細(xì)菌分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機制研究進(jìn)展*

劉 靜 張昭寰** 吳 倩 陶 倩 黃振華 潘迎捷 趙 勇**

（1）上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2）農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（上海），上海 201306；3）上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

蛋白質(zhì)分泌是細(xì)菌最基本的功能之一，在細(xì)菌發(fā)揮致病性、適應(yīng)環(huán)境、生存及繁殖等生理過程中起著關(guān)鍵作用［1］。分泌系統(tǒng)是細(xì)菌體內(nèi)一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的跨膜蛋白質(zhì)機器，負(fù)責(zé)相關(guān)蛋白質(zhì)的合成、轉(zhuǎn)運及胞外分泌［2］。目前已經(jīng)確定了9種分泌系統(tǒng)（圖1）：按發(fā)現(xiàn)時間順序，分別命名為第Ⅰ型到第ⅠX型分泌系統(tǒng)（T1SS～T9SS）。這些分泌系統(tǒng)依據(jù)其轉(zhuǎn)運機制可被分為一步分泌和兩步分泌［3］：一步分泌系統(tǒng)不需要依賴Sec等通用分泌途徑，可直接將底物從細(xì)胞質(zhì)運輸?shù)郊?xì)胞外環(huán)境或進(jìn)入靶細(xì)胞，主要包括Ⅰ型（T1SS）、ⅠⅠⅠ型（T3SS）、ⅠV 型（T4SS）、VⅠ型分泌系統(tǒng)（T6SS）和Ⅶ型分泌系統(tǒng)（T7SS）；而在兩步分泌系統(tǒng)中，底物首先通過內(nèi)膜跨越轉(zhuǎn)運體（如SecYEG轉(zhuǎn)位蛋白或雙精氨酸易位Tat 系統(tǒng)）轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間，然后通過專門的外膜分泌系統(tǒng)分泌到細(xì)胞外空間，包括ⅠⅠ型（T2SS）、V 型（T5SS）、VⅠⅠⅠ型分泌系統(tǒng)（T8SS）以及ⅠX 型分泌系統(tǒng)（T9SS）。明晰這些分泌系統(tǒng)具體的三維結(jié)構(gòu)，能夠使人們在原子水平上更好地理解其生命調(diào)控機制［4］，有助于細(xì)菌的多元利用和有效控制［5］。

近年來， 隨著X 射線晶體學(xué)（X-ray crystallography）、核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）及冷凍電鏡（cryo-electron microscopy，Cryo-EM）等結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用［6］，細(xì)菌分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及分子機制的研究取得了長足進(jìn)展［7］，對此類研究進(jìn)行全面系統(tǒng)的綜述，有助于對分泌系統(tǒng)跨膜轉(zhuǎn)運機制的理解和認(rèn)知。在國際上，2015年，Costa等［7］對T1SS～T6SS的主要結(jié)構(gòu)和分泌機制進(jìn)行了綜述。2020年，Umrekar 等［8］基于Cryo-EM 解析的T2SS、T3SS、T4SS 以及T6SS 部分復(fù)合物的具體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了綜述。國內(nèi)也有類似的綜述報道，2009年譚雙等［9］對T1SS～T5SS進(jìn)行了綜述。2019年，岑雪等［10］簡要介紹了細(xì)菌的9 種分泌系統(tǒng)。2016年，本課題組［11］也對副溶血性弧菌T3SS和T6SS進(jìn)行了綜述。但是，以上這些綜述多聚焦于分泌系統(tǒng)的功能，缺乏具體結(jié)構(gòu)的深入介紹，而且部分綜述僅針對個別系統(tǒng)進(jìn)行總結(jié)，關(guān)于細(xì)菌分泌系統(tǒng)全面詳盡的綜述亟待開展。

Fig.1 Illustration of bacterial secretion system圖1 細(xì)菌分泌系統(tǒng)示意圖

因此，本文結(jié)合近年來圍繞細(xì)菌T1SS～T9SS的研究，對各分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)信息進(jìn)行了系統(tǒng)整合（表1），總結(jié)了這些分泌系統(tǒng)的分子作用機制，并對其未來的發(fā)展方向進(jìn)行了展望，以期為與細(xì)菌蛋白質(zhì)分泌相關(guān)的致病、耐藥、環(huán)境適應(yīng)性等機制的研究奠定理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)以分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的小分子抑菌物質(zhì)提供精準(zhǔn)的三維靶標(biāo)。

Table 1 The key structural features of bacterial secretion systems表1 細(xì)菌分泌系統(tǒng)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征

續(xù)表1

1 I型分泌系統(tǒng)（type I secretion system，T1SS）

T1SS 是一種廣泛存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分泌裝置，介導(dǎo)多種底物從細(xì)胞質(zhì)一步分泌到細(xì)胞外環(huán)境，通常與營養(yǎng)獲取和毒力有關(guān)［12］。 研 究 表 明， 該 系 統(tǒng) 與 多 藥 外 排 泵（resistance-nodulation-cell division，RND）家族的結(jié)構(gòu)組成密切相關(guān)［13］，主要由內(nèi)膜蛋白（inner membrane component，ⅠMC）、周 質(zhì) 膜 融 合 蛋 白（membrane-fusion protein，MFP） 和外膜孔蛋白（outer-membrane porin，OMP）組成，這3個組分組裝成1個跨越內(nèi)膜和外膜的復(fù)合體，為底物提供一條跨膜轉(zhuǎn)運的通道（圖2a）。

1.1 內(nèi)膜蛋白（IMC）

在T1SS 中，ⅠMC主要屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC transporter）家族，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將結(jié)合的底物從細(xì)胞質(zhì)通過內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到MFP 的周質(zhì)腔［12］。ABC轉(zhuǎn)運蛋白的最小功能單元由2個核苷酸結(jié)合域（nucleotide-binding domains，NBDs）和2個跨膜結(jié)合域（transmembrane binding domains，TMDs）組成（圖2a）。2個TMD結(jié)合形成底物識別位點和底物易位路徑，NBDs 則通過結(jié)合和水解2個ATP 分子為底物的運輸提供動力。

2003年，Schmitt等［43］采用X射線晶體解析技術(shù)，首次解析了大腸桿菌（Escherichia coli）運輸α 溶血素T1SS 內(nèi)膜蛋白HlyB 的NBD 結(jié)構(gòu)域（圖2b），其主要由2個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。第1個結(jié)構(gòu)域（圖2b橙色）由2個β片層和α螺旋組成，第1個β片層由4條反平行β折疊（S1～S4）組成，第2個β片層由6 條平行β 折疊（S3，S8～S12）組成，9 號β 折疊N 端相鄰的Pro-loop 與NBD 的熱穩(wěn)定性和表達(dá)量密切相關(guān)。α 螺旋與典型ABC 轉(zhuǎn)運體NBD 大致保持一致，該螺旋上包含保守的Walker A基序，C端3個殘基呈現(xiàn)310螺旋構(gòu)象，導(dǎo)致Walker A與9號β 折疊的Walker B 基序發(fā)生相互作用。第2個結(jié)構(gòu)域（圖2b 藍(lán)色）為信號域，主要由5 條α 螺旋組成，在底物識別及NBD與TMD的特異性和功能化連接中起到重要作用。此外，通過對比多個已知的NBD 結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，NBD的第二個結(jié)構(gòu)域中包含一段由約30個氨基酸殘基組成的結(jié)構(gòu)多樣化區(qū)域（structurally diverse region，SDR），可與HlyB蛋白的TMD 特異地相互作用，因此該區(qū)域可能在不同NBD 對其同源TMD 的靶向性中發(fā)揮重要作用。2017年，Morgan等［12］采用X射線晶體學(xué)技術(shù)解析了超嗜熱菌（Aquifex aeolicus） T1SS 內(nèi)膜蛋白PrtD，該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為典型的同源二聚體，每個單體包含1個由6個N端跨膜螺旋（TM1～TM6）構(gòu)成的TMD 和1個C 端NBD。其中6個TM 螺旋在NBD上方形成了大約長40 ? 的連續(xù)通道，提供底物進(jìn)入窗口。PrtD 在TM3 和TM6 發(fā)生了高度扭曲，這些扭曲螺旋在T1SS ABC轉(zhuǎn)運蛋白與底物的結(jié)合中起著關(guān)鍵作用。

