金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥機制及實驗室檢測技術(shù)

韓塔拉，王俊瑞

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050； 2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050； 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)臨床病原微生物重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050)

異質(zhì)性耐藥被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于各種屬細(xì)菌中，以革蘭陰性菌(如腸桿菌目細(xì)菌、不動桿菌屬細(xì)菌、假單胞菌屬細(xì)菌等)的研究報道最多。由于實驗室檢測技術(shù)方法的限制、不同研究對異質(zhì)性耐藥定義標(biāo)準(zhǔn)的不統(tǒng)一、異質(zhì)性耐藥機制多樣性等原因，異質(zhì)性耐藥對臨床治療的實際影響尚缺乏充分有效的研究數(shù)據(jù)支持。目前關(guān)于金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)異質(zhì)性耐藥的研究主要針對萬古霉素，對其他類型抗菌藥物異質(zhì)性耐藥機制的報道仍較少。有研究發(fā)現(xiàn)一種具有特殊耐藥表型的金黃色葡萄球菌(oxacillin-susceptible methicillin-resistantStaphylococcusaureus，苯唑西林敏感MRSA，OS-MRSA)，其對苯唑西林呈現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性耐藥特征[1]，而目前實驗室常規(guī)檢測技術(shù)不能準(zhǔn)確鑒別，容易被誤認(rèn)為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)而延誤抗感染治療，甚至導(dǎo)致患者死亡[2]。因此，本文將從異質(zhì)性耐藥的定義、影響因素、金黃色葡萄球菌對不同種類抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥機制及實驗室檢測技術(shù)等幾個方面進(jìn)行綜述，更好地認(rèn)知其發(fā)生機制及潛在臨床意義。

1 異質(zhì)性耐藥定義及影響因素

異質(zhì)性耐藥被認(rèn)為是細(xì)菌耐藥性進(jìn)化過程中的一個中間過程，機制復(fù)雜，其定義尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)通常以El-Halfawy等[3]定義的標(biāo)準(zhǔn)作為參考，即測試菌株可分離出幾種具有不同耐藥程度的細(xì)菌亞群，其中1種或多種亞群對某種抗菌藥物的耐藥水平高于該菌株主要亞群的耐藥程度。判定異質(zhì)性耐藥時應(yīng)至少考慮以下幾個方面。第一，異質(zhì)性耐藥亞群的頻率(即在所有亞群中的占比)和最低耐藥水平[4]。通常以耐藥亞群對某種抗菌藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值與主要亞群(敏感亞群)MIC值的倍數(shù)來定義異質(zhì)性耐藥亞群的耐藥程度。異質(zhì)性耐藥不包括僅比優(yōu)勢亞群MIC稍高的亞群。異質(zhì)性耐藥亞群出現(xiàn)頻率在不同種屬細(xì)菌中差異顯著，如結(jié)核分枝桿菌常會出現(xiàn)高頻率的異質(zhì)性耐藥[5]，而其他菌屬細(xì)菌耐藥亞群出現(xiàn)頻率很低。對于低頻率異質(zhì)性耐藥性的檢測，高靈敏度、標(biāo)準(zhǔn)化檢測技術(shù)至關(guān)重要，如具有更高敏感性的分子檢測技術(shù)。El-Halfawy等[3]建議：耐藥亞群MIC值至少高于相應(yīng)菌株主要亞群MIC值8倍且耐藥亞群頻率高于10-7時，可鑒定為異質(zhì)性耐藥而無需考慮其他因素。第二，耐藥亞群的穩(wěn)定性也是定義異質(zhì)性耐藥時需要考慮的因素。如果在不含抗菌藥物的培養(yǎng)基中連續(xù)傳50代后耐藥亞群能恢復(fù)到親代耐藥水平，則判定為不穩(wěn)定型異質(zhì)性耐藥；反之，如能繼續(xù)保持高水平耐藥(主要亞群MIC值的8倍)，則判定為穩(wěn)定型異質(zhì)性耐藥[4]。異質(zhì)性耐藥亞群大多屬于不穩(wěn)定型異質(zhì)性耐藥，這是由于暴露在抗菌藥物環(huán)境時，異質(zhì)性耐藥亞群的耐藥基因出現(xiàn)自發(fā)串聯(lián)擴(kuò)增，這種擴(kuò)增除本身具有不穩(wěn)定性外，伴發(fā)的高適應(yīng)性代價也進(jìn)一步增加了其不穩(wěn)定性。因此，耐藥亞群在不含抗菌藥物培養(yǎng)基中經(jīng)過連續(xù)傳代(40～50代)，基因自發(fā)擴(kuò)增減緩或消失，加之適應(yīng)性代價的補償，耐藥水平逐漸降低，88%可恢復(fù)至親代耐藥水平[6-7]。第三，異質(zhì)性耐藥亞群形成的適宜培養(yǎng)條件也需要考慮。某些金黃色葡萄球菌菌株的異質(zhì)性耐藥特性呈溫度依賴性：30℃培養(yǎng)條件下，暴露于高濃度甲氧西林時，菌株可以生長；但溫度增高至37℃時，30 min內(nèi)就會失去耐藥性；當(dāng)溫度再次恢復(fù)到30℃時耐藥性又會快速恢復(fù)[3]。最后，鑒定異質(zhì)性耐藥時也應(yīng)注意小菌落變異(small colony variants，SCVs)。與異質(zhì)性耐藥相同，SCVs通常也是在長期暴露于抗菌藥物的條件下形成，其與異質(zhì)性耐藥菌株的差異主要體現(xiàn)在耐藥機制不同。異質(zhì)性耐藥由耐藥相關(guān)基因突變所致，導(dǎo)致小部分細(xì)菌亞群對抗菌藥物產(chǎn)生高水平耐藥。而SCVs耐藥主要源于某些代謝相關(guān)基因發(fā)生突變。由于SCVs利用特定營養(yǎng)成分的能力減弱，導(dǎo)致其對磺胺類、慶大霉素、環(huán)丙沙星、磷霉素等抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[8-9]。此外，SCVs易在宿主細(xì)胞內(nèi)存活和增殖也是導(dǎo)致其對特定抗菌藥物耐藥的原因之一[8]。

