo)致的甘薯產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降，迫切需要篩選出安全高效的新類型殺菌劑。

咯菌腈屬苯基吡咯類殺菌劑，在滲透信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中可抑制促蛋白激酶，具有非內(nèi)吸性、廣譜的特點[13]。此前先正達公司向歐盟提出，將甘薯中咯菌腈的最大殘留限量 (MRL) 值從0.05 mg/kg 提高到10 mg/kg，期望將該藥劑應(yīng)用于甘薯生產(chǎn)，2010 年已獲批準[14]。有試驗表明，含咯菌腈的混劑可顯著降低人工接種的甘薯薯塊黑斑病的發(fā)病率[9]。此外，咯菌腈對影響薯塊品質(zhì)的黑痣病有明顯的防治效果[15]，對控制甘薯儲藏期腐爛有較好的效果[16]。同時，以咯菌腈為主要成分的殺菌劑防治甘薯儲藏期病害的專利在我國已獲得授權(quán)[17]。

咯菌腈已被用于多種重要植物病害的防治[13]，本研究觀察了咯菌腈對甘薯長喙殼菌孢子萌發(fā)和芽管生長的影響，建立了甘薯長喙殼菌對咯菌腈的敏感基線，同時進行了50% 咯菌腈WP 對甘薯苗期和儲藏期黑斑病的防治效果試驗，期望為咯菌腈合理應(yīng)用于甘薯黑斑病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 收集四川、河北、山東，以及河南洛陽、鄭州、新鄉(xiāng)和南陽地區(qū)的病薯，經(jīng)表面消毒，取病健交接處薯肉置于馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基 (PCA) 中，于25 ℃培養(yǎng)。菌株純化后，回接驗證得到64 株甘薯長喙殼菌[18]，于胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基 (CA) 上4 ℃保存。

1.1.2 供試甘薯 品種為商薯19，脫毒種薯由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供。

1.1.3 供試藥劑 98%咯菌腈原藥 (fludioxonil 98% TC)，陜西恒潤化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)；50%咯菌腈可濕性粉劑 (fludioxonil 50% WP)，瑞士先正達作物保護有限公司生產(chǎn)；500 g/L 甲基硫菌靈懸浮劑 (thiophanate-methyl 500 g/L SC)，江蘇藍豐生物化工股份有限公司生產(chǎn)?？┚嬖幦苡诒?，用含0.1%吐溫-80 的蒸餾水配制成1 mg/mL的母液備用。

1.2 儀器設(shè)備

JJ-CJ-2 潔凈工作臺，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；FYL-YS-280L 恒溫箱，北京福意電器有限公司；MLS-3 750 高壓滅菌鍋，日本三洋電機株式會社；Axio Scope.A1 型正置顯微鏡，德國Carl Zeiss 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 咯菌腈對甘薯長喙殼菌分生孢子萌發(fā)及芽管生長的影響 參照凹玻片法[19]，使用菌株CFSC-01 (CGMCC No. 3.18030)，培養(yǎng)10 d 后，用無菌去離子水洗下分生孢子，過濾后得到孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至2 × 105孢子/mL (并進行促萌發(fā)處理[20])。用無菌去離子水將咯菌腈母液稀釋成系列濃度的溶液，與孢子懸浮液等量混合后，得到咯菌腈濃度為0.3、0.5、1 和2 μg/mL 的含孢子溶液。使用移液器將上述溶液滴在凹玻片上，25 ℃黑暗保濕培養(yǎng)3、5、7、9 和20 h，進行鏡檢和照相。

1.3.2 甘薯長喙殼菌對咯菌腈的敏感基線建立

分別采用凹玻片法[19]和平皿法[21]測定64 株甘薯黑斑病菌對咯菌腈的敏感性。測定其對分生孢子萌發(fā)的抑制活性時，參照1.3.1 節(jié)的方法。配制含咯菌腈的孢子懸浮液，咯菌腈的質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.5、1、2 和3 μg/mL，以含等量溶劑和吐溫-80 的孢子懸浮液為空白對照。當(dāng)空白對照孢子萌發(fā)率達到90% 以上時，采用血球計數(shù)板拍照計數(shù)法統(tǒng)計各處理孢子萌發(fā)情況，計算萌發(fā)抑制率。測定咯菌腈對菌絲生長的抑制活性時，配制含咯菌腈的PCA 平板，藥劑質(zhì)量濃度和空白對照的設(shè)置同前，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算各處理菌絲生長抑制率。計算藥劑對各菌株的抑制中濃度 (EC50) 并比較兩組EC50值間的差異。