1.2 膜融合蛋白（MFP）

在T1SS 中，MFP 參與底物識別，預(yù)先與ⅠMC結(jié)合形成穩(wěn)定的ⅠM 復(fù)合物［44］，通過與底物的結(jié)合，誘導(dǎo)ⅠMC 與OMP 接觸，進(jìn)一步通過改變3個組分的構(gòu)象來實現(xiàn)底物的成功分泌。Kim 等［13］于2016年首次發(fā)表了大腸桿菌T1SS膜融合蛋白HlyD可溶性片段的晶體結(jié)構(gòu)（圖2c）。HlyD具有高度延長的α螺旋結(jié)構(gòu)域，長度約為115 ?，由3個α螺旋（α1、α2、α3）和2個連接環(huán)（L1、L2）組成。其中，α3 比α1 和α2 長，導(dǎo)致了α3 能夠與α1 和α2 發(fā)生相互作用：α3 的上半部分區(qū)域與α2 盤繞形成α螺旋發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中L2 在α 螺旋結(jié)構(gòu)域的頂端區(qū)域連接α2和α3。α3和α1的下半部分形成螺旋狀結(jié)構(gòu)。目前解析的HlyD結(jié)構(gòu)尚缺少N端的95個氨基酸殘基，以及C端的106個氨基酸殘基，其完整的結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步解析。

1.3 外膜孔蛋白（OMP）

1997年，Koronakis 等［45］解 析 了 大 腸 桿 菌T1SS外膜蛋白TolC的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域，但是該結(jié)構(gòu)的分辨率較低，僅為12 ?。2000年，該作者進(jìn)一步提升了TolC 晶體結(jié)構(gòu)的分辨率，達(dá)到2.1 ?［14］，TolC 是由β 折疊、α 螺旋和混合α/β 結(jié)構(gòu)域組成的桶裝三聚體，蛋白質(zhì)總長度為140 ?（圖2d）。在三聚體中，12條β折疊鏈采用反平行的方式以右手螺旋形式形成β桶狀結(jié)構(gòu)，12條α螺旋鏈以左手螺旋形式形成α 桶狀結(jié)構(gòu)，2個桶狀結(jié)構(gòu)間通過含有脯氨酸的結(jié)構(gòu)相連接。α螺旋形成的桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部通常保持部分或完全閉塞的狀態(tài)，而β桶頂端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有相對較高的原子位移參數(shù)，賦予其一定的構(gòu)象遷移性，可作為該桶狀結(jié)構(gòu)的“蓋子”以控制其開啟或閉合。α桶的7、8號位螺旋組成外螺旋圈，能夠與3、4 號位內(nèi)螺旋圈進(jìn)行相互作用并發(fā)生解旋行為，從而實現(xiàn)通道的打開和底物的轉(zhuǎn)運。

Fig.2 Illustration of the structural model of the localization of T1SS圖2 T1SS的結(jié)構(gòu)示意圖

2 Ⅱ型分泌系統(tǒng)（type Ⅱ secretion system，T2SS）

T2SS 廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中，屬于兩步分泌，首先通過Sec/Tat 途徑將未折疊的蛋白質(zhì)以多肽形式轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間［46-47］，并在此處實現(xiàn)蛋白質(zhì)的折疊，進(jìn)而將完全折疊的蛋白質(zhì)通過T2SS分泌到細(xì)胞外環(huán)境，其底物包括各種水解酶，也可分泌許多細(xì)菌的重要毒素，如霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的霍亂毒素、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicE.coli，ETEC）和腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagicE.coli，EHEC）［48-50］的不耐熱腸毒素。以大腸桿菌為例，T2SS 主要由總分泌途 徑 跨 膜 蛋 白 （general secretory pathway transmembrane protein，GSP）基因簇調(diào)控的12～15個蛋白質(zhì)組成［51］，按位置可分為3個部分，內(nèi)膜部分主要由內(nèi)膜蛋白GspC、GspL、GspM、多孔膜蛋白GspF以及1個六聚體ATP酶（ATPase）GspE組成，位于周質(zhì)空間部分主要由GspG-K組成的假菌毛結(jié)構(gòu)，外膜蛋白為GspD多聚體（圖3a）。

Fig.3 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅱsecretion system圖3 Ⅱ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

2.1 內(nèi)膜組分

在T2SS中，GspC、GspL和GspM是膜結(jié)合蛋白，均由跨膜片段和周質(zhì)域組成，這些蛋白質(zhì)與GspF 和GspE 結(jié)合，形成內(nèi)膜組裝平臺（assembly platform，AP）。GspL 和GspM 可通過相互作用形成穩(wěn)定的同源/異源二聚體［53］，并與GspC 和GspE相互作用，在內(nèi)膜平臺的穩(wěn)定性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。GspE 是位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的環(huán)狀六聚體ATPase（圖3b），能夠與GspL和GspF相互作用。GspE的N端N1E結(jié)構(gòu)域通過擴(kuò)展接頭連接到N2E結(jié)構(gòu)域，N2E結(jié)構(gòu)域又通過1個較短的柔性接頭連接到C 端ATPase CTE 結(jié)構(gòu)域。GspE 固有的靈活性會在與ATP/ADP結(jié)合后發(fā)生較大范圍的構(gòu)象變化，GspC、GspL、GspM和GspF 4種內(nèi)膜蛋白的構(gòu)象也會隨之產(chǎn)生相應(yīng)改變，從而保證整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［24］。但目前這4種膜蛋白以及AP核心GspF結(jié)構(gòu)尚未解析，對整個AP 機制的認(rèn)識有待進(jìn)一步的探索。

2.2 周質(zhì)空間組分

T2SS包含一類假菌毛（pseudopilus） 蛋白GspG-K，與延伸到細(xì)胞膜外形成的菌毛不同，這種假菌毛結(jié)構(gòu)往往局限于周質(zhì)空間中（圖3a）。最主要的假菌毛蛋白GspG 通過N 端螺旋錨定在內(nèi)膜上，其他假菌毛蛋白GspH、GspⅠ、GspJ 和GspK聚集在GspG 的螺旋結(jié)構(gòu)頂端（圖3a），共同形成T2SS的周質(zhì)結(jié)構(gòu)。在底物插入GspD通道后，通過假菌毛結(jié)構(gòu)的延伸，以活塞或螺旋推進(jìn)的方式將底物推出通道，從而實現(xiàn)底物的轉(zhuǎn)運［54］。

2.3 外膜

分泌蛋白GspD 是T2SS 最主要的外膜蛋白，由6個不同的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括N0、N1、N2、N3、分泌體（secretin）和S（圖3c）［55］，其中，N0、N1、N2 和N3 組成N 端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD），與底物和T2SS的內(nèi)膜組分相互作用；Secretin 和S 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成C 端結(jié)構(gòu)域（Cterminal domain，CTD），形成外膜孔狀結(jié)構(gòu)。2005年，Chami 等［56］運用冷凍電鏡結(jié)合單顆粒分析（single particle analysis，SPA）技術(shù)首次解析了產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）GspD 結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為十二聚體，基本特征是由2個環(huán)狀結(jié)構(gòu)在兩側(cè)形成腔室，中間存在1個具有堵塞通道的“塞子”結(jié)構(gòu)，以防止細(xì)胞液外滲。2010年，Reichow等［55］運用冷凍電鏡解析了霍亂弧菌GspD的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)也為十二倍對稱的多聚體，但較克雷伯氏菌GspD 結(jié)構(gòu)多出1個向外膜突出的結(jié)構(gòu)，長約80?（圖3c）。因此，GspD外膜分泌蛋白被分為弧菌型和克雷伯氏菌型2個亞類（圖3c）。

2017年，Yan 等［18］采用冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)的方法解析了GspD 全長復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（圖3c）。該研究首次揭示了GspD復(fù)合物為十五倍對稱多聚體，不同于之前報道的十二倍對稱多聚結(jié)構(gòu)。該研究清晰展示了GspD 的N 端為環(huán)形通道結(jié)構(gòu)，C 端為雙層β 桶結(jié)構(gòu)，由1個內(nèi)β 桶（inner barrel）和1個外β 桶（outer barrel）組成，由外表面上的S 結(jié)構(gòu)“手把手”圍繞起來，從而維持雙層β桶的穩(wěn)定性。中間通道上保守的甘氨酸為其底物分泌的關(guān)鍵位點，能夠使關(guān)閉的通道變成半開放狀態(tài)，促進(jìn)底物通過GspD通道向外分泌。