2 金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥機制

金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致人類各種感染性疾病的重要病原菌之一。近年來，金黃色葡萄球菌耐藥性問題日益嚴(yán)峻，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)的出現(xiàn)及傳播，增加了臨床醫(yī)生選擇抗菌藥物的難度。萬古霉素及利奈唑胺異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌的相關(guān)報道明顯增加，金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)出對多種抗菌藥物普遍耐藥的趨勢，給臨床抗感染治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。

2.1 β-內(nèi)酰胺類異質(zhì)性耐藥MRSA

2.1.1 OS-MRSA及其耐藥機制 OS-MRSA因體外培養(yǎng)時對苯唑西林敏感(通常MIC<4 μg/mL)且mecA基因陽性而得名[2]。OS-MRSA在體外藥敏試驗呈現(xiàn)對苯唑西林和/或頭孢西丁敏感，但由于mecA基因在被感染宿主體內(nèi)表達(dá)PBP2a蛋白致使其對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，因此常導(dǎo)致該類藥物抗感染治療失敗。絕大多數(shù)MRSA(包括OS-MRSA)對β-內(nèi)酰胺類抗生素既可表現(xiàn)出勻質(zhì)性耐藥，也可表現(xiàn)出異質(zhì)性耐藥[10]，即在體外藥敏試驗中，大部分亞群對苯唑西林的MIC較低，極少部分亞群高水平耐藥,頻率約為10-4[11]。Liu等[12]檢測臨床1 200株金黃色葡萄球菌對苯唑西林的耐藥情況，發(fā)現(xiàn)14株(1.17%)為OS-MRSA，且14株菌全部表現(xiàn)為對苯唑西林異質(zhì)性耐藥。OS-MRSA耐藥機制主要有以下幾種：一是fem基因家族(包括femA、femB和femX基因)的低表達(dá)和突變。fem基因家族參與細(xì)菌細(xì)胞壁合成，其低表達(dá)和突變可能使細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)異常，最終導(dǎo)致mecA基因陽性MRSA表現(xiàn)為對苯唑西林敏感，即OS-MRSA[10]。二是與調(diào)控系統(tǒng)mecR1-mecI同源的blaI-blaR1-blaZ系統(tǒng)的表達(dá)。Sabat等[13]在有/無β-內(nèi)酰胺類抗生素壓力的情況下對1株OS-MRSA菌株GR2的mecA基因表達(dá)程度進(jìn)行定量分析，該株菌基因組由染色體和質(zhì)粒pGR2A和pGR2B組成，攜有無應(yīng)答/無功能的mecR1基因，且無mecI基因。在質(zhì)粒pGR2A的作用下，發(fā)現(xiàn)了一個bla系統(tǒng)的單拷貝。blaZ基因與其調(diào)控基因blaI和blaR1定位一致，在blaZ與調(diào)控基因之間整合了一個編碼轉(zhuǎn)座子IS66基因，刪除blaR1的5’端，編碼blaZ/mecA阻遏因子的blaI完好無損。質(zhì)粒丟失后，GR2對青霉素和苯唑西林產(chǎn)生耐藥。此結(jié)果提示，暴露在β-內(nèi)酰胺類藥物環(huán)境中時，非功能的BlaR1不能裂解mecA阻遏物BlaI，使mecA基因的有效表達(dá)受阻，最終造成OS-MRSA敏感表型的出現(xiàn)。此外，mecA基因的不穩(wěn)定突變，也可改變MRSA對苯唑西林原有的耐藥表型，從而對苯唑西林敏感。此類OS-MRSA暴露于一定濃度的頭孢西丁時，又會恢復(fù)原有耐藥性，導(dǎo)致治療失敗[1,14]。

