液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測定谷物中6種低毒殺菌劑的殘留量

朱將偉,趙 燕,尹 君

(1.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,上海 201202; 2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,上海 200233)

使用殺菌劑是防治作物病害的一種經(jīng)濟有效的方法,但殺菌劑在土壤、水體以及農(nóng)作物上的殘留仍然存在較大隱患[1]。許多殺菌劑的抑菌譜呈廣譜性,在殺滅病原微生物的同時也會抑制有益菌的生長,導(dǎo)致潛在的生態(tài)風(fēng)險。另外,許多目前正廣泛使用的殺菌劑雖然對人畜等哺乳動物毒性較低,但對于其他生物可能有較高的毒性,例如,苯醚甲環(huán)唑與戊唑醇屬低毒殺菌劑,但它們對魚類有較高的毒性,如果以殘留有苯醚甲環(huán)唑或戊唑醇的谷物作為原材料制作魚類飼料將會有較大的風(fēng)險,因此對谷物或其他農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)用殺菌劑殘留量進行全面監(jiān)測就顯得十分重要[2-3]。

目前,殺菌劑的檢測方法種類繁多,主要可歸納為3大類:免疫檢測法、色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。免疫檢測法靈敏度較高,但穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較差,多用于快速檢測;色譜法應(yīng)用廣泛,但是當同時檢測的化合物數(shù)量越多時,其對色譜分離的要求就越高,耗時也越久,另外,限于色譜上所連接的常規(guī)檢測器的局限性,陽性結(jié)果通常需要再次確認;而色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度高、選擇性強,檢測結(jié)果無需再次確認[4]。

烯酰嗎啉、嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、咪鮮胺和戊唑醇等6種殺菌劑是目前在糧食作物生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的殺菌劑,其殘留檢出率也相對較高。而目前用于殺菌劑檢測的國家標準(或行業(yè)標準)只能用于一種或者一類殺菌劑的測定,例如,GB 23200.49-2016《食品安全國家標準 食品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》僅用于食品中苯醚甲環(huán)唑殘留量的測定,而GB 23200.54-2016《食品安全國家標準 食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》只能用于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的測定。

針對上述問題,本工作用乙腈-二氯甲烷體系提取谷物樣品中的殘留殺菌劑,并經(jīng)C18固相萃取柱凈化,采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時測定烯酰嗎啉、嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、咪鮮胺和戊唑醇等6種殺菌劑的殘留量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260/6430型液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;OA-SYS型24位氮吹儀(帶控溫);HY-4型可調(diào)速多用途振蕩器;Supelclean LC-18 C18固相萃取柱(100 mg/3 mL),Oasis?HLB固 相 萃 取 柱(200 mg/6 mL),弗羅里硅土固相萃取柱(500 mg/6 mL)。

混合標準溶液1:取適量的6種殺菌劑標準品,用甲醇溶解并配制成質(zhì)量濃度均為5.00 mg·L-1的混合標準溶液1。同法配制質(zhì)量濃度均為1.00 mg·L-1的混合標準溶液2。

殺菌劑烯酰嗎啉、嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、咪鮮胺、戊唑醇標準品的純度均大于99.0%;乙腈、甲醇、二氯甲烷和甲酸均為色譜純,其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent C18色 譜 柱(100 mm×3.0 mm,1.8μL);柱溫30℃;進樣量3.0μL;流量0.3 mL·min-1;流動相A為含0.1%(體積分數(shù),下同)甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～0.5 min時,B為50%;0.5～6.0 min時,B由50%升至90%,保持2.0 min;8.0～11.0 min時,B由90%升至95%;11.0～13.0 min時,B由95%降至50%,保持2.0 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

對于觀察組，全身麻醉，患者取截石位行患側(cè)輸尿管逆行插入F6導(dǎo)管并留置導(dǎo)尿管。取俯臥位后。針對患者的腹部施以墊高處理，B超引導(dǎo)下完成目標腎盞穿刺操作，通過穿刺針鞘，置入J型導(dǎo)絲，將患者皮膚切開后，順導(dǎo)絲針對患者的腎造瘺口展開擴張操作，完成后置入F18一次性可撕開鞘。鞘內(nèi)置入F15 Wolf腎鏡，對結(jié)石進行明確后開始鈥激光碎石操作并取石，能量設(shè)置2.0 J，頻率20 Hz。手術(shù)后輸尿管內(nèi)置入F7輸尿管支架管，腎盂內(nèi)留置F16造瘺管。

電噴霧離子(ESI)源,正離子模式;干燥氣溫度325℃,干燥氣流量10 L·min-1;霧化壓力275.8 k Pa;采用多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描;其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,軟件自動選擇響應(yīng)高的子離子用于定量。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理

取1 000 g谷物樣品,人工去除谷物中肉眼可見的雜質(zhì),粉碎、混勻后備用。

準確稱取10 g已粉碎的谷物樣品至250 mL窄口玻璃瓶中,加入100 mL乙腈,連續(xù)振蕩30 min,將乙腈提取液過濾至100 mL濃縮瓶中,在40℃水浴中濃縮至約5 mL。取100 mL 4 g·L-1氯化鈉溶液分3次溶解濃縮液,然后全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,再用50 mL二氯甲烷振蕩提取10 min(重復(fù)1次)。有機相層經(jīng)預(yù)先裝有無水硫酸鈉的漏斗過濾,濾液收集在濃縮瓶中,于40℃水浴中減壓濃縮至近干,殘渣用5 mL甲醇溶解,過C18固相萃取柱(C18固相萃取柱先用10 mL甲醇淋洗),用5 mL甲醇洗脫,將收集的全部洗脫液在氮吹儀下吹干[5-7],殘余物用50%(體積分數(shù),下同)乙腈溶液定容至1 mL,用0.2μm濾膜過濾后按照儀器工作條件測定。