1.3.3 咯菌腈浸苗對苗期黑斑病的防治效果 選擇用人工接種病薯育苗的苗床為病圃，試驗前清除所有病薯。以50% 咯菌腈WP 為供試藥劑，以500 g/L 甲基硫菌靈SC 為對照藥劑。共4 個處理：咯菌腈藥液按有效成分250 和500 mg/L分別浸苗3 h；對照藥劑甲基硫菌靈藥液按有效成分500 mg/L 浸苗6 h；設(shè)不浸苗的空白對照處理。每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)扦插100 株健康薯苗，小區(qū)隨機區(qū)組排列。浸苗參照張德勝等方法[11]，于定植24 d 后隨機拔取50 株調(diào)查發(fā)病情況及50 株的總鮮重。

1.3.4 咯菌腈對甘薯儲藏期黑斑病的防治效果 (按薯塊整體分級計算) 當(dāng)年6 月份將患有黑斑病的薯塊打碎后均勻撒入大田接種，整地起壟后移栽薯苗，生產(chǎn)的薯塊用于儲藏期試驗。收獲后，選取大小均勻、外觀光滑無損傷的薯塊裝框，每框為1 個重復(fù)，大約100 塊薯塊。試驗設(shè)4 個處理，分別為用50% 咯菌腈WP 有效成分250 和500 mg/L 藥液、500 g/L 甲基硫菌靈SC 有效成分500 mg/L 藥液和清水浸薯塊對照處理，每處理3 次重復(fù)。將整框薯塊浸入藥劑溶液10 min，期間將框在藥液中上下拉動3～5 次。處理結(jié)束后將框抬出控水晾干，入窖儲藏35 d，調(diào)查薯塊發(fā)病情況。試驗分別于2019 和2020 年進行。

1.3.5 咯菌腈在薯塊儲藏期的殘留量測定 選取表皮光滑且無損傷的薯塊，裝框后使用咯菌腈藥液浸薯塊 (方法同1.3.4 節(jié))?？┚嫠幰河行С煞仲|(zhì)量濃度分別為250、500 和750 mg/L，不設(shè)重復(fù)。分別于儲藏60 和90 d 時，每個濃度處理隨機取2 kg 薯塊，送至農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)品及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心 (杭州) 進行殘留檢測，殘留標準查閱GB 2763—2021[22]。

應(yīng)用DPS 8.01 專業(yè)版軟件計算藥劑對甘薯長喙殼菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的毒力回歸方程、EC50，進行兩組數(shù)據(jù)的方差齊性及顯著性檢驗，多重比較采用新復(fù)極差法進行[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 咯菌腈對甘薯長喙殼菌分生孢子萌發(fā)及芽管生長的影響

通過顯微鏡定時觀察發(fā)現(xiàn)，清水對照處理中分生孢子萌發(fā)早，萌發(fā)率高，培養(yǎng)9 h 萌發(fā)率接近100%，芽管長度數(shù)倍于孢子本身長度?？┚?.5 μg/mL 的處理培養(yǎng)9 h，約31% 的分生孢子未萌發(fā)，萌發(fā)的孢子芽管較少長于孢子本身長度?？┚? μg/mL 的處理培養(yǎng)9 h，僅有部分分生孢子處在萌芽狀態(tài)，且芽管只表現(xiàn)為小的突起?？┚? μg/mL 的處理直至培養(yǎng)20 h，分生孢子完全不萌發(fā) (圖1)。結(jié)果表明，咯菌腈對甘薯長喙殼菌分生孢子的萌發(fā)有顯著抑制作用，且隨藥劑質(zhì)量濃度的加大而越加明顯。

圖1 咯菌腈對甘薯長喙殼菌分生孢子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of fludioxonil on conidial germination of C. fimbriata

培養(yǎng)9 h 后，清水對照處理中萌發(fā)的芽管基本呈直線生長，彎曲少，無分枝?？┚?.3 μg/mL的處理中，部分孢子萌發(fā)的芽管有分枝，彎曲幅度加大?？┚?.5 μg/mL 的處理中，部分孢子萌發(fā)的芽管有分支，出現(xiàn)了扭曲生長的現(xiàn)象 (圖2)，說明咯菌腈對甘薯長喙殼菌分生孢子芽管生長有顯著影響，主要表現(xiàn)為過早出現(xiàn)分支，生長扭曲，不能直線伸長。