3 Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲ secretion system，T3SS）

T3SS 是9 種分泌系統(tǒng)中組成最復(fù)雜的分泌系統(tǒng)，廣泛存在于沙門氏菌（Salmonellaspp.）、弧菌（Vibriospp.）、志賀氏菌（Shigellaspp.）、假單胞菌（Pseudomonasspp.）等致病性革蘭氏陰性菌中，可將效應(yīng)物直接注射到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或質(zhì)膜上，以實現(xiàn)細(xì)菌的定殖和入侵［57］。T3SS由20多種蛋白質(zhì)組成，在物種間廣泛保守，以一步機制分泌不同的底物（圖4a），T3SS各亞基在不同物種中命名不同，因此本文采用標(biāo)準(zhǔn)化的“Sct”命名進(jìn)行描述［58］。截至目前，人們已經(jīng)對許多物種的T3SS進(jìn)行了研究，并借助X射線晶體學(xué)技術(shù)及冷凍電鏡技術(shù)確定了多數(shù)亞基的精確位置（圖4）。該系統(tǒng)主要包括：基底（basal body）、底物輸出裝置（export apparatus）、 胞 質(zhì) 環(huán) 與 分 選 平 臺（cytoplasmic ring and sorting platform）、內(nèi)桿及針狀復(fù)合物（inner rod，needle and tip complex）、轉(zhuǎn)運孔（translocation pore）。

Fig.4 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅲsecretion system圖4 Ⅲ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

3.1 基底

T3SS 基底是嵌入細(xì)菌內(nèi)膜和外膜的一系列環(huán)狀結(jié)構(gòu)［59］，主要由SctC、SctD 和SctJ 構(gòu)成，其中SctC形成外膜環(huán)，SctJ和SctD在內(nèi)膜形成同心環(huán)。SctC、SctD 和SctJ 都含有1個結(jié)構(gòu)保守的楔形折疊，這是內(nèi)膜環(huán)和外膜環(huán)共同的成環(huán)基序，有助于環(huán)的組裝［60］。SctC 的N 端結(jié)構(gòu)域深入周質(zhì)，與SctD直接接觸，實現(xiàn)內(nèi)外膜的連接（圖4a）。2016年，Worrall等［19］運用冷凍電鏡解析了鼠傷寒沙門氏菌T3SS 基底的結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)為典型的“螺母”與“螺栓”結(jié)構(gòu)特征。其中，內(nèi)膜環(huán)由PrgH（SctD）和PrgK（SctJ）組成，PrgH 包裹PrgK 形成2個呈二十四倍對稱的嵌套同心環(huán)；外膜環(huán)為ⅠnvG（SctC） 蛋白（圖4b），為十五倍對稱多聚體，并在外膜中形成雙層β 桶，其中外層桶狀結(jié)構(gòu)由β 三明治結(jié)構(gòu)組成，內(nèi)層β 桶形成“周質(zhì)門”，確保底物選擇性地通過β桶。

3.2 底物輸出裝置

底物輸出裝置位于基底下方，嵌入在內(nèi)膜中，充當(dāng)?shù)孜锏娜肟冢? 種膜蛋白組裝而成：SctR、SctS、SctT、SctU 和SctV（圖4a）。據(jù)估計，共有104 種跨膜結(jié)構(gòu)域參與了內(nèi)膜輸出裝置的形成［61］，呈現(xiàn)高度的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。SctR、SctS和SctT構(gòu)成1個以SctR 中心的五聚體，對底物輸出裝置的裝配至關(guān)重要［62］。SctV 形成1個同源異構(gòu)環(huán)，位于基底和ATPase 復(fù)合體之間，能夠被整合到由SctR、SctS 和SctT 預(yù)組裝形成的“注射器”基體中。SctU 是一種自體蛋白酶（autoprotease），其C 端結(jié)構(gòu)域在切割前后呈現(xiàn)不同的構(gòu)象，促使其與不同T3SS 元件發(fā)生相互作用，從而適應(yīng)底物分泌過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換［21］。目前仍缺乏SctR、SctS 和SctT 的結(jié)構(gòu)信息以及SctU 和SctV 的跨膜結(jié)構(gòu)域，有待進(jìn)一步研究。

3.3 胞質(zhì)環(huán)與分選平臺

胞質(zhì)環(huán)（SctQ）位于底物輸出裝置下方，與ATPase 復(fù)合體（SctN、SctL、SctO）一起組成底物的裝載和分選平臺（圖4a）［63］。志賀氏菌、沙門氏菌等細(xì)菌的T3SS 分選平臺都呈現(xiàn)為1個六倍旋轉(zhuǎn)對稱性結(jié)構(gòu)，其具有中心樞紐和6個輻條（Spoke），每個輻條末端具有豆莢狀結(jié)構(gòu)。在分選平臺中，ATPase 復(fù)合體中的SctN 由連接蛋白SctO錨定在SctV 的異構(gòu)環(huán)上，從而連接ATPase 復(fù)合體與底物輸出裝置。而胞質(zhì)環(huán)（SctQ）和SctK 位于SctL 的輻條末端，為SctN 提供對接位點，將SctN錨定在胞質(zhì)環(huán)上，并調(diào)節(jié)其活性［64］。整體而言，胞質(zhì)環(huán)負(fù)責(zé)底物的裝載與卸載［65］，ATPase 復(fù)合體為整個T3SS的運行提供能量［66］。

3.4 內(nèi)桿及針狀復(fù)合物

內(nèi)桿（inner rod）由SctⅠ亞基螺旋組裝而成，通過“插座（socket）”結(jié)構(gòu)連接到內(nèi)膜環(huán)，可將針狀復(fù)合物（needle complex）錨定到基體［59］。針狀復(fù)合物由數(shù)百個SctF 亞基螺旋組裝而成（圖4c）。每個單體的N 端結(jié)構(gòu)域位于針管表面，C 端指向針腔，非保守的殘基暴露在針狀復(fù)合物表面，這可能反映了細(xì)菌逃避宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)的策略［26］。針狀復(fù)合物在細(xì)胞外被尖端復(fù)合體（tip complex）SctA 覆蓋，可以阻止針狀復(fù)合物的伸長，也可防止效應(yīng)物的過早分泌，幫助轉(zhuǎn)運孔在宿主細(xì)胞膜的表面定位［67］。

3.5 轉(zhuǎn)運孔

轉(zhuǎn)運孔是由T3SS轉(zhuǎn)運子SctB和SctE在宿主細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中形成的異源低聚復(fù)合體［68］，也可自組裝成異源十六聚體跨膜復(fù)合物［69］。最近的全基因組篩查顯示，轉(zhuǎn)運孔的組裝和對接需借助宿主細(xì)胞的趨化因子受體［70］、表面硫酸化和巖藻糖化［71］、波形中間絲蛋白［72］等。但目前該結(jié)構(gòu)缺乏高分辨率信息，其具體的機制和功能未知。

4 IV 型分泌系統(tǒng)（type IV secretion system，T4SS）

ⅠV 型 分 泌 系 統(tǒng)（Type ⅠV secretion system，T4SS）是一種廣泛存在于細(xì)菌中多功能、多組分的跨膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。與已發(fā)現(xiàn)分泌系統(tǒng)不同，T4SS可對DNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)運，因此該系統(tǒng)可實現(xiàn)細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)移、DNA釋放和攝取、效應(yīng)蛋白分泌等功能，以幫助細(xì)菌增強適應(yīng)性和生存能力［73］。其中，T4SS 所介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移是基因水平轉(zhuǎn)移的重要機制之一，多數(shù)接合型質(zhì)粒和整合性接合元件都依靠自身編碼的T4SS 實現(xiàn)耐藥性和致病性等生物學(xué)性狀 的 傳 播［74］。植物病原菌根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） Ti 質(zhì)粒、大腸桿菌R388、pKM101等接合質(zhì)粒所編碼的VirB/VirD4系統(tǒng)是T4SS的典型例子［75-76］，該系統(tǒng)由12個亞基組成， VirB1、 VirB2、 VirB3、 VirB4、 VirB5、VirB6、VirB7、VirB8、VirB9、VirB10、VirB11 和VirD4 （圖5a）。其 中，VirB6、VirB7、VirB8、VirB9 和VirB10 與VirB3 形成支架和轉(zhuǎn)位裝置，VirB2 和VirB5 形成延伸到細(xì)胞外空間的菌毛，VirB1 是一類周質(zhì)溶菌糖基轉(zhuǎn)移酶（lytic transglycosylase），可降解肽聚糖層，VirB4、VirB11 和VirD4 則是該系統(tǒng)3個重要的供能ATPase，按各亞基所處位置將該系統(tǒng)分為ATPase、內(nèi)膜復(fù)合物、外膜復(fù)合物及菌毛4個部分。

Fig.5 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅳsecretion system圖5 Ⅳ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

4.1 ATPase

T4SS 的3個ATPase（VirD4、VirB4、VirB11）均為環(huán)狀六聚體，位于易位通道的底部，構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)能量中心并在底物轉(zhuǎn)運過程中起到重要作用（圖5b）。

