蠟塊脫鈣法在常規(guī)病理技術(shù)制片中對(duì)組織染色效果及切片優(yōu)良率的價(jià)值

林秋月 黃漢興 吳海燕

（福建省莆田市第一醫(yī)院，福建 莆田 351100）

隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，切片技術(shù)通過不斷優(yōu)化改進(jìn)而逐漸完善起來?，F(xiàn)代切片技術(shù)不僅是病理檢驗(yàn)技術(shù)中不可缺少的構(gòu)成部分，而且已經(jīng)成為生物形態(tài)學(xué)微觀結(jié)構(gòu)研究的一個(gè)重要方向。病理技術(shù)制片主要過程有取材、固定、脫水、包埋、切片、染色和封固。其中切片為關(guān)鍵點(diǎn)，切片質(zhì)量直接會(huì)影響檢驗(yàn)準(zhǔn)確性。在常規(guī)病理技術(shù)制片中，經(jīng)常出現(xiàn)一些經(jīng)過處理的蠟塊，如骨組織脫鈣不全、小灶或者灶狀鈣化灶等。骨組織是一種堅(jiān)硬的結(jié)締組織，采取常規(guī)方法極容易發(fā)生脫鈣不全狀況，導(dǎo)致切片存在切痕明顯、染色不均勻、切片不完整等情況，直接影響切片優(yōu)良率，影響診斷效果。所以需要積極采取有效方法，促使能夠全面去除鈣質(zhì)，保證染色效果和切片優(yōu)良率。蠟塊脫鈣法利用脫鈣液透過石蠟，能夠有效清除骨組織和鈣化灶、砂礫體內(nèi)鈣質(zhì)，并且不會(huì)溶解石蠟。蠟塊脫鈣法具有較高安全性，并且操作簡(jiǎn)單，過程中不用換脫鈣液。有學(xué)者認(rèn)為，蠟塊脫鈣法在常規(guī)病理技術(shù)制片中能夠保證組織染色效果，保證切片優(yōu)良率[1]。鑒于此，此次研究則分析蠟塊脫鈣法在常規(guī)病理技術(shù)制片中對(duì)組織染色效果及切片優(yōu)良率的價(jià)值，詳細(xì)內(nèi)容見下文。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇我院2020年6月至2021年6月接收的100塊脫鈣不足、鈣化灶以及砂礫體的蠟塊按照隨機(jī)數(shù)字表方式進(jìn)行分組，50塊采取常規(guī)脫鈣法，設(shè)定為對(duì)照組，50塊采取蠟塊脫鈣法，設(shè)定為觀察組，分析兩組方法產(chǎn)生的效果差異。此次研究?jī)x器和設(shè)備：全自動(dòng)脫水機(jī)、全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)、輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)、全自動(dòng)染色、全自動(dòng)封片機(jī)。脫鈣液配置：甲醛30 mL，甲酸20 mL，鹽酸30 mL，蒸餾水20 mL。把甲醛、甲酸以及鹽酸依次加入到蒸餾水中，搖勻混合。本研究不違反國家法律法規(guī)，符合醫(yī)學(xué)倫理原則。

1.2 方法 將接收的100塊脫鈣不足、鈣化灶以及砂礫體的蠟塊按照隨機(jī)數(shù)字表方式分組，50塊采取常規(guī)脫鈣法，作為對(duì)照組；50塊采取蠟塊脫鈣法，作為觀察組。對(duì)照組直接將蠟塊進(jìn)行切片處理。觀察組將蠟塊上多余的蠟清理干凈，然后將蠟塊最大面顯露出來，放置脫鈣液里，和脫鈣液有效接觸，1 h后取出來后，清除依附的脫鈣液。兩組切片后，利用全自動(dòng)染色機(jī)染色等操作，再利用顯微鏡觀察。