圖2 咯菌腈對甘薯長喙殼菌菌絲生長的影響Fig.2 Effects of fludioxonil on mycelium growth of C. fimbriata

2.2 甘薯長喙殼菌對咯菌腈的敏感基線

利用凹玻片法測定了64 株甘薯長喙殼菌分生孢子萌發(fā)對咯菌腈的敏感性，其EC50的分布范圍為0.20～0.99 μg/mL，平均值為 (0.52 ± 0.16) μg/mL，敏感性頻率分布呈單峰曲線，正態(tài)性檢驗 (Shapiro-Wilk 法)P= 0.33 ＞ 0.05，符合正態(tài)分布 (圖3)，可以作為甘薯長喙殼菌分生孢子萌發(fā)對咯菌腈的敏感基線。

利用平皿法測定了64 株甘薯長喙殼菌菌絲生長對咯菌腈的敏感性，其EC50的分布范圍為0.17～0.31 μg/mL，平均值為 (0.24 ± 0.03) μg/mL，敏感性頻率分布呈單峰曲線，正態(tài)性檢驗 (Shapiro-Wilk法)P= 0.32 ＞ 0.05，符合正態(tài)分布 (圖3)，可以作為甘薯長喙殼菌菌絲生長對咯菌腈的敏感基線。

圖3 甘薯長喙殼菌孢子萌發(fā) (A) 和菌絲生長 (B) 對咯菌腈的敏感性頻率分布Fig.3 Frequency distribution of sensitivity on conidial germination (A) and mycelium growth (B) of C. fimbriata to fludioxonil

兩種方法對相同菌株測定得到的兩組EC50值均呈正態(tài)分布，經(jīng)方差齊性檢驗 (P＜0.05，非齊性)，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后采用t檢驗法比較兩組EC50值，P＜0.01，表明兩組數(shù)據(jù)差異極顯著。咯菌腈對菌絲生長的抑制作用顯著強于對分生孢子萌發(fā)的抑制作用。

2.3 咯菌腈對苗期黑斑病的防治效果

由表1 可知，50% 咯菌腈WP 500 mg/L 對苗期黑斑病的防治效果為90.24%，顯著高于對照藥劑500 g/L 甲基硫菌靈SC 的防治效果。50% 咯菌腈WP 250 mg/L 的防治效果為82.93%，略高于對照藥劑，但無顯著差異。50% 咯菌腈WP 250、500 mg/L 和清水對照處理的50 株薯苗總鮮重分別為2.05、2.08 和1.96 kg，3 處理間無顯著差異，但顯著低于對照藥劑處理 (總鮮重2.27 kg)。

表1 咯菌腈對苗期黑斑病的防治效果Table 1 The control efficacy of fludioxonil to black rot of sweet potato seedlings

2.4 咯菌腈對儲藏期黑斑病的防治效果

由表2 可知，2019 年50% 咯菌腈WP 500 mg/L對儲藏期黑斑病的防治效果為84.41%，顯著高于對照藥劑500 g/L 甲基硫菌靈SC。50% 咯菌腈WP 250 mg/L 的防治效果為63.43%。2020 年50%咯菌腈WP 250 和500 mg/L 對儲藏期黑斑病的防治效果分別為68.03%和82.30%，均顯著高于對照藥劑。

表2 咯菌腈對儲藏期黑斑病的防治效果Table 2 The control efficacy of fludioxonil to black rot of sweet potato in storage

2.5 儲藏期甘薯塊中咯菌腈的殘留量

檢測結(jié)果 (表3) 表明，儲藏60 d 后50% 咯菌腈WP 250～750 mg/L 處理在甘薯塊中的殘留量為1.11～2.39 mg/kg，儲藏90 d 后為0.54～1.68 mg/kg，符合我國甘薯農(nóng)藥殘留限量標準[22]。

表3 施用50% 咯菌腈WP 后甘薯塊中的殘留量及相關(guān)標準Table 3 Residual quantity of fludioxonil 50% WP in root tuber of sweet potato and standard of MRL and ADI