VirB11 屬于“Traffic ATPases”家族，該蛋白質(zhì)的自磷酸化被認(rèn)為在激活底物運輸中起重要作用［77］。2000年，Yeo等［78］運用X射線晶體解析技術(shù)解析了幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori）HP0525（VirB11）ADP 結(jié)合形式的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由CTD組裝成1個“六爪抓鉤”，附著在由NTD組成的六聚環(huán)上，將結(jié)合的核苷酸夾在中間，通過調(diào)控ATP結(jié)合或釋放實現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的開放與封閉［79］。

VirD4 是底物進(jìn)入易位通道之前的結(jié)合受體，對接合過程至關(guān)重要［80-81］。R388質(zhì)粒編碼的TrwB是VirD4超家族的結(jié)構(gòu)原型，2001年，Gomis-Ruth等［31］運用X 射線晶體解析技術(shù)解析了TrwB 可溶部分的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有1個保守α/β 核苷酸結(jié)合域（NBD）和1個與底物結(jié)合有關(guān)且序列可變的α結(jié)構(gòu)域（AAD），通過N端的膜錨定序列拴在內(nèi)膜上，為底物提供受體或識別模塊，并參與單鏈DNA 轉(zhuǎn)移［82-83］。此外，VirD4 還被證明存在1個N端跨膜結(jié)構(gòu)域［80］，但該結(jié)構(gòu)目前尚未解析，因此底物在內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運機制仍然未知。

VirB4 通常也由CTD 和NTD 2個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，其CTD是VirB4蛋白在進(jìn)化上最保守的部分。2012年，Walldén等［29］運用冷凍電鏡解析了乙醇棲熱厭氧桿菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）VirB4 的CTD，該結(jié)構(gòu)包含催化必需的Walker A和Walker B基序（圖5b）。其保守程度較低的NTD被認(rèn)為能夠與細(xì)胞膜形成相互作用，根據(jù)物種的不同，預(yù)測有1～3個跨膜區(qū)，其酶活性對底物從VirB11到內(nèi)膜通道VirB6/VirB8的移交至關(guān)重要［84］。此外，該蛋白質(zhì)對菌毛的產(chǎn)生［85］和毒力［86］至關(guān)重要。

VirD4、VirB4 和VirB11 被證明可能存在一定地相互作用［87］，2018年，Chetrit等［88］運用冷凍電鏡斷層掃描技術(shù)解析了嗜肺軍團(tuán)菌Dot 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，其中DotO（VirB4）與DotB（VirB11）組裝產(chǎn)生了1個細(xì)胞質(zhì)通道，DotL（VirD4）則臨時地與效應(yīng)物或細(xì)胞信號組裝，引導(dǎo)底物的轉(zhuǎn)運。因此，這3個ATPase 很可能形成1個大的ATPase 復(fù)合體，為底物的轉(zhuǎn)位提供通道及能量，但仍需要進(jìn)一步驗證。

4.2 內(nèi)膜復(fù)合物

內(nèi)膜復(fù)合物主要由VirB3、VirB6、VirB8 組成，以不同方式促進(jìn)轉(zhuǎn)運通道的形成。VirB8 是一種雙功能內(nèi)膜蛋白，由NTD 和1個較大的周質(zhì)CTD 組成，2006年，Bailey 等［32］運用X 射線晶體解析技術(shù)解析了根癌農(nóng)桿菌VirB8的周質(zhì)CTD，呈現(xiàn)為同源二聚體，在二聚體接觸界面存在2個高度保守域，對二聚體的相互作用及穩(wěn)定性起到重要作用，并為其他VirB蛋白和DNA底物提供潛在結(jié)合位點，但目前該蛋白質(zhì)的NTD 尚未解析。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，VirB3 與VirB2 和VirB4 在內(nèi)膜上相互作用，但其結(jié)構(gòu)尚未解析，對T4SS 的確切作用也尚不清楚［89］。VirB6是一種多位點內(nèi)膜蛋白，由1個周 質(zhì)NTD、5個TM 和1個 細(xì) 胞 質(zhì) 內(nèi) 的CTD 構(gòu)成［90］，對底物跨內(nèi)膜的分泌具有重要作用［91］，但目前該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)尚未解析，仍有待進(jìn)一步解析。

4.3 外膜復(fù)合物

2018年，Sgro等［33］運用冷凍電鏡解析了柑桔黃單胞菌（Xanthomonas citri）T4SS 外膜復(fù)合物，該結(jié)構(gòu)由VirB7、VirB9 和VirB10 組成，呈十四倍對稱，由插入外膜的外層（O 層）和內(nèi)層（Ⅰ層）組成，構(gòu)成1個中空腔室。其中，Ⅰ層由VirB9 和VirB10 的N 端結(jié)構(gòu)域組成，通過VirB10NTD錨定在內(nèi)膜上，在底部形成1個直徑為80?的孔。O層由VirB7 以及VirB9 和VirB10 的CTD 構(gòu)成（圖5c），VirB10CTD在頂部形成“蓋子”，并存在1個直徑為45? 的孔，允許O 層的腔室和細(xì)胞外環(huán)境相聯(lián)系，該結(jié)構(gòu)還存在1個脯氨酸富集域，負(fù)責(zé)核心復(fù)合體組裝和底物分泌［92］。VirB7是一種插入外膜的小分子脂蛋白，主要由1個α/β 構(gòu)成的球狀CTD、1個與VirB9CTD相互作用的N 端序列以及1個可與其他VirB7 亞基相互作用的α 螺旋組成，在外膜復(fù)合物的形成中起到重要作用。VirB9由2個結(jié)構(gòu)域組成，其NTD 由1個β 三明治結(jié) 構(gòu)及1個α 螺旋組成，CTD 則為1個由β 折疊組成的結(jié)構(gòu)域，這2個結(jié)構(gòu)域由1個柔性α 螺旋連接子連接［93］。VirB10NTD與VirB9NTD具有一定的柔性，可在底物轉(zhuǎn)運過程中產(chǎn)生相應(yīng)的構(gòu)象變化，以適應(yīng)底物的加載及轉(zhuǎn)運。

4.4 菌毛

T4SS 菌毛由主要蛋白VirB2 和次要蛋白VirB5構(gòu)成［94］。目前，VirB2 蛋白的結(jié)構(gòu)解析主要圍繞F菌毛的研究展開。F菌毛是延伸到細(xì)菌細(xì)胞外空間的細(xì)絲，介導(dǎo)細(xì)菌對靶細(xì)胞的附著，通過收縮將2個細(xì)胞拉在一起，從而建立直接的細(xì)胞-細(xì)胞接觸，并最終形成耐SDS 和抗剪切的“交配連接”［95］。2016年，Costa等［34］運用冷凍電鏡解析了分別由F質(zhì)粒和pED208質(zhì)粒編碼T4SS的F型菌毛結(jié)構(gòu)，二者均由VirB2 五聚體堆積而成（圖5d）。在該結(jié)構(gòu)中，磷脂酰甘油（PG）與VirB2 以1∶1 的比例存在于菌毛中，以促進(jìn)菌毛與宿主細(xì)胞膜融合、重新插入供體細(xì)胞、最終菌毛解聚等動態(tài)過程。VirB5位于菌毛的頂端，在菌毛組裝、DNA 轉(zhuǎn)移及特異性識別等方面發(fā)揮重要作用［94］。2003年，Yeo等［35］運用X 射線晶體解析技術(shù)解析了pKM101 質(zhì)粒編碼的VirB5同源物TraC，該蛋白質(zhì)由三螺旋束和松散的球狀附屬物組成，位點突變結(jié)果表明VirB5在菌毛組裝中發(fā)揮重要作用。

5 Ⅴ型分泌系統(tǒng)（type Ⅴ secretion system，T5SS）

T5SS 也被稱自主轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)（autotransporters），其特點在于該系統(tǒng)的分泌蛋白C 端β 結(jié)構(gòu)域一旦插入OM，就形成了允許分泌轉(zhuǎn)運的β 桶狀結(jié)構(gòu)，從而驅(qū)動蛋白胞外分泌［96］。與T2SS 相似，T5SS 也為兩步分泌系統(tǒng)（圖6a），主要參與細(xì)胞間的黏附和生物被膜的形成［97］。