以上耐藥機制并不足以解釋MRSA的異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象。研究[11,15]表明，relA基因突變可能是MRSA異質(zhì)性耐藥的主要原因之一。野生rel基因長度為2 211 bp,RelA蛋白由736個氨基酸組成，包含4個結(jié)構(gòu)域，分別為水解酶結(jié)構(gòu)域(HD)、合成酶結(jié)構(gòu)域(SYN)、TGS和ACT。苯唑西林高水平耐藥亞群relA基因在1 052堿基和1 546堿基處出現(xiàn)突變，分別為G→A和G→C。G→A突變導(dǎo)致RelA蛋白缺失TGS和ACT結(jié)構(gòu)域。relA基因參與合成信號分子(p)ppGpp。在應(yīng)對特定壓力時，(p)ppGpp可啟動一種稱為嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)的復(fù)雜細(xì)胞程序，從而對多種基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控并減緩生長速度。在高水平耐藥亞群中，(p)ppGpp含量明顯增加，可能參與甲氧西林高水平耐藥。向OS-MRSA生長培養(yǎng)基中加入一定濃度莫匹羅星，同樣可引起細(xì)胞內(nèi)(p)ppGpp的積累，導(dǎo)致嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)發(fā)生，提高該菌株對苯唑西林的耐藥程度，甚至能讓原本低水平耐藥亞群呈現(xiàn)出勻質(zhì)性高水平耐藥[15-16]。因此，適當(dāng)增加莫匹羅星可能提高實驗室常規(guī)方法檢測異質(zhì)性耐藥OS-MRSA的靈敏度[12]。

2.1.2 甲氧西林異質(zhì)性耐藥MRSA向同質(zhì)性耐藥MRSA的轉(zhuǎn)變及機制 MRSA對甲氧西林耐藥主要呈現(xiàn)三種形式：同質(zhì)性耐藥(均質(zhì)性耐藥)、異質(zhì)性耐藥以及鷹型耐藥[17]。鷹型耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(eagle-type MRSA)比較罕見，且對甲氧西林具有特殊的耐藥性，表現(xiàn)為對高濃度甲氧西林耐藥而對低濃度甲氧西林敏感[18-19]。鷹型與異質(zhì)性耐藥的共同點體現(xiàn)在二者均是甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)株向甲氧西林完全耐藥MRSA株轉(zhuǎn)變過程中的過渡形式，但分子機制不同。目前認(rèn)為，鷹型耐藥表型的產(chǎn)生主要因為MSSA直接暴露于高濃度甲氧西林(128 μg/mL)時特定染色體基因(如rpoB等)發(fā)生錯義突變，增加了細(xì)菌對高濃度甲氧西林的耐受力，從而呈現(xiàn)高水平耐藥[19]。而當(dāng)MSSA暴露于低濃度甲氧西林時，可引起mecI基因功能失活，轉(zhuǎn)變?yōu)楫愘|(zhì)性耐藥MRSA；繼續(xù)暴露于高濃度甲氧西林時則進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榫|(zhì)性MRSA。雖然臨床治療中鷹型耐藥比異質(zhì)性耐藥更為罕見，但這種耐藥演變機制值得進(jìn)一步關(guān)注。