1.3.2 定性分析

相關(guān)樣品在相同的測定條件下進行分析時,若樣品中檢出色譜峰的保留時間與某種殺菌劑標準品的保留時間一致,而且在扣除背景后所選擇的兩對離子對及豐度比也一致,即可認為該樣品中殘留這種殺菌劑[8-9]。

1.3.3 定量分析

試驗采用基質(zhì)匹配的混合標準溶液系列進行測定,以減小基質(zhì)對定量分析的影響,外標法定量。取5 mL經(jīng)過柱洗脫的空白基質(zhì)溶液5份,氮吹至0.5 mL以下,分別加入適量的混合標準溶液1和混合標準溶液2,用50%乙腈溶液定容,配制成質(zhì)量濃度為1.00,10.00,50.00,100.00,1 000.0μg·L-1的基質(zhì)匹配的混合標準溶液系列,現(xiàn)配現(xiàn)用。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

在殺菌劑殘留分析中常以乙腈、乙腈-二氯甲烷、二氯甲烷-甲醇、甲醇-丙酮等體系作為提取溶劑。試驗比較了上述4組提取溶劑的提取效果。結(jié)果表明:以乙腈-二氯甲烷體系作為提取溶劑時,所得目標物的回收率均在90.0%左右,并且提取物中雜質(zhì)比較少;使用其他3種提取溶劑時,所得目標物的回收率波動較大,提取物中的雜質(zhì)也相對較多,會影響后續(xù)凈化處理。因此,試驗選擇乙腈-二氯甲烷體系作為提取溶劑。

2.2 固相萃取柱的選擇

2.3 流動相的選擇

在前期試驗中已經(jīng)充分認識到在流動相(水相)中添加適量的甲酸和甲酸銨的必要性。甲酸能有效促進離子化,甲酸銨能改善峰形和調(diào)節(jié)離子化水平;甲酸的體積分數(shù)若高于0.1%時會提高基線噪聲,并造成靈敏度下降,甲酸銨的濃度若高于3 mmol·L-1時對基線的穩(wěn)定性也會產(chǎn)生負面影響。因此,流動相中水相選擇含有0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液。

試驗進一步比較了乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液、甲醇-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液兩組流動相對目標物的分離效果。結(jié)果表明,采用乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液為流動相時,其質(zhì)譜響應(yīng)值較甲醇-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液為流動相時高17%～30%,且峰形與色譜分離效果均較好。因此,試驗最終選用乙腈-含0.1%甲酸的3 mmol·L-1甲酸銨溶液作為流動相。圖1為6種殺菌劑的總離子流色譜圖。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chro matogra m

2.4 工作曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定基質(zhì)匹配的混合標準溶液系列,以響應(yīng)更高的子離子作為定量子離子,以各殺菌劑的定量子離子響應(yīng)值對其相應(yīng)質(zhì)量濃度繪制工作曲線。結(jié)果表明,各殺菌劑的質(zhì)量濃度在1.00～1 000.0μg·L-1內(nèi)與其定量子離子響應(yīng)值呈線性關(guān)系,其他線性參數(shù)見表2。當被測樣品中殺菌劑質(zhì)量濃度超出上述線性范圍時,可進行稀釋或濃縮處理后再測定。

按3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)與檢出限Tab.2 Linearity par ameters and detection limits

2.5 精密度與回收試驗、方法比對

對兩組空白谷物樣品進行加標回收試驗,計算回收率及測定值的相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表3。同時,按照我國現(xiàn)行國家標準或行業(yè)標準(GB 23200.46-2016《食品安全國家標準 食品中嘧霉胺、嘧菌胺、腈菌唑、嘧菌酯殘留量的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法》用于測定嘧霉胺;GB 23200.49-2016用于測定苯醚甲環(huán)唑;SN/T 2917-2011《出口食品中烯酰嗎啉殘留量檢測方法》用于測定烯酰嗎啉;SN/T 0519-2010《進出口食品中丙環(huán)唑殘留量的檢測方法》用于測定丙環(huán)唑;NY/T 1456-2007《水果中咪鮮胺殘留量的測定 氣相色譜法》用于測定咪鮮胺;SN/T 1952-2007《進出口糧谷中戊唑醇殘留量的檢測方法 氣相色譜-質(zhì)譜法》用于測定戊唑醇)對這兩組加標谷物樣品中各殺菌劑的殘留量進行測定,比對結(jié)果見表3。

表3 精密度與回收試驗結(jié)果以及不同方法比對結(jié)果(n＝5)Tab.3 Results of tests for precision and recovery,and comparison results of different methods(n＝5)

結(jié)果表明:各殺菌劑的回收率為87.9%～96.5%,測定值的RSD為2.7%～6.8%;本法所得測定結(jié)果與標準方法所得結(jié)果基本相當(P＞0.05,無顯著性差異)。說明方法準確度高、精密度好。

本工作將谷物樣品中的殘留殺菌劑先用乙腈-二氯甲烷體系進行提取,再經(jīng)C18固相萃取柱凈化,采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法進行分析,能對谷物樣品中的多種殺菌劑殘留進行準確定性和定量檢測,其靈敏度和準確度均較好。方法較GB 23200.46-2016、GB 23200.49-2016以 及SN/T 2917-2011等標準方法更為簡便,耗時也更短,并可同時測試多種不同類型的殺菌劑,各項技術(shù)參數(shù)也都能滿足測定工作的要求。