自主轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要由信號肽（signal peptide）、乘客結(jié)構(gòu)域（“Passenger”domain）及易位單元（translocation domains）［4］3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。信號肽存在于自主轉(zhuǎn)運蛋白的N 端，可將其定位到內(nèi)膜Sec 轉(zhuǎn)運蛋白；乘客結(jié)構(gòu)域，又被稱為α 結(jié)構(gòu)域或N結(jié)構(gòu)域，它可賦予自主轉(zhuǎn)運蛋白不同的功能；易位單元也被稱為β結(jié)構(gòu)域或C結(jié)構(gòu)域，便于乘客結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運［104］。目前，根據(jù)T5SS 不同的結(jié)構(gòu)及跨膜特性將其分為5類，即Va～Ve（圖6b）。

Fig.6 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅴsecretion system圖6 Ⅴ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

5.1 Va

Va 為經(jīng)典的自主轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（autotransport systems，ATS），2010年，van den Berg［36］運用X射線晶體學(xué)技術(shù)解析了第一個全長自主轉(zhuǎn)運蛋白EstA，該蛋白質(zhì)存在1個相對狹窄的12股β桶狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)通過β桶管腔內(nèi)的α螺旋連接到乘客結(jié)構(gòu)域。該蛋白質(zhì)乘客結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)為1個以α螺旋和環(huán)狀結(jié)構(gòu)為主的球形折疊，為底物換乘提供動力。不過，大多數(shù)Va 的乘客結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)為螺旋狀β 折疊結(jié)構(gòu)，如百日咳桿菌黏附素（pertactin）（PDB：1DAB）（圖6b）。對Va 而言，自體轉(zhuǎn)運蛋白通過Sec轉(zhuǎn)運體穿過內(nèi)膜，其所含的延伸信號肽仍附著在Sec上。在周質(zhì)中，伴侶蛋白與自主轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合并打開，隨后信號肽被信號肽酶切割，釋放自體轉(zhuǎn)運蛋白。自主轉(zhuǎn)運蛋白C 端被BamA 的POTRA結(jié)構(gòu)域識別，連接域在β桶內(nèi)形成1個發(fā)夾，并將乘客結(jié)構(gòu)域拉至分泌孔，進(jìn)而在蛋白酶的作用下將其轉(zhuǎn)運至胞外［104］。

5.2 Vb

Vb 又稱為雙伴侶轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（two-partner secretion systems，TPSS），與經(jīng)典的自主轉(zhuǎn)運蛋白不同，TPSS 中乘客結(jié)構(gòu)域和易位單元位于不同的多肽鏈中，乘客結(jié)構(gòu)域被稱為TpsA，易位單元被稱為TpsB［102］。與眾多自主轉(zhuǎn)運蛋白一樣，TpsA蛋白含有1個延伸的信號肽［105］，其N 端含有1個高度保守的結(jié)構(gòu)域，約300個殘基構(gòu)成，被稱為雙伴侶分泌（TPS）結(jié)構(gòu)域［106］。百日咳博代式桿菌（Bordetella pertussis）絲狀血凝素黏附素（FHA）/FhaC 是典型的雙伴侶分泌系統(tǒng)［107］。2004年，Clantin 等［108］利用X 射線晶體學(xué)技術(shù)解析了FHA的TPS 結(jié)構(gòu)域，呈現(xiàn)為一個β 螺旋，同時攜帶3個螺旋外基序，其中β 螺旋為FHA 整體結(jié)構(gòu)的構(gòu)建提供支架，螺旋外基序則起到識別易位單元等作用。2007年，該作者解析了FhaC 的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為一個16股β桶，與EstA同源。β桶內(nèi)存在一個N 端α 螺旋，周質(zhì)部分由2個POTRA（P）結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，該結(jié)構(gòu)域提供了TpsA 的結(jié)合位點［109］。TpsA 的TPS 結(jié)構(gòu)域能夠與其同源TpsB 的POTRA結(jié)構(gòu)域相互作用［110］，進(jìn)而通過自主轉(zhuǎn)運蛋白水解機制將TpsA蛋白轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外空間［111］。

5.3 Vc

Vc 為三聚體自主轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，該類蛋白通常為黏附素（trimeric autotransporter adhesins，TAAs），能夠不依賴自主轉(zhuǎn)運蛋白的水解機制進(jìn)行釋放。TAAs具有模塊化和重復(fù)的結(jié)構(gòu)，常以三聚體的形式存在。2006年，Meng 等［104］解析了流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae）黏附素Hia 易位單元的結(jié)構(gòu)，為三聚體組成的β 桶狀結(jié)構(gòu)，每個亞基由4條β鏈和1條α螺旋構(gòu)成，桶內(nèi)由3 條α 螺旋貫穿。2012年，Shahid 等［112］利用固態(tài)核磁共振技術(shù)解析了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）黏附素YadA 易位單元的結(jié)構(gòu)，也呈現(xiàn)為三聚體組成的β桶狀結(jié)構(gòu)。

5.4 Vd及Ve自主轉(zhuǎn)運系統(tǒng)

Vd 自主轉(zhuǎn)運系統(tǒng)最早被發(fā)現(xiàn)于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）Patatin樣酯酶PlpD的分泌過程，其乘客結(jié)構(gòu)域是一種解脂酶，在自身轉(zhuǎn)運完成后被自動催化水解。但與Va 系統(tǒng)不同，其乘客結(jié)構(gòu)域通過POTRA 結(jié)構(gòu)域連接到易位單元β 桶結(jié)構(gòu)域［113］，但其具體結(jié)構(gòu)仍未解析。Ve自主轉(zhuǎn)運系統(tǒng)是T5SS 的新成員，2012年，Leo 等［111］根據(jù)結(jié)構(gòu)特征首次將緊密黏附素/侵襲素家族蛋白稱為Ve 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，其乘客結(jié)構(gòu)域與易位單元的位置與Va 系統(tǒng)相反，并且在細(xì)菌表面形成寡聚復(fù)合物，該復(fù)合物C 端的易位單元能夠相互作用形成1個β桶狀結(jié)構(gòu)，起到膜錨定作用。但目前仍缺乏Ve 的整體結(jié)構(gòu)，有待進(jìn)一步解析。

6 VI 型分泌系統(tǒng)（Type VI secretion system，T6SS）

T6SS 是一種類似“弩”的跨越細(xì)胞膜的大分子機器，首次發(fā)現(xiàn)于非O1/O139 的霍亂弧菌中［114］，它可將底物注入靶細(xì)胞或環(huán)境中，從而實現(xiàn)致病性、細(xì)菌間交流、生物被膜形成、環(huán)境應(yīng)激等細(xì)菌生理反應(yīng)［115-116］。與其他分泌系統(tǒng)不同，該系統(tǒng)可同時將多個效應(yīng)物輸送到靶細(xì)胞。T6SS 主要由13個保守的、必不可少的核心部件和幾個附屬部件組成（圖7a）［117-118］，依據(jù)其所處位置大致可分為膜復(fù)合體和尾部復(fù)合物。其中，尾部復(fù)合體與噬菌體的可收縮尾部具有一定相似性［119］，通過膜復(fù)合體錨定在細(xì)胞膜上。

Fig.7 Illustration of the structural model of the localization of type Ⅵsecretion system圖7 Ⅵ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

6.1 膜復(fù)合物

T6SS 膜 復(fù) 合 物 由TssJ、TssL 和TssM 組 成，TssM 將外膜脂蛋白TssJ 與內(nèi)膜蛋白TssL 連接［118］，組成從細(xì)胞質(zhì)延伸到周質(zhì)空間的蛋白質(zhì)復(fù)合物。2015年，Durand等［37］利用負(fù)染電子顯微鏡確定了完全組裝的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，該復(fù)合物呈現(xiàn)五倍對稱構(gòu)象，其中，TssM 由2個結(jié)構(gòu)域組成，其NTD 是由4個α 螺旋組成的1個螺旋束，一側(cè)被β 發(fā)夾覆蓋，另一側(cè)被C端伸展部分覆蓋。CTD則是由9條β鏈組成的β三明治結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與TssJ相連（圖7b）。TssJ結(jié)構(gòu)與TssM的CTD類似，由2個4條β鏈組成的1個β片層和1個α螺旋組成。

6.2 尾部復(fù)合物

研究表明，T6SS 尾部復(fù)合體由類似于噬菌體可收縮尾巴的結(jié)構(gòu)元件組成， 包括基板TssK-TssF-TssG、刺突蛋白VgrG、尾鞘TssB-TssC和內(nèi)管Hcp 管（Hcp tube）。其中，尾鞘為垂直于內(nèi)膜的長管狀結(jié)構(gòu)并深入細(xì)胞質(zhì)［121］，刺突蛋白、內(nèi)管和尾鞘在基板平臺組裝而成，TssK 將膜復(fù)合物與尾部復(fù)合物連接在一起。

