燒傷患者耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌感染的環(huán)境追蹤研究

曾 凌，徐 珍，戴小華，劉 洋，朱春梅，劉 蓬

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1. 感染控制處； 2. 燒傷醫(yī)學(xué)科； 3. 檢驗科，江西 南昌 330006)

燒傷患者由于皮膚黏膜屏障受損，更易發(fā)生多重耐藥菌感染，引起嚴(yán)重膿毒癥、感染性休克，成為主要致死原因之一[1-2]。目前，國內(nèi)外耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的耐藥形勢嚴(yán)峻，感染患者的病死率可高達(dá)30%～70%[3]，并有在燒傷病房內(nèi)流行的趨勢，給臨床用藥和治療帶來巨大困難[4]。燒傷創(chuàng)面感染與環(huán)境(內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境)密切相關(guān)[5]，多重耐藥菌的環(huán)境同源性分析和細(xì)菌定植等研究成為目前醫(yī)院感染防控的研究重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。但目前國內(nèi)相關(guān)研究均為回顧性調(diào)查，往往是發(fā)生感染或感染暴發(fā)后再進(jìn)行調(diào)查分析，缺乏基因同源性分析的科學(xué)依據(jù)[6]。本研究采用前瞻性研究方法，開展燒傷患者CRKP感染環(huán)境的追蹤，查找感染患者與環(huán)境之間的傳播鏈，明確傳染源及傳播途徑，以期為燒傷患者感染的防控與治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例篩選及調(diào)查 應(yīng)用“醫(yī)院感染實時監(jiān)控軟件”對燒傷科重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者進(jìn)行實時監(jiān)測，確定并選取CRKP感染病例。對納入的CRKP感染病例進(jìn)行危險因素調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括年齡、性別、燒傷程度、基礎(chǔ)疾病、送檢標(biāo)本類型、送檢時間、侵入性操作(呼吸機(jī)、中心靜脈置管等)、抗菌藥物使用、住院時間及預(yù)后等。

1.2 標(biāo)本采集及方法 臨床采集CRKP感染燒傷患者的消化道、分泌物和血等標(biāo)本，進(jìn)行內(nèi)環(huán)境的追蹤。對CRKP感染燒傷患者所處的外環(huán)境進(jìn)行追蹤調(diào)查，包括床單元(床單、被套、床墊等)、生活衛(wèi)生用品、床頭柜表面、醫(yī)療儀器設(shè)備表面、工作人員手、工作服和病區(qū)空氣等。

臨床患者標(biāo)本采集參照《醫(yī)院感染預(yù)防與控制操作指南SOP》的操作標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行；外環(huán)境的標(biāo)本采集參照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》WS/T 367—2012的操作標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。采用蘸有無菌生理鹽水的棉拭子對環(huán)境物體表面進(jìn)行采樣。

1.3 菌株鑒定及藥敏試驗 采用VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃公司)對采集菌株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗。藥敏結(jié)果判定依據(jù)2020年美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.4 同源性分析 采用脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel eledtrophoresis, PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing, MLST)的檢測方法，確定菌株的DNA同源性，明確菌株的分子分型。沙門氏菌H9812用作標(biāo)記菌株，XbaI酶進(jìn)行酶切，BioNumerics軟件(version 4.0;AppliedMaths)分析PFGE凝膠圖像條帶，相似度≥80%認(rèn)為菌株屬于同一基因分型。對7對管家基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB7進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增、測序，根據(jù)序列結(jié)果進(jìn)行比對分型，獲得序列型別(sequence-type,ST)[7]。

1.5 莢膜血清型及毒力基因檢測 采用PCR對CR-hvKP菌株進(jìn)行莢膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54、K57)檢測以及4個毒力因子基因檢測[包括莢膜(rmpA、rmpA2)和鐵載體(iutA、iroN)]。PCR的擴(kuò)增引物、體系和擴(kuò)增條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床基本資料 2020年6—12月共有4例燒傷患者發(fā)生CRKP感染，2例患者標(biāo)本為創(chuàng)面分泌物，2例為血，均無基礎(chǔ)疾病。4例患者均為Ⅲ度以上燒傷，經(jīng)歷多次清創(chuàng)手術(shù)，均采用聯(lián)合抗菌藥物治療?；颊咦≡簳r間為20～47 d，年齡為37～50歲。預(yù)后情況：1例血液中分離出CRKP的患者死亡，2例患者好轉(zhuǎn)，1例患者治愈出院。見表1。

表1 4例CRKP感染燒傷患者臨床基本情況Table 1 Basic clinical information of 4 burn patients with CRKP infection

2.2 菌株檢出情況 共采集臨床患者與環(huán)境標(biāo)本152份。其中臨床標(biāo)本12份，環(huán)境標(biāo)本140份(床單元40份，醫(yī)療器械40份，病區(qū)60份)。經(jīng)細(xì)菌鑒定，分離出肺炎克雷伯菌18株，其中環(huán)境標(biāo)本分離13株，臨床標(biāo)本分離5株。經(jīng)藥敏試驗，最后共分離出CRKP菌株15株，其中臨床標(biāo)本4株，分別為1、2號患者血標(biāo)本，3、4號患者創(chuàng)面分泌物標(biāo)本；環(huán)境標(biāo)本11株，主要為患者床旁隔離衣、呼吸機(jī)和醫(yī)護(hù)人員手等。見表2。

表2 CRKP感染患者臨床及環(huán)境標(biāo)本菌株檢出情況Table 2 Isolation of bacterial strains from clinical and environmental specimens of patients with CRKP infection

