熒光法檢測(cè)根際土壤胞外酶活性的優(yōu)化

唐連發(fā)，王琴，唐兆鑫，楊晴晴

(河北大學(xué) 生態(tài)環(huán)境學(xué)院(籌)，河北 保定 071002)

土壤酶由植物根系和土壤微生物分泌[1]．在植物—土壤元素循環(huán)中，酶對(duì)有機(jī)分子的降解和礦化起著重要的作用，土壤中胞外酶揭示了土壤的C、N、P循環(huán)[2]．土壤胞外酶穩(wěn)定性好，可長時(shí)間保持高的酶活性[3]．它們?cè)诃h(huán)境受到脅迫后的響應(yīng)能力，使其成為評(píng)價(jià)土壤微生物質(zhì)量的潛在指示劑[4]．在有關(guān)土壤生態(tài)學(xué)以及土壤微生物的測(cè)定中，關(guān)鍵土壤酶活性的測(cè)定成為必不可少的指標(biāo)[2]．

對(duì)采集的土壤立即進(jìn)行分析可能是最接近實(shí)際情況的，但由于各方面的限制較難實(shí)現(xiàn)，因此就需要采用適宜的方法來保存土壤，這可能影響到土壤胞外酶的活性，但不同類型土壤酶活性的差異仍可得以保留[5]．在特定的實(shí)驗(yàn)條件下使用人工底物測(cè)量土壤胞外酶活性，大多采用熒光法或吸光度法[6]．熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性與吸光度法相比具有靈敏性高、所需樣本量少、高通量、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在著底物較貴、底物和標(biāo)準(zhǔn)品難溶解等缺點(diǎn)[7]．在熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性的實(shí)驗(yàn)中，緩沖溶液與土壤混勻是土壤酶提取的重要一步，其作用在于破壞土壤團(tuán)聚體將土壤酶充分釋放出來，但不同類型的土壤使用相同的緩沖溶液可能對(duì)不同土壤酶的提取存在差異[1]．大多采用漩渦震蕩將緩沖溶液與土壤混勻，使土壤中的酶與底物發(fā)生完全反應(yīng)[8]．不同酶與底物充分反應(yīng)所需的培養(yǎng)時(shí)間不同，大多為4 h[9-12]．酶與底物充分反應(yīng)還會(huì)受到培養(yǎng)溫度的影響，在合適的溫度下培養(yǎng)更能獲得實(shí)際的土壤中酶活性情況．因土壤類型不同、酶的種類不同等，可能在可控的實(shí)驗(yàn)步驟方面存在一定的差異，需要逐項(xiàng)優(yōu)化．

本研究檢測(cè)了根際土壤中5種關(guān)鍵的胞外酶：纖維素降解的β-葡萄糖苷酶(βG)[13]，從甲殼素中釋放出含氮小氨基糖的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)[14]，將纖維素分解為纖維二糖、果糖和葡萄糖的纖維二糖水解酶(CBH)[15]，水解蛋白質(zhì)和多肽的亮氨酸氨基肽酶(LAP)，礦化有機(jī)磷的堿性磷酸酶(AKP)[16]．通過測(cè)定不同緩沖溶液提取、不同混勻方式、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)酶活性的影響，確定熒光法測(cè)定5種土壤胞外酶活性的最佳參數(shù)，為其標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考．

1 材料與方法

1.1 土壤樣本的選擇

選取來自不同類型宿主的根際土壤樣本.刺槐(RobiniapseudoacaciaLinn)和一年生的歐美雜交楊‘546’(Populusdeltoidescv.′55/56′×P.deltoidescv. ′Imperial′，高敏感性，含有典型臭氧敏感性差異楊樹基因型)，均來自北京延慶地區(qū)臭氧實(shí)驗(yàn)基地(40.47° N，116.34° E)．樹木種植在20 L的塑料花盆中，盆內(nèi)裝有從附近農(nóng)田采集的0～10 cm深度的棕色砂壤土．生長5個(gè)月后取植物根際土，過2 mm篩用于測(cè)定土壤理化指標(biāo)，再過1 mm篩用于測(cè)定土壤胞外酶活性，密封袋保存后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冷凍保存．