6.2.1 基板復(fù)合物TssK-TssF-TssG

在T6SS 組裝過程中，基板對接膜復(fù)合物，可引發(fā)尾部管/鞘聚合，還可作為效應(yīng)物分揀平臺［121-122］，通過VgrG綁定效應(yīng)因子［123］，因此基板是T6SS 的核心部件。2018年，Cherrak 等［38］運用冷凍電鏡解析了大腸桿菌的基板復(fù)合物，該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)為由楔形復(fù)合物亞基組成的六聚體，在楔形復(fù)合物中，TssG 和2個TssF（TssFa 和TssFb）組裝成T6SS 楔形復(fù)合物的金字塔帽，2個TssK 三聚體與TssG 相互作用實現(xiàn)楔形復(fù)合物的組裝，在每個分泌周期中，楔形復(fù)合物的延遲聚合和快速循環(huán)組裝有助于VgrG及效應(yīng)物的釋放。

TssK 三聚體亞基從N 端到C 端依次可分為N端α 螺旋、β 夾心結(jié)構(gòu)域（也稱為Shoulder 域）、4條α螺旋組成的螺旋束（也稱為Neck區(qū)）和C端α/β 結(jié)構(gòu)域（也稱為Head 域）（圖7c）4個部分，TssK 是介導(dǎo)基板對接膜復(fù)合物的主要因素。最近發(fā)現(xiàn)［124］，TssK結(jié)構(gòu)域與長尾噬菌體（Siphophage）受體結(jié)合蛋白具有同源性，但它已經(jīng)進(jìn)化出一個特定的C 端Head 結(jié)構(gòu)域，以膜復(fù)合物為受體，實現(xiàn)連接。

TssG由2個球形區(qū)域組成，TssG-D1由Head域組成，TssG-D2 則由Body 域和Foot 域組成，Neck域?qū)⑵浞珠_（圖7d）。TssG是楔形復(fù)合體的中心骨架，將TssFa與TssFb相連（圖7d）。

TssF 是一種球狀蛋白，其N 端延伸部分稱為Antenna結(jié)構(gòu)域，由2條α螺旋組成，而C端球形結(jié)構(gòu)域可分為5個亞域。結(jié)構(gòu)域1（TssF-D1）呈現(xiàn)β三明治結(jié)構(gòu)，兩側(cè)是含有短α 螺旋的環(huán)；結(jié)構(gòu)域2（TssF-D2）也是β 三明治結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)域3（TssFD3）是α螺旋結(jié)構(gòu)域，由3個短螺旋組成；結(jié)構(gòu)域4（TssF-D4）是由1個螺旋和4 條β 折疊鏈組成的α/β 片層；結(jié)構(gòu)域5（TssF-BD）稱為分支域，將Antenna 與TssF-D1、TssF-D2 以及TssF-D3 連接組成β-三明治結(jié)構(gòu)。

6.2.2 VgrG刺突蛋白

VgrG 刺突蛋白位于內(nèi)管前端，其C 端針狀β螺旋能夠穿透宿主細(xì)胞膜，并可連接其他效應(yīng)物的結(jié)構(gòu)域［121］。PAAR蛋白可在VgrG三聚體頂端形成圓錐形結(jié)構(gòu)，使尖端變尖（圖7d），幫助VgrG 對宿主細(xì)胞的插入。2013年，Shneider 等［120］運用X射線晶體學(xué)技術(shù)解析了PAAR-VgrG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，其中，僅解析了VgrG 的可溶性部分，為3個β 片層組成的針狀β螺旋，PAAR呈現(xiàn)為9條β折疊鏈構(gòu)成的錐形結(jié)構(gòu)，其中3條β折疊鏈形成錐形結(jié)構(gòu)底座與VgrG結(jié)合，另外6個β折疊鏈形成3個指向錐體頂點的β 發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)完全占據(jù)β 螺旋的C端結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)在靶細(xì)胞細(xì)胞膜上產(chǎn)生開口，并且作者預(yù)測PAAR 蛋白可攜帶效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與VgrG 結(jié)合，通過T6SS 轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞［125］。因此，T6SS 可在鞘收縮驅(qū)動的易位中向宿主細(xì)胞運送多個效應(yīng)因子。

6.2.3 尾鞘TssB-TssC

2014年，Kube 等［126］運用冷凍電鏡解析了霍亂弧菌尾鞘的結(jié)構(gòu)，由6個TssB-TssC 絲狀復(fù)合物構(gòu)建，以30°旋轉(zhuǎn)角度堆疊在一起，形成六倍對稱的齒輪狀結(jié)構(gòu)（圖7e），并且該結(jié)構(gòu)存在1個由4條β 鏈組成的核心區(qū)，用于穩(wěn)定尾鞘結(jié)構(gòu)。2017年，Wang等［39］通過在VipA（TssB）N端插入3個氨基酸殘基，獲得了延伸狀態(tài)的霍亂弧菌T6SS 尾鞘-內(nèi)管復(fù)合物，作者進(jìn)一步揭示了T6SS通過推動和旋轉(zhuǎn)內(nèi)管來進(jìn)行尾鞘收縮，以穿透靶細(xì)胞膜。此外，ATPase ClpV可實現(xiàn)對尾鞘的分解，以確保尾鞘亞基的循環(huán)組裝［121］。

6.2.4 內(nèi)管Hcp管

內(nèi)管由溶血素共調(diào)解蛋白（hemolysincoregulated protein，Hcp）構(gòu)成，Hcp 既可介導(dǎo)細(xì)菌的宿主體內(nèi)定殖，還可實現(xiàn)對宿主的接觸性溶血［127］，具有結(jié)構(gòu)蛋白和效應(yīng)蛋白的雙重作用［128］。到目前為止，已經(jīng)確定了6個Hcp的晶體結(jié)構(gòu)，均具有相似的六面體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其亞基通常由2個β片層和1個α螺旋組成［129-132］，但其功能差異較大。Suarez等［133］研究表明，銅綠假單胞菌的Hcp降低了巨噬細(xì)胞對細(xì)菌的攝取，抑制宿主免疫反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)菌復(fù)制和傳播，但Lim等［134］對類鼻疽伯克氏菌（Burkholderia pseudomallei）Hcp 的研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)Hcp對細(xì)胞信號或細(xì)菌致病性存在任何影響。因此，Hcp 在不同細(xì)菌中可能存在一定差異，需要得到進(jìn)一步的探究。

7 VII 型分泌系統(tǒng)（Type VII secretion system，T7SS）

T7SS是革蘭氏陽性菌所特有的蛋白分泌系統(tǒng)，用于代替Sec 或Tat 途徑，最早在疫苗株牛結(jié)核分枝 桿 菌（Mycobacterium tuberculosis） 中 被 發(fā)現(xiàn)［135］。研究表明，該菌攜帶5個相鄰的T7SS（Esx-1至Esx-5），且具有不同的生理功能，其中研究較多的是Esx-1 和Esx-5［136-137］。Esx-1 參與細(xì)菌對吞噬小體的逃逸，對細(xì)菌的毒力至關(guān)重要。Esx-5 只存在于生長緩慢的分枝桿菌中，參與宿主的免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)和細(xì)菌生物被膜完整性的調(diào)控［136］。目前，T7SS的結(jié)構(gòu)尚未得到完整解析，且由于該系統(tǒng)外膜蛋白尚未明確，因此本文僅對該系統(tǒng)的組成進(jìn)行介紹。

目前，預(yù)測形成T7SS 的蛋白質(zhì)有EccA、EccB、EccC、EccD、EccE 和MycP 6 種（圖1）。除可溶性ATPase EccA外，其余均為膜蛋白。EccC是屬于FtsK/SpoⅠⅠⅠE 家族的ATPase，其遠(yuǎn)端NBD與底物EsxB 結(jié)合，激活A(yù)TPase 的寡聚及酶活性。EccD亞基預(yù)測有11個的跨膜螺旋，因此推測它可能參與了轉(zhuǎn)位通道的形成［138］。然而，關(guān)于它的確切作用或其他T7SS 亞單位EccB 和EccE 的功能尚不清楚。2017年，Beckham等［139］運用負(fù)染電鏡解析了蟾分枝桿菌（Mycobacterium xenopi）ESX-5亞復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)，EccB5、EccC5、EccD5和EccE5呈現(xiàn)為1個5 nm 孔洞的六倍對稱復(fù)合物，約1.5 Mu，足以允許折疊的EsxA/EsxB底物轉(zhuǎn)運。但目前T7SS 外膜蛋白的具體結(jié)構(gòu)和底物的分泌機制未知，有待進(jìn)一步探索。