2.2 異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌 萬古霉素是治療耐藥金黃色葡萄球菌感染的“最后防線”之一，其與細(xì)胞壁肽聚糖合成前體末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)呈現(xiàn)高親和力，破壞細(xì)胞壁的合成進(jìn)而殺滅細(xì)菌[20]。萬古霉素敏感性下降的金黃色葡萄球菌常分為三類：萬古霉素完全耐藥金黃色葡萄球菌(VRSA,MIC≥16 μg/mL)、萬古霉素中等耐藥金黃色葡萄球菌(VISA,MIC為4～8 μg/mL)及萬古霉素異質(zhì)性中介耐藥的h-VISA，且h-VISA被定義為萬古霉素MIC≤2 μg/mL,但其子代含有少量對萬古霉素中介(MIC≥4 μg/mL)的亞群[21]。含4～6 μg/mL萬古霉素的腦心浸液(BHI)選擇性培養(yǎng)基可用于篩選h-VISA，頻率約為10-6或更高，且在無藥物的非選擇培養(yǎng)基中能穩(wěn)定9代[20]。VRSA的分離率很低，目前我國尚未見VRSA感染的報道。

VISA和h-VISA的耐藥機制尚未完全清晰，目前認(rèn)為與表型及基因型改變有關(guān)。第一，由于VISA中的肽聚糖交聯(lián)減少導(dǎo)致其合成富含D-丙氨酰-D-丙氨酸殘基的肽聚糖側(cè)鏈，使細(xì)胞壁增厚并阻礙細(xì)胞壁水解酶的通道，最終使得藥物無法破壞細(xì)胞壁發(fā)揮其抗菌活性[22]。此外，增厚的細(xì)胞壁也為萬古霉素的結(jié)合提供了更多“靶點”，增加了萬古霉素的活性劑量[23]。第二，另有研究[23]顯示，MRSA產(chǎn)生耐受性也是h-VISA形成的重要原因，而這種耐受性可能與細(xì)菌的自溶活性降低有關(guān)。第三，Nelson等[24]發(fā)現(xiàn)h-VISA菌株存在醋酸鹽分解代謝障礙。該研究全部VISA株中，71%菌株存在醋酸鹽分解代謝下降特征，而萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌(VSSA)菌株醋酸鹽分解代謝降低的比率僅為8%。因此，醋酸鹽分解代謝活性減低很可能是導(dǎo)致細(xì)菌自溶活性降低甚至萬古霉素耐藥的原因之一。

WalkR、VraSR均屬于細(xì)菌響應(yīng)環(huán)境信號的二元調(diào)控系統(tǒng)(two-component systems,TCSs)，參與調(diào)控金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁代謝、毒力調(diào)控基因的表達(dá)以及溶血活性等[25]。多項研究[26-30]表明，VISA和h-VISA菌株中均存在較高比例的walk及vra基因突變，突變的VISA和h-VISA通過下調(diào)某些毒力調(diào)控基因(agrA、RNAⅢ、saeR)以及細(xì)胞壁代謝相關(guān)基因(arlA、ssaA、isaA、lytM)的表達(dá)，導(dǎo)致菌株細(xì)胞壁明顯增厚、毒力水平降低、細(xì)胞自溶活性減弱，最終致使對萬古霉素的敏感性減弱。VISA和h-VISA生物學(xué)性狀的改變，也可以部分解釋VISA和h-VISA菌株抗菌藥物敏感性的降低。從中可以看出，高水平耐藥可能也需要其他因素在其中起作用。VISA與h-VISA耐藥機制之間的關(guān)系有待進(jìn)一步探究，但現(xiàn)有的相關(guān)報道至少提示二者之間有著相似的耐藥機制。