3 結(jié)論與討論

本研究觀察了甘薯長喙殼菌分生孢子在不同濃度的咯菌腈藥液中萌發(fā)及芽管伸長的情況。與空白對照處理相比，咯菌腈處理使甘薯長喙殼菌分生孢子萌發(fā)受到抑制，部分萌發(fā)的芽管過早出現(xiàn)分支，并且出現(xiàn)了扭曲生長的現(xiàn)象，且當(dāng)咯菌腈的質(zhì)量濃度增加時，芽管的扭曲程度隨之增加。芽管過早出現(xiàn)分支的現(xiàn)象與徐建強等報道的咯菌腈可引起牡丹葉片黑斑、黃斑病菌芽管在萌發(fā)時就開始產(chǎn)生分支的結(jié)果類似[24]，咯菌腈引起甘薯長喙殼菌芽管的扭曲生長與咯菌腈對黃瓜靶斑病菌菌絲生長的影響類似[25]，但并未見咯菌腈引起油菜核盤菌和小麥赤霉病菌菌絲末端分支增多的現(xiàn)象[26-27]。不同病原菌芽管生長受咯菌腈抑制的表現(xiàn)存在差異。敏感性檢測結(jié)果表明，咯菌腈對甘薯長喙殼菌的分生孢子萌發(fā)和菌絲生長均有明顯的抑制作用，且對菌絲生長的抑制作用強于對分生孢子萌發(fā)的抑制作用，這與文獻報道結(jié)果一致[24,28]。

土壤帶菌情況下，用50% 咯菌腈WP 不同濃度藥液浸苗，對苗期甘薯黑斑病的防治效果顯著高于同濃度的500 g/L 甲基硫菌靈SC，即使劑量減半也表現(xiàn)出良好的防治效果；咯菌腈WP 對儲藏期甘薯黑斑病的防治效果亦顯著高于同濃度的甲基硫菌靈，且兩年試驗的防效結(jié)果穩(wěn)定。用咯菌腈WP 250～750 mg/L 處理薯塊，在儲藏60 和90 d 的殘留量均低于我國規(guī)定的MRL 值。以上結(jié)果表明，使用咯菌腈防治甘薯黑斑病頗具可行性。鑒于黑斑病在甘薯的整個生育期及儲藏期均能發(fā)生且侵染途徑復(fù)雜，還需針對甘薯不同生長階段黑斑病的發(fā)病特點，進一步開展咯菌腈防治試驗。探索將咯菌腈與其他殺菌劑進行復(fù)配，篩選增效組合，促進咯菌腈應(yīng)用于甘薯生產(chǎn)。

浸苗試驗中，清水對照處理和甲基硫菌靈處理定植24 d 病株率分別為27.33%和6.00%，對應(yīng)的折合株鮮重分別為39.2 和45.4 g；已報道的相同浸苗方法試驗中，空白對照處理和甲基硫菌靈處理定植21 d 病株率分別為81.3%和13.3%，對應(yīng)的株鮮重為25.0 和60.1 g[11]，發(fā)病率高時，株鮮重降低更明顯，表明黑斑病對薯苗生長有明顯的抑制作用，發(fā)病率會影響薯苗平均鮮重的變化。本次浸苗試驗整體發(fā)病較輕，各處理間鮮重變化較小，以及不同扦插莖段生長勢的差別，可能是試驗中咯菌腈雖然防治效果最顯著但薯苗鮮重卻未表現(xiàn)最高的原因。后續(xù)試驗中將進一步研究咯菌腈對甘薯植株長勢和產(chǎn)量的影響。

隨著咯菌腈在多種作物上的長期使用，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)國內(nèi)黃瓜、番茄和草莓上產(chǎn)生了灰霉病菌的抗性菌株[29-30]，國際上在2010 年以前已有咯菌腈抗性菌株出現(xiàn)的報道[31]。推廣防治甘薯黑斑病前，建立該病原菌對咯菌腈的敏感基線，對明確該菌的敏感性水平，檢測、監(jiān)測抗藥性有重要意義。本次試驗分離的菌株來自多省，測定咯菌腈抑制分生孢子萌發(fā)時，EC50值最大相差4.95 倍；抑制菌絲生長時，EC50值最大相差1.74 倍，菌株間差異水平低，建立的敏感基線可靠性較高，有實際的參考價值。鑒于部分甘薯產(chǎn)區(qū)的菌株未采集到，后續(xù)研究中將進一步補充，完善敏感基線。

總之，咯菌腈對甘薯長喙殼菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長均有較高的毒力，防治甘薯苗期和儲藏期黑斑病均有較好的防治效果，薯塊儲藏60 和90 d的殘留量符合MRL 標準，具有在甘薯生長期和儲藏期防控黑斑病的潛力，有較好的應(yīng)用前景。