1.2 土壤理化指標(biāo)的測(cè)定

土壤pH采用國標(biāo)法，使用pH計(jì)(ST3100，奧豪斯)進(jìn)行測(cè)定[17]．

含水率：土壤過1 mm篩，110 ℃至恒質(zhì)量，計(jì)算含水率．

含水率=(濕土質(zhì)量-烘干土質(zhì)量)/烘干土質(zhì)量×100%．

有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀、堿解氮、有效磷和速效鉀的測(cè)定均采用鮑士旦[18]所記錄的方法．所測(cè)得楊樹土壤理化指標(biāo)見表1．

表1 根際土壤的理化指標(biāo)

1.3 相關(guān)溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為4-甲基傘形酮(MUB)和7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)(麥克林試劑)．LAP的參考標(biāo)準(zhǔn)是AMC，其余4種酶是MUB[19]．本研究以MUB和AMC的偶聯(lián)物作為底物[19-20]，其原理是：5種酶分解其特異性的底物，其底物中包含的熒光物質(zhì)MUB、AMC被釋放出來，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度值，將酶活性轉(zhuǎn)化為所產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)物的量．在Merck網(wǎng)站上(https://www.sigmaaldrich.cn)，MUB在甲醇中的溶解度為50 mg/mL；AMC在丙酮中的溶解度為10 mg/mL．另有文獻(xiàn)采用另一種極佳的有機(jī)溶劑DMSO(二甲基亞砜)作為溶劑[21]．本研究中MUB和AMC標(biāo)準(zhǔn)物采用甲醇作為溶劑，超純水稀釋(AMC在超純水中溶解較好)，配制濃度為40 mmol/L．

1.3.2 底物溶液的配制

底物濃度200 μmol/L，底物溶劑為超純水，其中βG底物需超聲使其徹底溶解．有文獻(xiàn)使用底物濃度4 μmol/L[22]，但大多數(shù)文獻(xiàn)使用200 μmol/L[23-24]，后者可使大多數(shù)土壤樣品分解[20, 24]．所配溶液分裝且用錫紙包裹后，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫玫孜镆姳?(羅恩試劑)．

表2 所測(cè)土壤胞外酶及相應(yīng)底物

1.3.3 土壤胞外酶活性測(cè)定的操作步驟及計(jì)算方法

稱取1 g土壤于50 mL離心管中，加入緩沖溶液，振蕩混勻，制備土壤均質(zhì)懸濁液．先將土壤懸濁液(在磁力攪拌器上取樣)、超純水加入黑色96孔酶標(biāo)板(上海WHB)，然后在暗處加入底物溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液．加入完成后，在黑暗條件下使用恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)．培養(yǎng)完成后在每孔中加入10 μL、1 mol/L的NaOH(終止反應(yīng)，增加熒光強(qiáng)度)，反應(yīng)1 min后使用酶標(biāo)儀(美國/Biotek，Cytation5，激發(fā)365 nm，發(fā)射450 nm)測(cè)定熒光值．各孔加入物質(zhì)[25]見表3.

表3 黑色96孔酶標(biāo)板各孔加入物質(zhì)

計(jì)算方法:

酶活=(凈熒光值×緩沖溶液體積)/(發(fā)射系數(shù)×懸濁液體積×培養(yǎng)時(shí)間×土壤干質(zhì)量).

其中，

凈熒光值=(樣品微孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/淬滅系數(shù)-基底控制孔的熒光值；淬滅系數(shù)=(淬火標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值-樣品控制孔的熒光值)/參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值；發(fā)射系數(shù)=參考標(biāo)準(zhǔn)孔的熒光值/(參考標(biāo)準(zhǔn)物濃度×參考標(biāo)準(zhǔn)物體積).