2.3 利奈唑胺異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌(hLRSA) 利奈唑胺是一種細(xì)菌蛋白質(zhì)合成抑制劑，它可以抑制肽鏈形成過程中肽鏈由A位點向P位點移位。這種有別于其他抗菌藥物的獨特機制，使得利奈唑胺不易與其他藥物產(chǎn)生交叉耐藥，且對大多數(shù)革蘭陽性菌引起的感染具有較好的治療效果。現(xiàn)主要有腸球菌對利奈唑胺耐藥的報道，但少有報道金黃色葡萄球菌對利奈唑胺耐藥，其耐藥機制以及是否存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象尚不完全清楚。王敬華等[31]采用菌群分析法從192株MRSA中篩選出2株(1.04%)hLRSA。耐藥株生長具有明顯時間依賴性，可能與低水平耐藥株適應(yīng)環(huán)境、恢復(fù)生長需要較長遲滯期有關(guān)。虞培娟等[32]檢出1株hLRSA，該菌株23SRNA基因2 474位點出現(xiàn)的G→T點突變可能介導(dǎo)hLRSA菌株對利奈唑胺低水平耐藥。Ikeda-Dantsuji等[33]發(fā)現(xiàn)23S RNA基因點突變(T2500A)可引起金黃色葡萄球菌對利奈唑胺的異質(zhì)性耐藥。目前，23S RNA基因點突變被認(rèn)為是介導(dǎo)LRSA和hLRSA菌株對利奈唑胺耐藥的重要機制。

2.4 金黃色葡萄球菌對其他藥物的異質(zhì)性耐藥 金黃色葡萄球菌對其他抗菌藥物也存在異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，如紅霉素、達(dá)托霉素及磺胺類等。

目前，金黃色葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物均質(zhì)性耐藥機制的研究比較確定，主要有兩種。一種是msrA基因引起的主動外排效應(yīng)介導(dǎo)的MS型耐藥；另一種是靶位改變所致耐藥，稱為大環(huán)內(nèi)酯類-林可霉素-鏈霉殺陽菌素B(MLSb)型耐藥，主要由紅霉素核糖體甲基化酶(erm)基因介導(dǎo)。MLSb型耐藥又包括誘導(dǎo)型耐藥(iMLSb)和組成型耐藥(cMLSb)[34]。而金黃色葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類藥物異質(zhì)性耐藥的報道相對較少。Hobul等[35]報道紅霉素對金黃色葡萄球菌的異質(zhì)性耐藥與ermA、ermB、ermC和msrA/B等耐藥基因相關(guān)，而ermA基因最常見。陳東科等[36]發(fā)現(xiàn)17.7%(70/395)金黃色葡萄球菌對紅霉素呈現(xiàn)異質(zhì)性耐藥，且均檢出ermA基因,而未檢出ermC基因。兩項研究結(jié)果提示，erm基因型是介導(dǎo)金黃色葡萄球菌對紅霉素異質(zhì)性耐藥的主要機制。由于不同研究所選菌株的異質(zhì)性，ermA、ermB和ermC 3種基因型分布特征也存在一定差異。erm基因分布的差異在均質(zhì)性耐藥相關(guān)文獻(xiàn)[34]中也有報道。

達(dá)托霉素(DAP)是第一個獲批上市的脂肽類抗生素。它可通過多種機制破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，使細(xì)菌內(nèi)容物外泄而殺滅細(xì)菌，因其獨特的作用機制在治療MSSA或MRSA感染時表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢。但近年來DAP耐藥病例呈增多趨勢。研究[37-38]發(fā)現(xiàn)，DAP的耐藥性可能是由遺傳基因yycG和MprF突變引起。MprF負(fù)責(zé)磷脂酰甘油(PG)的賴氨?；陨蓭д姾傻馁嚢滨?磷脂酰甘油(LPG)，也參與LPG由內(nèi)向外的細(xì)胞膜易位。MprF突變使包膜上的LPG/PG比值提高,導(dǎo)致突變株的DAP連接點比突變前減少，最終導(dǎo)致藥物敏感性降低。而Cui等[39]研究證明，RpoB基因突變使得MRSA對達(dá)托霉素及萬古霉素產(chǎn)生雙重異質(zhì)耐藥性；通過全基因組測序及基因置換的方式，發(fā)現(xiàn)在MRSA菌株中，RpoB基因1 862堿基位點突變，導(dǎo)致624位的丙氨酸被谷氨酸所替換。這種突變導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁增厚及細(xì)胞表面負(fù)電荷減少；同時微陣列數(shù)據(jù)顯示，dlt操縱子高表達(dá)增加了細(xì)胞表面的正電荷。此外，突變菌株嘌呤、嘧啶、精氨酸、尿素循環(huán)和lac操縱子的代謝途徑被抑制，而維生素B2、K1、K2生物合成及細(xì)胞壁代謝活動增強，這些機制共同促進(jìn)MRSA對達(dá)托霉素的異質(zhì)性耐藥。