1.3 觀察指標(biāo) ①脫鈣終點(diǎn)判斷：以蠟塊組織面鈣化部分全面顯露，能夠切出完整的切片。②切片染色判斷：光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)著色清晰、層次分明、紅藍(lán)適度，則判定為染色滿意。③切片質(zhì)量判斷：切片外觀完整、平整、未發(fā)現(xiàn)空洞、厚薄均勻判斷未組織結(jié)構(gòu)完整。④切片優(yōu)良率判斷：10分（切片完整，貼片合適）；20分（切片厚度均勻，無污染）；30分（無固縮、龜裂碳化細(xì)胞核）；10分（封膠適當(dāng)，玻片整潔）；10分（未發(fā)現(xiàn)皺褶）；10分（無刀痕）；5分（號(hào)碼清晰，字體端正）。分值界為80分，80分以上為優(yōu)，60～80分為良好，60分以下為差。優(yōu)良率=（優(yōu)+良）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用（）表示，組間比較行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)；P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析兩組蠟塊切片優(yōu)良率 觀察組切片優(yōu)良率明顯較高，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 兩組蠟塊切片優(yōu)良率比較[n（%）]

2.2 分析兩組組織結(jié)構(gòu) 對(duì)照組蠟塊切片后組織結(jié)構(gòu)多數(shù)存在殘缺現(xiàn)象，只有29塊較完整，完整率58.00%。觀察組蠟塊切片后組織結(jié)構(gòu)完整有48塊，完整率高達(dá)96.00%。觀察組蠟塊切片后組織結(jié)構(gòu)完整率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=40.768，P=0.001）。

2.3 分析兩組染色情況和染色滿意度 觀察組經(jīng)過脫鈣法脫鈣后制作的切片細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，鈣化灶呈現(xiàn)藍(lán)色，沙礫體呈現(xiàn)紫紅色，染色均一，效果滿意度。觀察組染色不均一。觀察組染色滿度94.00%，對(duì)照組染色滿意度80.00%。觀察組染色情況較好，染色滿意度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.665，P=0.003）。