1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 緩沖溶液的選擇

分別選取乙酸鈉(0.2 mol/L，pH 5.8)、檸檬酸-檸檬酸鈉(0.2 mol/L，pH 6.6)、PBS(0.2 mol/L，pH 7.5)、超純水4種溶液作為緩沖溶液．

1.4.2 混勻方式的選擇

選取幾種常用的混勻方式，混勻時(shí)間根據(jù)經(jīng)驗(yàn)設(shè)置．本研究中所用的混勻方式見表4．

表4 本研究所用的混勻方式

1.4.3 培養(yǎng)溫度的選擇

恒溫培養(yǎng)箱(SPX型智能生化培養(yǎng)箱)設(shè)置3個(gè)不同的溫度(20、25、30 ℃)．

1.4.4 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

每種酶的培養(yǎng)時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h．

2 結(jié)果

2.1 緩沖溶液對(duì)酶活的影響

稱取楊樹、刺槐根際土壤各1 g，分別加入1.4.1中不同的緩沖溶液30 mL，搖床搖勻1 h，25 ℃培養(yǎng)5 h，酶活測(cè)定結(jié)果見圖1.

a.楊樹;b.刺槐圖1 緩沖溶液對(duì)酶活的影響Fig.1 Effect of buffer solutions on the enzyme activities

由圖1可知，不同樹種之間對(duì)緩沖溶液的反應(yīng)是一致的．AKP、βG、LAP在以超純水為緩沖溶液的情況下，酶活最高；CBH、NAG在乙酸鈉為緩沖溶液的情況下，酶活最高．

本研究的土壤均呈弱堿性，而乙酸鈉、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液屬于酸性．由乙酸鈉緩沖溶液測(cè)得的CBH、NAG酶活最高，但是測(cè)得的βG酶活很低．PBS作為緩沖溶液測(cè)得的AKP酶經(jīng)計(jì)算得出的酶活為負(fù)值(圖1中取0)，PBS可能并不適合作為測(cè)定土壤胞外酶酶活的緩沖溶液，至少不適合本研究土壤中的AKP酶活的測(cè)定．

2.2 混勻方式對(duì)酶活的影響

稱取5份刺槐根際土壤各1 g，加入超純水30 mL，分別以1.4.2中5種方法混勻處理，25 ℃培養(yǎng)4 h．所用底物從4 ℃冰箱中取出，置于室溫避光處放置12 h，酶活測(cè)定結(jié)果見圖2.

圖2 混勻方式對(duì)酶活的影響Fig.2 Effect of mixing methods on the enzyme activities

由圖2可知，使用漩渦混合器提取出的AKP、βG、CBH酶活最高．搖床1 h，提取出的NAG、LAP酶活最高．使用超聲清洗器提取的酶活較小，可能由于超聲時(shí)間過長，破壞了酶的結(jié)構(gòu)．超聲后又經(jīng)立式混勻器混勻提取的βG、CBH、NAG酶活非常低，AKP、LAP酶活也有所降低．使用立式混勻器可能由于轉(zhuǎn)速不夠的原因，所測(cè)得LAP酶活與搖床相比較低．雖然經(jīng)不同混勻方式提取的酶活不同，但每種方式下5種酶的酶活趨勢(shì)基本一致(AKP>LAP>CBH>βG/NAG)．

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響

稱取楊樹根際土壤1 g，加入30 mL超純水，漩渦混勻5 min后，將土壤懸濁液稀釋10倍，25 ℃培養(yǎng)5 h．所用底物、標(biāo)準(zhǔn)品從4 ℃冰箱中取出，置于室溫避光處放置24 h，酶活測(cè)定結(jié)果見圖3.

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of culture temperatures on the enzyme activities

由圖3可知，除LAP經(jīng)30 ℃和20 ℃培養(yǎng)相差不大以外，其余酶的趨勢(shì)基本為25 ℃培養(yǎng)的酶活>30 ℃培養(yǎng)的酶活>20 ℃培養(yǎng)的酶活．

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響

稱取楊樹根際土壤1 g，加入30 mL超純水，漩渦混勻5 min后，將土壤懸濁液稀釋10倍，25 ℃培養(yǎng)．根據(jù)酶的培養(yǎng)時(shí)間曲線，判斷5種酶最佳的培養(yǎng)時(shí)間，結(jié)果見圖4．