3 金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥的實驗室檢測技術(shù)

目前實驗室檢測金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥的方法主要有傳統(tǒng)的K-B紙片擴(kuò)散法、E-test法、菌群分析法(population analysis profiling, PAP)、頭孢西丁紙片擴(kuò)散法及稀釋法、乳膠凝集實驗檢測PBP2a蛋白，以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測mecA或mecC基因等。等離子膠質(zhì)體偶聯(lián)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)、拉曼光譜技術(shù)及DNA分子探針等技術(shù)的發(fā)展速度迅猛，在未來會有很好的應(yīng)用前景。

K-B紙片擴(kuò)散法可通過觀察抑菌圈內(nèi)的單個菌落來檢測和識別異質(zhì)性耐藥亞群。抑菌圈內(nèi)異質(zhì)性耐藥亞群菌落的出現(xiàn)，主要取決于異質(zhì)性亞群出現(xiàn)頻率。K-B紙片擴(kuò)散法作為常規(guī)檢測方法成本低廉，操作簡便，在特定種屬細(xì)菌異質(zhì)性耐藥初篩中具有一定應(yīng)用價值。E-Test法與K-B紙片擴(kuò)散法實驗原理和結(jié)果判讀方法類似。該方法結(jié)合了紙片擴(kuò)散法操作方便、結(jié)果易讀取的技術(shù)優(yōu)勢，可直接獲得MIC值[40]，在測量萬古霉素MIC值時重復(fù)性良好，避免了K-B紙片擴(kuò)散法的誤差。然而E-Test法在鑒定異質(zhì)性耐藥方面同樣存在與K-B紙片擴(kuò)散法類似的技術(shù)缺陷如檢出率低。E-Test法的另一個缺點是條帶價格較為昂貴，不適合常規(guī)篩查使用。

PAP是目前公認(rèn)的檢測異質(zhì)性耐藥的金標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。這種方法將待測菌株于含不同濃度抗菌藥物的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，讀取梯度培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)記作不同抗菌藥物濃度下耐藥亞群的頻率，作為判斷異質(zhì)性耐藥是否存在的指標(biāo)。目前常以耐藥亞群頻率>10-7且MIC值高于主要亞群MIC值的8倍作為判斷異質(zhì)性耐藥的標(biāo)準(zhǔn)[3]。常規(guī)方法在檢測OS-MRSA時很容易出現(xiàn)漏診，而PAP可以確定異質(zhì)性耐藥菌的MIC值及耐藥頻率，在很大程度上彌補了常規(guī)方法的不足。但該方法中不同菌屬細(xì)菌對不同抗菌藥物異質(zhì)性耐藥的定義尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，抗菌藥物濃度梯度設(shè)置也無標(biāo)準(zhǔn)化要求，不同實驗室間結(jié)果一致性缺乏評估標(biāo)準(zhǔn)；且PAP試驗操作步驟繁瑣，成本高昂，不適用于常規(guī)開展，僅適用于確認(rèn)試驗。

菌群分析-曲線下面積法(PAP-AUC)是一種改良的PAP方法。這種方法常被用于驗證金黃色葡萄球菌對萬古霉素的異質(zhì)性耐藥[41]。該方法以hVISA Mu3和Mu50菌株為對照，在應(yīng)用PAP法計數(shù)菌落時，繪制萬古霉素濃度和相對應(yīng)活菌落數(shù)相關(guān)曲線圖(以橫坐標(biāo)為萬古霉素的濃度，縱坐標(biāo)為萬古霉素濃度對應(yīng)的活菌菌落數(shù))計算曲線下面積，即AUC值。以受試金黃色葡萄球菌的AUC值除以對照Mu3株的AUC值，如比值≥0.9，即可確定金黃色葡萄球菌對萬古霉素呈異質(zhì)性耐藥[42]。PAP改良法在鑒定特定細(xì)菌異質(zhì)性耐藥方面有較好的應(yīng)用價值，制定了針對特定抗菌藥物和特定菌屬細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程。與PAP法相同，該方法也因操作步驟繁瑣、費時費力等特點而限制了其在實驗室內(nèi)的常規(guī)使用。

