金蓮清熱顆粒中牡荊苷含量測(cè)定及其對(duì)冠狀病毒蛋白酶活性的影響

黎 燕，孫志剛，陳利紅，周 紅

（1.上海理工大學(xué)，上海 200093；2.寧夏啟元國藥有限公司，銀川 750011）

金蓮清熱顆粒為《中國藥典》（2020年版一部）收載品種[1]，由金蓮花、大青葉、石膏、知母、地黃、玄參、苦杏仁（炒）七味中藥組成，其中金蓮花是該產(chǎn)品的君藥之一，主要有效成分為黃酮類和生物堿類物質(zhì)[2-3]。其中牡荊苷為主要的黃酮類物質(zhì)，是金蓮清熱顆粒的有效成分之一[4-5]?！吨袊幍洹穼⒛登G苷含量作為金蓮清熱顆粒的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定1 g金蓮清熱顆粒中牡荊苷（C21H20O10）含量不得少于0.32 mg[1]。本研究按照《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)方法，檢測(cè)金蓮清熱顆粒中牡荊苷的含量，并在此基礎(chǔ)上，通過體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)，探索金蓮清熱顆粒抑制冠狀病毒蛋白酶活性效果。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

主要儀器：酶標(biāo)儀（型號(hào)：SpectraMax M2e，Molecular Devices公司）；LC-15C高效液相色譜儀（島津公司）；KQ5200B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；METTLER TOLEDO ME55電子天平（METTLER TOLEDO公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（上海皓昕機(jī)電設(shè)備有限公司）。主要試劑：Tris base（Sigma7-9）、EDTA、NaCl、TCEP、BSA等。乙腈、乙酸銨為色譜純，正丁醇、乙酸乙酯、甲醇、氯仿均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 受試樣品和對(duì)照化合物1）受試樣品金蓮清熱顆粒：由寧夏啟元國藥有限公司提供（樣品編號(hào)：USST-LY-Y2020-1），牡荊苷的含量測(cè)定選取3個(gè)批次樣品（200420-1、200420-2、200420-3）。體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品批號(hào)：200420-1。配制方法：受試樣品在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天使用無菌水溶解到800 mg·mL-1，經(jīng)100℃水浴加熱10 min，冷卻至室溫后取上清液用于測(cè)試。2）對(duì)照化合物：3CLpro抑制劑（GC376），來源：TargetMol（批號(hào)：T5188-1），貯存條件：-80℃。配制方法：對(duì)照化合物用100%二甲基亞砜（DMSO）配制成100 mmol·L-1的母液，分裝后冷凍保存于-80℃。

1.2.2 主要蛋白酶（main protease，Mpro） 蛋白Mpro（NC_045512）蛋白酶蛋白（批次號(hào)：RP200 225A）由上海藥明康德新藥開發(fā)有限公司克隆表達(dá)。冷凍保存在-80℃中。

1.2.3 Mpro底物Mpro底物（KTSAVLQSGFRKM）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。批次號(hào)為C398JFC160-1/PE9237。

1.2.4 牡荊苷（Vitexin） 供含量測(cè)定用，含量以94.9%計(jì)，純度＞98%。由中國食品藥品檢定研究院提供。批號(hào)：111687-201704。

1.3 牡荊苷含量測(cè)定

1.3.1 測(cè)定依據(jù)及計(jì)算公式 依據(jù)高效液相色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則）測(cè)定；色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動(dòng)相為乙腈-0.4%乙酸銨溶液（15∶85）；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm；流速為1.0 mL·min-1。系統(tǒng)適用性條件：理論板數(shù)（n）按牡荊苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。計(jì)算公式：

其中A樣為樣品牡荊苷峰的平均峰面積；A標(biāo)為對(duì)照品峰的平均峰面積；W標(biāo)為對(duì)照品的稱樣量；W樣為樣品的稱樣量。

1.3.2 受試樣品溶液的制備方法 取適量受試樣品置乳缽中研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，用50 mL移液管精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲（功率250 W，頻率33 kHz）處理1 h，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，用25 mL移液管精密量取續(xù)濾液25 mL至蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴上蒸干，殘?jiān)?0 mL量筒加水20 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇振搖提取4次（30 mL、30 mL、30 mL、20 mL），合并正丁醇液至蒸發(fā)皿內(nèi)，水浴上蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3 牡荊苷對(duì)照品溶液的制備 取牡荊苷對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用5 mL移液管精密吸取5 mL至50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含20 μg的溶液，即得。