3 討論

隨著醫(yī)療水平的不斷提高，生物染色技術(shù)不斷更新和發(fā)展。采取組織切片染色方法，能夠反映不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)以及成分之間的變化[2]。組織制片及組織染色技術(shù)在醫(yī)療科學(xué)領(lǐng)域里占有重要地位，是教學(xué)、醫(yī)學(xué)和科研中不可缺少的一個(gè)組成部分。組織學(xué)切片所需的組織，除一部分可取自人體外（如外科手術(shù)活檢組織或尸檢的新鮮材料），大部均取自動(dòng)物。其過程包括組織（細(xì)胞）取材、固定、包埋、切片、染色、封片。取材是制作切片程序中關(guān)鍵步驟。取材不當(dāng)會(huì)直接影響患者病理診斷和科研工作效果。組織標(biāo)本的選用極其重要[2]。隨意的切取組織制作組織切片，病理檢驗(yàn)效果往往無法達(dá)到滿意評(píng)價(jià)。常規(guī)病理技術(shù)制片步驟為：首先的取材，選擇的材料越新鮮越好。人體組織和機(jī)體分離，動(dòng)物組織死亡后立即固定，保證原始形態(tài)的結(jié)構(gòu)[3]。選擇的材料大小要按照相關(guān)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，促使固定液能夠快速并且平均深入到組織中。由于不同材料生產(chǎn)目的也有所不同，組織體積也會(huì)不同。外部病理檢查和科學(xué)研究過程中，組織大小可以縮小0.1 cm左右，這樣能夠縮短脫水實(shí)踐和透明度。設(shè)計(jì)教學(xué)切片可以厚度保持在0.3～0.5 cm，這樣以便于制作更多的學(xué)習(xí)板。采取切割物品時(shí)候需要保證鋒利度，切割時(shí)不能將組織夾太緊，不然會(huì)擠壓引起組織和細(xì)胞損壞。選擇的材料需要保證根據(jù)自然解剖位置，不同病理部位進(jìn)行準(zhǔn)確采擇。最后根據(jù)每個(gè)器官組織形態(tài)，生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行切割?？v向和橫截面一般指示組織形狀和結(jié)構(gòu)，如長(zhǎng)管的器官需要橫向。保持組織原始狀態(tài)，新的組織會(huì)在一定程度上變化，可能會(huì)變多可能會(huì)變少，所以需要保證盡量保證組織原始狀態(tài)。固定中小塊組織固定方法是最常見并且也是經(jīng)常應(yīng)用的方法。在機(jī)體或者動(dòng)物的體內(nèi)采取的小組織需要及時(shí)置入液體固定劑里。樣品和固溶液的比例為1:（4～20）。組織塊不能太厚不能太大，不然會(huì)導(dǎo)致熔體無法迅速滲出。注射、灌注固定方法，在一些較難穿透的固定液或者組織過大，動(dòng)物全部器官或者身體必須作為整體固定。利用這種方法，能夠?qū)⒐潭黧w全部注射到血管中，并分散到組織和機(jī)體，達(dá)到完全固定的效果[4]。蒸汽固定方法是利用于太小，太厚的組織樣品中。脫水意思是樣品固定和洗滌后，組織中剩余水量較多，需要更換組織中水平。為確保能夠有效去除水平，采取石蠟和膠水。含水織物和石蠟，焦纖維黏合劑和其他包裝材料不容，脫氫是不同濃度的乙醇。丙醇也是脫水劑，也具有較高的脫水能力。但是脫水能力較高，對(duì)組織也有較顯著的影響。在教學(xué)中一般不采用這種方法。浸蠟、包埋意思是石蠟浸入組織中，取代組織中含有的透明劑。將浸蠟后的組織置于融化的固體石蠟中，石蠟?zāi)毯螅M織即被包在其中。切片是根據(jù)組織尺寸，從組織邊緣切下殘余蠟，不然會(huì)導(dǎo)致組織收縮。將修復(fù)后的蠟塊安置在金屬或者木蠟框架上，將切割刀片安裝在切割臺(tái)中，擰緊固定螺釘，避免在此過程中振動(dòng)。保持適當(dāng)厚度，做好切割機(jī)厚度調(diào)節(jié)，根據(jù)需要選擇厚度。利用鑷子提起蠟條，放置在40～45 ℃水中。在水張力和溫度作用下，蠟條會(huì)輕微起皺，自然光滑。在恒溫水面，將圓盤鋪平后，將蠟塊移到玻璃載片中段，將剩下的水倒在玻璃載片上，放置在60～65 ℃的恒溫箱內(nèi)進(jìn)行烘烤30 min，去蠟。染色和封片，在染色過程中，首先應(yīng)保證各種試劑的濃度、體積，避免有沉淀[5]。用Harris蘇木精液時(shí)，染色前要先用一張濾紙除去液體表面的結(jié)晶，以免污染切片。脫蠟徹底，不然易出現(xiàn)嗜堿性片狀模糊，毛玻璃樣現(xiàn)象，染色不均。嚴(yán)格控制乙醇梯度時(shí)間，以免水分過快進(jìn)入細(xì)胞，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響染色效果。切片脫水后，進(jìn)行二甲苯時(shí)發(fā)生白色不透明情況，脫水不完全，需要及時(shí)更換乙醇。重新徹底脫水與透明。脫水完全的切片十分干凈，透亮，有利于觀察。封片樹膠濃度盡量適當(dāng)，太稀，易出現(xiàn)大氣泡，影響觀片效果。樣本的質(zhì)量取決于初始處理的準(zhǔn)確性和效率，包括固定、脫水、插入等。選擇所需的工具類型和適當(dāng)?shù)墓ぞ摺４送?，操作員的豐富經(jīng)驗(yàn)對(duì)切片質(zhì)量保證至關(guān)重要。操作員需要熟悉切片機(jī)的工作原理，消除常見錯(cuò)誤并消除一些潛在影響因素[6]。