頭孢西丁紙片擴(kuò)散法和苯唑西林稀釋法是美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的檢測方法。頭孢西丁紙片擴(kuò)散法操作簡便，成本低廉，其敏感性和特異性都較苯唑西林紙片擴(kuò)散法高，適合用于臨床微生物實驗室鑒定MRSA[43]。研究[44]證實，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法試驗用于MRSA表型的檢測時表現(xiàn)良好，特別適用于低水平和異質(zhì)性耐藥MRSA的檢測，靈敏度(100%)高于其他篩選試驗。

乳膠凝集法檢測PBP2a的原理是通過裂解細(xì)菌提取出MRSA中的PBP2a,加入PBP2a特異性單克隆抗體致敏的乳膠顆粒溶液后出現(xiàn)肉眼可見的特異性凝集現(xiàn)象,證實PBP2a存在并以此判斷MRSA耐藥性。試驗只需15 min,大大縮短了實驗室鑒定病原微生物所需的時間，快速、簡便、準(zhǔn)確、無需特殊儀器，非常適合臨床微生物實驗室快速篩查MRSA[45]。

PCR法被認(rèn)為是確認(rèn)MRSA(mecA/mecC)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。臨床通常用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法或苯唑西林稀釋法來確定MRSA的表型，通過PCR檢測mecA和乳膠凝集法檢測PBP2a來驗證MRSA的基因型。此外，微液滴數(shù)字PCR技術(shù)(ddPCR)是一種基于泊松(Poisson)分布原理的核酸分子絕對定量技術(shù)。相較于傳統(tǒng)PCR，ddPCR最大優(yōu)勢在于不依賴Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，而是直接計算模板中的拷貝數(shù)，實現(xiàn)真正意義上的絕對定量和絕對檢測精度[46]。近年ddPCR在病原微生物檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如利用ddPCR技術(shù)檢測幽門螺桿菌對克拉霉素的異質(zhì)性耐藥[47]。此項技術(shù)也存在與傳統(tǒng)PCR相同的問題有待完善，如閾值確定困難、假陽性率高、實驗室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)高、操作復(fù)雜、檢測成本高等，但ddPCR技術(shù)在細(xì)菌異質(zhì)性耐藥檢測中的應(yīng)用仍值得期待。

等離子膠質(zhì)體偶聯(lián)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)和拉曼光譜技術(shù)都是近些年發(fā)展很快的細(xì)菌鑒定及耐藥檢測的新技術(shù)。它們的共同特點是在單細(xì)胞水平對細(xì)菌耐藥性進(jìn)行精準(zhǔn)檢測。MALDI-TOF MS利用膠質(zhì)體包裹細(xì)菌，在激光照射下，通過測定抗菌藥物及代謝產(chǎn)物的量來最終確定細(xì)菌耐藥情況[48]。而拉曼光譜技術(shù)能夠?qū)臉颖局兄苯臃蛛x出的致病菌進(jìn)行逐個檢測，在無損細(xì)胞的條件下，獲得單細(xì)胞及亞細(xì)胞細(xì)微化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合拉曼成像技術(shù)可準(zhǔn)確測量個體細(xì)菌在測試藥物作用下的異質(zhì)性變化，如藥物在菌體中的分布與動力學(xué)變化，藥物與單個細(xì)菌的相互作用等，為耐藥性的變遷和耐藥機制研究提供了便利的工具[49]。根據(jù)其試驗和建模數(shù)據(jù)，拉曼光譜技術(shù)可在3 h內(nèi)檢測到高表達(dá)表型，可檢測到的異質(zhì)性耐藥頻率低至10-6。

4 小結(jié)

異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌在人源分離株中廣泛存在，實驗室漏檢也時有發(fā)生。對萬古霉素、利奈唑胺和苯唑西林異質(zhì)性耐藥株的漏診，可能給患者治療帶來嚴(yán)重不良后果。金黃色葡萄球菌異質(zhì)性耐藥亞群發(fā)生頻率相對較低、耐藥機制多樣、定義標(biāo)準(zhǔn)尚未建立等因素制約著臨床對分離株異質(zhì)性耐藥情況的客觀檢測和臨床意義評估。標(biāo)準(zhǔn)化、便捷的異質(zhì)性耐藥實驗室檢測技術(shù)亟待規(guī)范，新技術(shù)的研發(fā)迫在眉睫。各種分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，將為異質(zhì)性耐藥株的快速檢出和耐藥機制的探索提供更多可能。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。