2.3 菌株同源性分析結(jié)果 對15株CRKP分離株進(jìn)行PFGE分型，通過PFGE分析，經(jīng)聚類分析獲得結(jié)果為A～G 7個聚類組，1號患者的血標(biāo)本、2號患者的血標(biāo)本及環(huán)境標(biāo)本、3號患者的創(chuàng)面分泌物及環(huán)境標(biāo)本具有同源性，為同一型別A型。將A～G型別的菌株進(jìn)行MLST分析，結(jié)果分別得到A～G型為ST11、ST35、ST1、ST37、ST2929、ST23、ST17。見圖1。

圖1 15株CRKP菌株同源性分析聚類圖Figure 1 Cluster diagram of homology analysis of 15 CRKP strains

2.4 毒力基因及莢膜血清型檢測情況 對15株CRKP菌株進(jìn)行毒力基因檢測，K1、K2和K5型均未檢出，其中5株K57型，ST型別為ST35、ST37和ST17。而未分型菌株以ST11型為主。見表3。

表3 15株CRKP毒力基因及莢膜血清型檢測情況Table 3 Detection of virulence genes and capsular serotypes of 15 CRKP strains

3 討論

燒傷病房是醫(yī)院多重耐藥菌感染監(jiān)測的重點(diǎn)區(qū)域，極易發(fā)生細(xì)菌定植。燒傷患者因皮膚黏膜屏障受到破壞，影響機(jī)體正常的防御機(jī)制，并通過受損部位引起感染[9]；此外，吸入性損傷、導(dǎo)管插管操作、住院時間長、機(jī)體免疫力下降等原因，也使燒傷患者發(fā)生感染的概率大大增加[10]。目前，在抗菌藥物的選擇壓力下，燒傷患者發(fā)生CRKP感染的情況日益增多[11]，并呈流行趨勢。

本研究前瞻性監(jiān)測燒傷病房患者CRKP感染發(fā)生情況，以預(yù)防和控制CRKP醫(yī)院感染暴發(fā)。對患者周圍環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測，共分離出11株CRKP菌株。采用PFGE對其進(jìn)行分子分型，共分為7個克隆組。病例1、2、3的床位分別為11、12、2床，患者1、2號的診療及護(hù)理為同一組醫(yī)護(hù)人員，患者3號為另一組醫(yī)護(hù)人員。1號患者雖早入院10 d，但與2號患者CRKP菌株檢出時間間隔2 d，1、2號患者的血標(biāo)本及環(huán)境標(biāo)本、3號患者的創(chuàng)面分泌物及環(huán)境標(biāo)本共7株CRKP菌株高度同源，為同一型別A型，ST序列型別均為11型?？煽紤]此菌株為不同區(qū)域間的水平傳播導(dǎo)致，研究[10-12]證明感染者與其診療環(huán)境間存在相互傳播，本研究中患者床旁隔離衣和醫(yī)務(wù)人員手CRKP檢出率高，患者極大可能通過接觸醫(yī)院環(huán)境而感染。燒傷患者創(chuàng)面破壞了人體原有的微生態(tài)平衡，污染的物體表面清潔消毒不徹底或手衛(wèi)生未嚴(yán)格執(zhí)行，將會造成細(xì)菌定植，成為傳染源[13]。另外，由于機(jī)體腸黏膜屏障的應(yīng)急損傷，腸道內(nèi)毒素和微生物等有可能成為創(chuàng)面的一個內(nèi)源性感染來源[14]。創(chuàng)面感染后如未能得到有效控制，繼而導(dǎo)致的敗血癥是創(chuàng)面患者死亡的主要原因之一。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)一直認(rèn)為，細(xì)菌耐藥性與毒力呈負(fù)相關(guān)，然而隨著毒力-耐藥雜合質(zhì)粒的不斷報道，高毒力高耐藥肺炎克雷伯菌成為新型超級細(xì)菌[15]。我國CRKP中高毒力肺炎克雷伯菌以7.4%～15%的分離率位列世界前列[16]。本研究毒力基因檢測中檢出5株K57型，以ST35型別為主，提示該院燒傷科ICU出現(xiàn)局部CRKP克隆株流行，可能合并高毒高耐藥，下一步應(yīng)開展更大范圍的監(jiān)測。臨床在對燒傷患者創(chuàng)面抗感染治療時應(yīng)給予足夠重視。細(xì)菌的耐藥性是臨床抗感染治療的難點(diǎn)之一，與燒傷患者治療過程中長期大量使用抗菌藥物密切相關(guān)，應(yīng)及時根據(jù)患者感染的病原菌種類及藥敏結(jié)果，合理選擇抗菌藥物[17-18]。

本研究通過對CRKP感染燒傷患者的內(nèi)、外環(huán)境進(jìn)行前瞻性研究，結(jié)果表明燒傷患者CRKP感染與環(huán)境之間有傳播鏈。了解燒傷患者感染的危險因素，明確傳染源及傳播途徑，對感染病例進(jìn)行實時監(jiān)測并及時追蹤干預(yù)，從源頭上阻止醫(yī)療機(jī)構(gòu)相關(guān)醫(yī)院感染暴發(fā)的可能。

本研究也存在一定不足之處：CRKP感染患者較少，導(dǎo)致樣本量不夠，因此后期仍需繼續(xù)前瞻性監(jiān)測，加大樣本量；另外，本研究中對外環(huán)境中菌株和臨床菌株進(jìn)行了同源性分析，但同源性分析結(jié)果并不能證實外環(huán)境中菌株與臨床菌株父子親緣關(guān)系，因此不能說明環(huán)境中多重耐藥菌是由環(huán)境中傳播至患者還是患者傳播至環(huán)境中，亦或是兩種模式均有，多重耐藥菌傳播模式關(guān)系并不清楚[19]。同時國內(nèi)外亦無相關(guān)研究報道，需要進(jìn)一步進(jìn)行研究，也是本課題組的下一步研究方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。