8 VIII 型分泌系統(tǒng)（type VIII secretion system，T8SS）

T8SS 被稱為淀粉樣卷曲纖維（Curli）生物合成途徑，多存在于腸桿菌科中，用來分泌Curli，該纖維蛋白由CsgA 和CsgB 兩種亞基組成，能夠促進(jìn)生物被膜的形成，并與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，以保護(hù)細(xì)菌抵御惡劣環(huán)境［140］。作為兩步分泌系統(tǒng)，T8SS需要依賴Sec將底物轉(zhuǎn)運至周質(zhì)空間，再由外膜蛋白運輸?shù)侥ね猓▓D8a）。

T8SS 的外膜復(fù)合物主要由可溶性輔助因子CsgE、CsgF 以及外膜脂蛋白CsgG 組成。CsgE 和CsgF 介導(dǎo)Curli 蛋白的分泌和定位［141］。這些蛋白質(zhì)發(fā)揮不同作用，其中CsgE被認(rèn)為是CsgA的特異性伴侶，既幫助CsgA 分泌，還會抑制體外CsgA聚合。CsgF 則為CsgB 的伴侶蛋白，確保CsgB 表面 暴 露，從 而 與CsgA 發(fā) 生 聚 合［142］。2014年，Goyal 等［143］運用X 射線晶體學(xué)技術(shù)解析了大腸桿菌CsgG 的結(jié)構(gòu)，由9個亞基組成寡聚體，每個亞基提供4條β鏈，組成36鏈β桶狀結(jié)構(gòu)。整個復(fù)合物在周質(zhì)側(cè)形成1個內(nèi)徑為35 ?、高度為40 ? 的空腔，由2號位α螺旋形成周質(zhì)開口，約50 ??？涨粌?nèi)襯為氨基酸殘基Tyr、Asn和Phe形成的3個同心環(huán)堆疊構(gòu)成。通過CsgG 及其同源物的多序列比對表明，Phe 或Asn 的改變可能會終止Curli 的合成。

2020年，Yan 等［40］運用冷凍電鏡解析了大腸桿菌CsgG-CsgF復(fù)合物結(jié)構(gòu)（圖8b），CsgF的N端結(jié)構(gòu)域與CsgG連接，C端結(jié)構(gòu)域通過與CsgB的特異性結(jié)合與Curli 相連接。在CsgF-CsgG 通道的周質(zhì)側(cè)，存在9個裂隙能夠捕獲CsgA的N端結(jié)構(gòu)域，從而為CsgA 提供特異性和高度保守的識別位點。該研究還證明，CagA可通過其C端殘基與CsgE相互作用，顯著增強轉(zhuǎn)運效率。同年，Zhang 等［144］也運用冷凍電鏡解析了大腸桿菌CsgG-CsgF復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，如前所述，在管腔內(nèi)部也存在由Tyr、Asn 和Phe 的側(cè)鏈形成的同心環(huán)（圖8c）。綜上研究表明，CsgG-CsgF 相互作用具備2個主要特征。首先，CsgF 的N 端結(jié)構(gòu)域與CsgG 結(jié)合，1個連接環(huán)延伸到CsgG 通道中心，形成插入CsgG 通道的漏斗狀結(jié)構(gòu)，從而與CsgG 形成穩(wěn)定復(fù)合物。其次，CsgF 可同時結(jié)合2個相鄰的CsgG，增強CsgG-CsgF 復(fù)合體通道的穩(wěn)定性，以完成Curli 亞基的分泌和聚合。

此外，Curli 主要亞基CsgA 和次要亞基CsgB位于細(xì)胞表面，均為β 片層結(jié)構(gòu)，CsgA 通過與細(xì)胞表面CsgB 相連核化成淀粉樣纖維［145］。CsgC 是一種天然的細(xì)菌淀粉樣蛋白抑制劑，被證明可通過靜電相互作用來抑制CsgA初級成核和/或延伸，保持其無定形、無鏈狀態(tài)，以防止其對宿主細(xì)胞的毒性［146-147］。然而，在Curli 生物合成過程中，CsgC、CsgE 的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)及其機制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

Fig.8 Illustration of the structural model of the localization of type VIII secretion system圖8 VIII型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

9 IX 型分泌系統(tǒng)（type IX secretion system，T9SS）

T9SS目前僅在擬桿菌門（Bacteroidetes）中被發(fā)現(xiàn)，用于分泌蛋白質(zhì)或?qū)崿F(xiàn)滑行運動。該系統(tǒng)根據(jù)細(xì)菌不同的生活方式發(fā)揮不同作用，可為環(huán)境細(xì)菌提供滑行運動，如經(jīng)常在水和土壤中發(fā)現(xiàn)的共生微生物—— 約式黃桿菌 （Flavobacterium johnsoniae）［148］；也可分泌細(xì)菌的黏附素和毒力因子等［149］，如人類牙周炎主要病原體——牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）［150］。T9SS 由1個雙組分系統(tǒng)調(diào)節(jié)，確切的觸發(fā)信號還未明確。T9SS 分泌蛋白通常具有保守的CTD，將其靶向到T9SS，滑行運動則是依賴運動性黏附素實現(xiàn)［149］。由于不同細(xì)菌T9SS 的結(jié)構(gòu)有所區(qū)別，因此，本文僅基于已獲取的三維結(jié)構(gòu)信息（圖9a），對部分T9SS結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行綜述。

2018年，Lauber等［41］運用冷凍電鏡對牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）T9SS外膜蛋白Sov（SprA）的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，為36 條鏈組成的β桶狀結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部孔直徑約為70?，允許折疊后的蛋白質(zhì)通過。SprA 孔的周質(zhì)側(cè)被Plug 蛋白堵塞，外膜側(cè)被PorV 交替堵塞，這可防止非特異性物質(zhì)的滲漏。在SprA-PorV復(fù)合體中，側(cè)壁開口完全被PorV 阻塞，并通過其外表面結(jié)合（圖9b左），允許從周質(zhì)接收底物進(jìn)入SprA通道，底物釋放后，Plug 再將SprA 通道的周質(zhì)口封閉（圖9b右）。

PorV、PorU、PorZ 和PorQ 能夠形成復(fù)合物，修飾分泌物并將其黏附到細(xì)胞表面［151］。除PorQ、PorU 外，其他蛋白質(zhì)均得到了一定程度的解析。PorV屬于FadL家族，為14條β折疊鏈組成的外膜孔蛋白，孔被N 端結(jié)構(gòu)域堵塞，在該系統(tǒng)中PorV可護(hù)送分泌蛋白通過SprA 通道運輸?shù)桨猓?51］。PorU 是一種肽酶，負(fù)責(zé)在底物分泌后，清除分泌蛋白的C 端信號域［152］，也可通過“sortaslike”機制將新暴露的分泌蛋白C 端共價連接到脂多糖A-LPS 上［153］，PorU 的精確定位和穩(wěn)定性依靠PorZ。PorZ 是T9SS 在膜表面的必要組成部分，2016年，Lasica 等［42］運用X 射線晶體學(xué)技術(shù)對牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）PorZ 進(jìn)行了解析，該結(jié)構(gòu)由3個亞基組成，前2個為N 端7股β螺旋槳βD1和βD2，每個β螺旋槳具有“入口側(cè)”和“出口側(cè)”。CTD 為七股反平行的β 折疊構(gòu)成的類免疫球蛋白狀結(jié)構(gòu)（圖9c），但該蛋白質(zhì)與分泌蛋白的結(jié)合方式尚未確定，有待進(jìn)一步探索。

Fig.9 Illustration of the structural model of the localization of type IX secretion system圖9 IX型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖

10 靶向細(xì)菌分泌系統(tǒng)的抗菌劑研發(fā)

全球范圍的抗生素濫用加劇了細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，對公眾健康構(gòu)成巨大威脅，因此開發(fā)可替代抗生素的新型抗菌劑極為迫切［154］。與抗生素相比，以細(xì)菌分泌系統(tǒng)重要毒力蛋白為靶點，篩選和設(shè)計的靶向小分子藥物，可有效抑制細(xì)菌基礎(chǔ)生命活動，降低細(xì)菌的毒力，且不易產(chǎn)生耐藥性。本章將討論以細(xì)菌分泌系統(tǒng)為靶標(biāo)開發(fā)新型抗菌藥物的最新進(jìn)展。