骨髓里存在較多骨髓細(xì)胞，可以激發(fā)各種血細(xì)胞到血液。骨組織中有較多鈣化細(xì)胞和間質(zhì)和數(shù)種細(xì)胞構(gòu)成，鈣化細(xì)胞間質(zhì)又為骨基質(zhì)，骨基質(zhì)有機(jī)和無機(jī)成分能夠有效融合，導(dǎo)致骨質(zhì)十分堅(jiān)硬，無法直接切割。脫鈣不全切片容易被撕碎，損壞切片。在進(jìn)行病理切片時(shí)，骨組織存在較多鈣鹽沉積，而結(jié)締組織又十分堅(jiān)硬，導(dǎo)致切片較困難。因此我們首先要清除鈣化灶鈣質(zhì)里面的鈣鹽，保證組織能夠變軟，然后才能有效切片。當(dāng)前，在常規(guī)病理制片技術(shù)工作中，尋找一種理想脫鈣方法，不僅要保證切片染色效果，還要保證組織結(jié)構(gòu)不能被破壞，完整保證組織抗原和超微結(jié)構(gòu)保存完好，是當(dāng)前病理技術(shù)重點(diǎn)解決問題。當(dāng)前多數(shù)病理實(shí)驗(yàn)室采取的傳統(tǒng)組織塊脫鈣方法，主要是采取材料固定后組織塊放入到稀釋溶液中進(jìn)行脫鈣，由于所用脫鈣液種類不一樣，所需要的鈣時(shí)間也不一樣，一般需要4～7 d，在不同程度上影響了對(duì)骨組織診斷和研究，并且還存在拖延制片時(shí)間問題，嚴(yán)重影響報(bào)告發(fā)放，嚴(yán)重影響患者診斷效果。在常規(guī)的病理制片過程中，時(shí)常會(huì)發(fā)現(xiàn)骨組織鈣化不足、淋巴結(jié)組織鈣化等情況，如果不進(jìn)行處理，直接切片，則無法保證切片優(yōu)良 率[7-8]。即使制作為切片，也會(huì)出現(xiàn)切片偏厚，存在明顯刀痕，染色不均勻等情況，這樣會(huì)直接影響切片優(yōu)良率和組織診斷時(shí)間。采取蠟塊脫鈣法，即將蠟塊上多余的蠟清理干凈，然后將蠟塊最大面顯露出來，再將蠟塊放入已經(jīng)配制好的脫鈣液中。將蠟塊底部組織面和脫鈣液直接接觸，60 min后取出，利用自來水充分清除蠟塊上的脫鈣液。采取全自動(dòng)染色機(jī)自動(dòng)染色、脫水、透明，中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察。蠟塊脫鈣法能夠保證蠟塊組織結(jié)構(gòu)完整性，提高染色滿意率和蠟塊切片合格率。蠟塊脫鈣法采取的脫鈣液能夠透過石蠟、有效去除骨組織和鈣化灶和沙礫機(jī)體內(nèi)鈣質(zhì)而不溶解石蠟。蠟塊脫鈣法在整個(gè)脫鈣過程中時(shí)間較短，只需要30～60 min，這樣能夠有效提高工作效率，同時(shí)又能夠很大程度提高切片優(yōu)良率，滿足病理診斷。蠟塊脫鈣法優(yōu)勢(shì)較多，如安全可靠、操作簡(jiǎn)單等，是骨組織脫鈣不足有效的彌補(bǔ)方法。有研究將脫鈣液進(jìn)行脫鈣，將選擇好的組織塊放入到脫鈣液中稀釋脫鈣，脫鈣時(shí)間不僅長(zhǎng)，且不同的脫鈣液具有不同的脫鈣時(shí)間，至少需要2 d，最長(zhǎng)也需要7 d時(shí)間才能脫鈣，這樣對(duì)骨組織研究具有較大的影響，還會(huì)出現(xiàn)脫鈣不足、鈣化灶、砂礫體等狀況。如果直接切片，還會(huì)導(dǎo)致切片合格率不高，染色不均等狀況，導(dǎo)致診斷準(zhǔn)確性嚴(yán)重受到影響。蠟塊脫鈣法在常規(guī)病理技術(shù)制片中效果十分明顯，能夠保證組織結(jié)構(gòu)完整性，不會(huì)出現(xiàn)切片痕跡，并且切片染色均勻，能夠提高診斷準(zhǔn)確性。蠟塊脫鈣法能夠促使骨組織鈣質(zhì)徹底被清除掉，并且在脫鈣過程中可以不用更換脫鈣液。除外，脫鈣時(shí)間較短，能夠有效提高工作效率。