由圖4可知，在培養(yǎng)4 h的情況下，AKP、βG的酶活隨著培養(yǎng)時(shí)間延長呈上升趨勢(shì)，在4 h時(shí)達(dá)到最高值．隨后繼續(xù)分別培養(yǎng)5、6 h，AKP的酶活在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(酶活分別為303.63、253.25 nmol/(g·h))，βG的酶活也在培養(yǎng)5、6 h呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(酶活分別為12.25、8.76 nmol/(g·h))．LAP酶活最高點(diǎn)在1 h，然后隨著時(shí)間呈波浪變化，但始終沒有超過1 h時(shí)的酶活．CBH、NAG的酶活隨時(shí)間不斷變化，CBH酶活在2 h時(shí)達(dá)到最高值，NAG的酶活在3 h時(shí)達(dá)到最高值．

2.5 優(yōu)化后參數(shù)的應(yīng)用

根據(jù)1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的條件，選取楊樹根際土壤進(jìn)行5種酶酶活的測(cè)定，結(jié)果見圖5.

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of culture times on the enzyme activities

圖5 楊樹根際土壤胞外酶的酶活Fig.5 Activities of extracellular enzymes in the rhizosphere soil of poplar

由圖5可知，楊樹根際土壤中AKP、LAP的酶活遠(yuǎn)高于其他3種酶，βG、CBH、NAG的酶活均小于40 nmol/(g·h)．上述實(shí)驗(yàn)中5種土壤胞外酶AKP、βG、CBH、NAG、LAP的活性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為(237.70±74.72)、(24.68±6.20)、(17.05±2.76)、(26.38±3.03)、(289.70±130.60)nmol/(g·h)．

3 討論

采用熒光法測(cè)定土壤胞外酶活性，是一種高通量且簡(jiǎn)便的方法．標(biāo)準(zhǔn)品 MUB 和AMC較難溶解，本研究中用甲醇作溶劑，再用超純水稀釋到相應(yīng)濃度.研究過程中發(fā)現(xiàn)SynergyHTX酶標(biāo)儀(使用鎢絲燈，用濾光片作為光源)的檢測(cè)范圍較低(100～6 000)，測(cè)得的熒光值較??；Cytation5酶標(biāo)儀(使用氙閃燈，單色器作為光源)的檢測(cè)范圍較高(10 000～3 000 000)、靈敏度高，故本研究采用Cytation5酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定.研究還發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中使用的水土比30∶1(mL∶g)較低[26]，實(shí)驗(yàn)過程中用此水土比測(cè)得的熒光值較大，所以本研究加大了水土比，圖3為在水土比30∶1(mL∶g)再稀釋10倍的條件下計(jì)算出的土壤胞外酶酶活，此時(shí)實(shí)際水土比為300∶1(mL∶g).

測(cè)試土壤樣本均來自相同類型的土壤，因其宿主植物差異，根際土壤的理化性質(zhì)并不完全一致，其有機(jī)質(zhì)是影響土壤酶活性的關(guān)鍵因子[2, 27]．本研究中不同樣本之間的pH、有機(jī)質(zhì)的含量相似．乙酸鈉是測(cè)定這5種土壤胞外酶酶活常用的緩沖溶液，其所測(cè)定的土壤多呈酸性[9, 28-29]．本研究發(fā)現(xiàn)CBH、NAG在用乙酸鈉緩沖液提取時(shí)測(cè)得的酶活最高，AKP、βG、LAP在用超純水提取時(shí)測(cè)得的酶活最高．

對(duì)于混勻方式來說，使用XH-C漩渦混合器混勻5 min，測(cè)得AKP、βG、CBH酶活性最高，搖床混勻60 min所得NAG、LAP酶活最高．可能XH-C漩渦混合器的功率及時(shí)間、搖床的轉(zhuǎn)速及時(shí)間都對(duì)酶活有影響，這就需要根據(jù)不同樣本性質(zhì)多次測(cè)定所得的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行選擇．有研究發(fā)現(xiàn)，不同酶之間有著不同的最佳攪拌時(shí)間[8]．梅孔燦等[28]在測(cè)定βG、CBH中，使用磁力攪拌器攪拌5 min．當(dāng)樣本較少時(shí)，選擇漩渦混合器省時(shí)省力；當(dāng)樣本數(shù)較多時(shí)，選擇搖床可一次混勻所有的樣本．