T3SS 可作為開發(fā)抗菌治療藥物重要靶點［155］，目前已經(jīng)展開廣泛研究。在T3SS表達(dá)及轉(zhuǎn)錄層面，發(fā)現(xiàn)了一系列靶向抗菌劑，如水楊醛酰酰肼、N-羥基苯并咪唑、苯氧基乙酰亞胺、2-亞氨基-5-芳基乙基唑烷酮等，可有效防止細(xì)菌注射效應(yīng)蛋白而引起宿主感染［156］。近年來，隨著T3SS 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的逐步解析，許多靶向T3SS 蛋白結(jié)構(gòu)的抗菌劑也得到進(jìn)一步開發(fā)。2011年，Swietnicki 等［157］以鼠疫桿菌（Yersinia pestis）T3SS SctN（YscN）為靶標(biāo)，篩選出6個可有效抑制該蛋白質(zhì)的化合物，顯著降低了鼠疫桿菌的毒力。2014年，美國制藥公司Kalobios 首次報道以銅綠假單胞菌T3SS尖端蛋白PcrV 為靶點，開發(fā)了抗體KB001-A 作為銅綠假單胞菌T3SS 抑制劑，用于治療由慢性銅綠假單胞菌感染引起的呼吸道炎癥和囊性纖維化（CF）的患者，這也是已知的第一種用于臨床治療的T3SS 抑制劑藥物［158］。2019年，F(xiàn)eng 等［159］基于熒光偏振的高通量篩選方法，發(fā)現(xiàn)了可有效抑制T3SS針復(fù)合物組裝的天然草藥化合物-丹參酮，并通過體內(nèi)外實驗驗證了該化合物可有效緩解銅綠假單胞菌引起的肺部感染。2020年，Case 等［160］利用志賀氏菌T3SS 的ATP 酶Spa47 晶體結(jié)構(gòu)，計算篩選760萬種藥物化合物，表征并鑒定了多種新型Spa47抑制劑，并且該研究表明，這種新型抑制劑可靶向大腸桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌T3SS的ATP酶，顯著降低這些致病菌的毒性。

此外，研究人員針對其他分泌系統(tǒng)也展開了新型抗菌劑的研究。2019年，Massal等［161］以銅綠假單胞菌雙精氨酸易位（Tat）系統(tǒng)和T2SS 為靶點，通過高通量篩選確定出3 種Tat 抑制劑和1 種T2SS抑制劑，為開發(fā)抗銅綠假單胞菌的新型抗菌劑奠定基 礎(chǔ)。2011年，Paschos 等［162］針 對 布 魯 氏 菌（Brucella abortis）T4SS VirB8 篩選出48 種特異性的小分子物質(zhì)，其中化合物B81-2 可有效影響VirB8 的二聚化，從而抑制布魯氏菌在巨噬細(xì)胞中的生長，并降低其對宿主細(xì)胞的毒性。2019年，Arya 等［163］以幽門螺旋桿菌T4SS CagA（VirB11）為靶點，篩選出可抑制該ATP 酶六聚化的抑制劑，可有效降低其酶活性，進(jìn)而降低該菌毒力。2021年，Cherrak［164］等靶向大腸桿菌T6SS 基板復(fù)合物TssK-TssF-TssG，設(shè)計了一種可阻斷基板復(fù)合物組裝的仿生環(huán)肽（BCP），該肽是第一個完全根據(jù)先前的結(jié)構(gòu)信息設(shè)計的具有抗T6SS 活性的化合物，為抗T6SS 抑制劑的開發(fā)提供思路。綜上，針對細(xì)菌分泌系統(tǒng)重要毒力蛋白，已開發(fā)的新型抗菌劑驗證了該思路的有效性及可靠性，為后續(xù)靶向抗菌劑的開發(fā)奠定良好基礎(chǔ)。

11 展 望

近年來，作為一大類與致病力、生存力等密切相關(guān)的大分子復(fù)合物，細(xì)菌分泌系統(tǒng)得到了廣泛研究，明晰了大部分細(xì)菌分泌系統(tǒng)的主要組成，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展也為揭示各種分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及其部分亞基結(jié)構(gòu)的解析提供了良好基礎(chǔ)。細(xì)菌分泌系統(tǒng)最少的由3個亞基單位構(gòu)成，復(fù)雜的T3SS 及T9SS則多達(dá)20～30個亞基單位，這些復(fù)雜的大分子復(fù)合物為細(xì)菌的分泌蛋白、DNA 及小分子物質(zhì)等提供了通道。因此，對細(xì)菌分泌系統(tǒng)的深入探究，有助于進(jìn)一步理解細(xì)菌的致病、耐藥、環(huán)境適應(yīng)等機制。但由于細(xì)菌分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對其結(jié)構(gòu)的解析還較為局限，例如T7SS、T9SS這些分泌系統(tǒng)的具體結(jié)構(gòu)仍處于未知，此外對于一些已經(jīng)得到解析的分泌系統(tǒng)，其底物的具體轉(zhuǎn)運過程也屬于研究空白，限制了人類對這些系統(tǒng)轉(zhuǎn)運機制的深入了解。因此，本文針對細(xì)菌分泌系統(tǒng)的未來研究提出以下3點展望。

11.1 進(jìn)一步探索細(xì)菌分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運機制

電鏡技術(shù)的發(fā)展及蛋白質(zhì)相關(guān)生化數(shù)據(jù)的積累，推動了細(xì)菌分泌系統(tǒng)具體結(jié)構(gòu)的闡明，使多種細(xì)菌分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及組成得到了較好的解析。但目前，由于蛋白質(zhì)復(fù)合物難以表達(dá)、不夠穩(wěn)定、產(chǎn)量較低等一系列問題，導(dǎo)致一些分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的解析十分困難。此外，傳統(tǒng)X射線晶體學(xué)技術(shù)雖被視為結(jié)構(gòu)解析的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但具有結(jié)晶困難、周期較長、晶體不穩(wěn)定等缺陷。隨著單顆粒冷凍電鏡（single particle cryo-EM） 和冷凍電鏡斷層成像（cryo-electron tomography，cryo-ET）等技術(shù)的迅猛發(fā)展，可為分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)運機制研究提供絕佳的科研手段。此外，目前主要解析了革蘭氏陰性細(xì)菌的眾多細(xì)菌分泌系統(tǒng)，VⅠⅠ型分泌系統(tǒng)等革蘭氏陽性細(xì)菌的分泌系統(tǒng)尚未得到徹底研究，限制了針對革蘭氏陽性細(xì)菌分泌系統(tǒng)的新型抑菌劑開發(fā)。因此，明晰這些未知結(jié)構(gòu)的組成及功能，以及這些結(jié)構(gòu)在效應(yīng)物轉(zhuǎn)運過程中的變化及互作位點，以期全面認(rèn)識細(xì)菌分泌系統(tǒng)。

11.2 不同細(xì)菌分泌系統(tǒng)相互作用機制的進(jìn)一步探索

分泌系統(tǒng)在細(xì)菌發(fā)揮致病性過程中起到重要作用，同一細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在多種不同類型的分泌系統(tǒng)，例如，本課題組前期研究表明，副溶血性弧菌同時存在T3SS和T6SS，并在該菌致病過程中發(fā)揮中重要作用，且二者均受到AphA、ToxR、OpaR 的調(diào)控［11］。銅綠假單胞菌也存在T3SS 和T6SS，二者分別通過c-di-GMP 和RetS/GacS 途徑來協(xié)同調(diào)控病原菌的生存方式及其感染策略［165］。因此，應(yīng)充分探索不同細(xì)菌分泌系統(tǒng)間的相互作用，以明晰其在發(fā)揮致病過程中潛在的協(xié)同互作機制。

11.3 靶向細(xì)菌分泌系統(tǒng)的抗菌劑研發(fā)

基于細(xì)菌分泌系統(tǒng)進(jìn)行新型抗菌劑的研發(fā)，為取代或幫助傳統(tǒng)抗生素療法開辟了新的治療途徑。近年來，細(xì)菌分泌系統(tǒng)高分辨率結(jié)構(gòu)的解析，為靶向抑菌小分子的高通量篩選及抗菌肽設(shè)計提供了重要基礎(chǔ)。但目前針對細(xì)菌分泌系統(tǒng)的新型抗菌劑研發(fā)尚未得到全面探究，僅局限于一些細(xì)菌分泌系統(tǒng)的部分毒力蛋白，并且這些新型抑菌劑從實驗室開發(fā)到臨床應(yīng)用還存在一定距離。因此，未來研究可進(jìn)一步開拓細(xì)菌分泌系統(tǒng)的毒力蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)，并將其作為潛在的藥物靶點，進(jìn)行靶向抑菌劑的篩選和研發(fā)，為有效解決抗生素耐藥性問題提供新的策略。