此次研究則分析蠟塊脫鈣法在常規(guī)病理技術(shù)制片中對(duì)組織染色效果及切片優(yōu)良率的價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組蠟塊切片后組織結(jié)構(gòu)多數(shù)存在殘缺現(xiàn)象，只有29塊較完整，完整率58.00%。觀察組蠟塊切片后組織結(jié)構(gòu)完整有48塊，完整率高達(dá)96.00%。觀察組蠟塊切片后組織結(jié)構(gòu)完整率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過分析兩組切片完整率能夠直接反映，采取蠟塊脫鈣法能夠有效保證切片組織完整性，保證組織結(jié)構(gòu)完整性，使其減少切片損壞等情況。觀察組經(jīng)過脫鈣法脫鈣后制作的切片細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，鈣化灶呈現(xiàn)藍(lán)色，沙礫體呈現(xiàn)紫紅色，染色均一，效果滿意度。觀察組染色不均一。觀察組染色滿度94.00%，對(duì)照組染色滿意度80.00%，觀察組染色情況較好，染色滿意度較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）為。通過分析兩組染色情況和染色滿意度能夠直接反映采取蠟塊脫鈣法染色情況較好，染色滿意評(píng)價(jià)較高。蠟塊脫鈣法能夠促使切片細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，鈣化灶呈現(xiàn)藍(lán)色，沙礫體呈現(xiàn)紫紅色，保證染色均勻，從而符合染色要求，達(dá)到染色滿意目的。對(duì)照組切片優(yōu)良率為84%，觀察組切片優(yōu)良率為98%。觀察組切片優(yōu)良率明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）為。通過分析兩組切片優(yōu)良率能夠直接反映采取脫鈣法脫鈣后切片優(yōu)良率較高，且安全可靠。脫鈣法脫鈣在常規(guī)病理技術(shù)制片中具有重要意義。在制片過程中為保證制片優(yōu)良率，需要注意的點(diǎn)較多。組織染色前必須要完全脫蠟，脫蠟不完全會(huì)直接影響染色。染色時(shí)間和新老染色制備液存一定關(guān)系。新型制備染液染色能力高，染色時(shí)間可相應(yīng)縮短。注意封固的樹膠濃度要適當(dāng)，不能產(chǎn)生氣泡。樹膠較稀，會(huì)冒出，并且還會(huì)散發(fā)。樹膠太濃，不容易擴(kuò)散，不容易排出，封固以后，還容易影響切片。染色后注意細(xì)胞染色平坦。如果分層不夠深，會(huì)直接影響觀察。切片從深藍(lán)色到紅色到粉紅色，注意顏色變化。切片要及時(shí)放置水中，避免分化。取材組織塊時(shí)，盡量避免擠壓損傷。對(duì)典型或者具有教學(xué)和科研價(jià)值的標(biāo)本，不能因取材導(dǎo)致對(duì)標(biāo)本造成認(rèn)為病變。腸黏膜組織上沾有少量的糞便，也不能用手擦拭或者用水洗凈。切緣組織塊應(yīng)該盡量避免彎曲扭轉(zhuǎn)。取組織應(yīng)該在病灶和正常組織交界處。組織形狀最佳方形或者長(zhǎng)方形狀，這樣以便于制片。組織厚度需要均勻[9]。組織塊厚度影響固定速度，如果組織厚度不均勻，在脫水時(shí)則會(huì)引起標(biāo)本變形，影響制片。組織內(nèi)鈣化病灶或者骨質(zhì)，需要充分固定后進(jìn)行脫鈣處理，組織內(nèi)非病理性物應(yīng)予以清除[10-11]。

綜上所述，蠟塊脫鈣法在常規(guī)病理技術(shù)制片中對(duì)組織染色效果及切片優(yōu)良率具有較高的價(jià)值，值得重視并采納。