在水解酶的培育時(shí)間上各學(xué)者都有不同選擇，李歡等[30]在對(duì)這5種酶的測(cè)定中，采用黑暗下培育2 h；杜璨[26]在對(duì)CBH、βG、NAG的測(cè)定中采用黑暗下培育4 h；Brockett等[24]在對(duì)CBH、βG、NAG的測(cè)定中分別培育3、7、3 h；賈淑嫻等[8]在對(duì)CBH、βG、NAG測(cè)定方法探究上，證明這3種酶培養(yǎng)4 h是最佳的．培養(yǎng)時(shí)間在4 h內(nèi)是多數(shù)研究者所采用的時(shí)間.本研究設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間為1～6 h，發(fā)現(xiàn)AKP、βG的最優(yōu)培養(yǎng)時(shí)間是4 h，LAP是1 h，CBH是2 h，NAG是3 h．溫度對(duì)土壤胞外酶活性有著重要的影響[27]．通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在25 ℃下5種土壤胞外酶的酶活均為最高，在20 ℃下培養(yǎng)的5種酶的酶活均為最低，這5種酶的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃左右(較20 ℃和30 ℃來說)，培養(yǎng)溫度可能需要根據(jù)實(shí)際采樣時(shí)的溫度來設(shè)置，比如：福建省4月份采樣，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的培養(yǎng)溫度為20 ℃[28]；云南元謀縣采樣土壤年均溫度23.4 ℃，實(shí)驗(yàn)設(shè)置的培養(yǎng)溫度為25 ℃[29]．25 ℃幾乎是本研究中土壤樣本采集時(shí)的溫度，也比較符合實(shí)際的情況．徐國慶[31]用熒光法測(cè)定施加污泥生物碳的楊樹土壤酶的酶活，βG、LAP、NAG酶活依次是140～240、10～20、50～80 nmol/(g·h)．本研究結(jié)果與之相比較，βG活性較小，LAP活性較大．βG是有關(guān)C分解的酶，LAP是有關(guān)N分解的酶，根據(jù)土壤酶化學(xué)計(jì)量學(xué)[26]，本研究樣本可能受到了微生物的N限制．

4 結(jié)論

本研究依據(jù)熒光法優(yōu)化了土壤中常見的5種胞外酶酶活的測(cè)定方法，考察了不同的混勻方式、不同緩沖溶液提取、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)酶活的影響．結(jié)果得出：在使用Cytation5等高靈敏度的酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)所采用水土比值應(yīng)高于300∶1(mL∶g)．轉(zhuǎn)速會(huì)影響土壤胞外酶提取，若選擇較高轉(zhuǎn)速則應(yīng)相對(duì)減少混勻時(shí)間．基于以下土壤胞外酶測(cè)試的關(guān)鍵參數(shù)可獲得最大酶活：測(cè)定AKP、βG時(shí)用超純水作為緩沖溶液，用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min，在25 ℃培養(yǎng)4 h；測(cè)定CBH時(shí)用乙酸鈉(0.2 mol/L，pH 5.8)作為緩沖溶液，用XH-C漩渦混勻器(功率60 W)混勻土壤5 min，在25 ℃培養(yǎng)2 h；測(cè)定NAG時(shí)用乙酸鈉(0.2 mol/L，pH 5.8)作為緩沖溶液，搖床(150 r/min)混勻60 min，在25 ℃培養(yǎng)3 h；測(cè)定LAP時(shí)用超純水作為緩沖溶液，搖床(150 r/min)混勻60 min，在25 ℃培養(yǎng)1 h．本研究結(jié)果可為提高熒光法準(zhǔn)確測(cè)定土壤胞外酶活性提供依據(jù)．