1.4 體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)

本研究應(yīng)用體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)探索研究金蓮清熱顆粒抑制冠狀病毒主要蛋白酶蛋白（SARSCoV-2 Mpro）活性，以GC376為對(duì)照化合物，監(jiān)控實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。1）先將梯度稀釋后的受試樣品和對(duì)照化合物（10個(gè)濃度，三復(fù)孔）加入384孔測(cè)試板，每孔加入3 μL。HPE孔中含有終濃度為1 μmol·L-1的對(duì)照化合物GC376，ZPE孔中加入DMSO液。各化合物測(cè)試終濃度見表1。同時(shí)檢測(cè)化合物自身對(duì)熒光信號(hào)的干擾本底。2）在化合物孔板中的第13～24列加入每孔22 μL的34 nmol·L-1的Mpro蛋白溶液，第1～12列加入22 μL工作濃度的緩沖液。SARS-CoV-2 Mpro蛋白的終濃度為25 nmol·L-1。3）受試樣品和對(duì)照化合物與酶孵育30 min后，在化合物孔板中每孔加入5 μL濃度為150 μmol·L-1的底物反應(yīng)體系，總體積為30 μL，底物終濃度為25 μmol·L-1。4）離心后將測(cè)試板放入30℃培養(yǎng)箱中孵育60 min后，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔熒光強(qiáng)度。檢測(cè)條件為：Ex/Em=340 nm/490 nm。應(yīng)用如下公式計(jì)算化合物抑制率：抑制率（%）=［（CPD-BGCPD）-（ZPEBGZEP）/（HPE-BGHPE）-（ZPE-BGZPE）］×100%，其中CPD為化合物孔的信號(hào)值；HPE（hundred percent effect）：100%有效作用對(duì)照孔信號(hào)平均值，孔中含有1 μmol·L-1的GC376，Mpro蛋白和底物；ZPE（zero percent effect）：無效作用對(duì)照孔信號(hào)平均值，孔中含有Mpro蛋白和底物。BG（back ground）：化合物自身熒光值。

表1 樣品測(cè)試濃度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism（version 6）軟件對(duì)化合物的抑制率（%）數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合分析，得到化合物的IC50值（50% inhibitory concentration，即半數(shù)抑制濃度）。曲線擬合方法為log（inhibition）vs.response-Variable slope。

2 結(jié)果

2.1 金蓮清熱顆粒中牡荊苷含量

三批金蓮清熱顆粒的牡荊苷含量測(cè)定結(jié)果見表2、圖1~圖6；根據(jù)本產(chǎn)品的處方折算，三批產(chǎn)品金蓮花中牡荊苷平均轉(zhuǎn)移率為63.55%，平均含量值為0.42 mg·g-1。

圖1 牡荊苷對(duì)照品HPLC圖譜（200420-1）

圖6 金蓮清熱顆粒HPLC圖譜（200420-3）

表2 金蓮清熱顆粒中牡荊苷含量

圖2 金蓮清熱顆粒HPLC圖譜（200420-1）

圖3 牡荊苷對(duì)照品HPLC圖譜（200420-2）

圖4 金蓮清熱顆粒HPLC圖譜（200420-2）

圖5 牡荊苷對(duì)照品HPLC圖譜（200420-3）

2.2 金蓮清熱顆粒抑制SARS-CoV-2 Mpro活性

受試樣品金蓮清熱顆粒和對(duì)照化合物GC376對(duì)SARS-CoV-2 Mpro活性測(cè)試的抑制率見表3、表4。金蓮清熱顆粒在5～80 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)，抑制率平均值分別為86.63%、94.20%、99.83%、100.87%、101.63%；對(duì)照化合物GC376在0.123～10 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，抑制率平均值分別為60.40%、97.67%、96.40%、102.57%、102.93%。根據(jù)抑制率數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合分析。結(jié)果顯示對(duì)照化合物GC376對(duì)SARS-CoV-2 Mpro的IC50值為0.040 μmol·L-1，且劑量效應(yīng)曲線擬合良好。受試樣品金蓮清熱顆粒對(duì)SARS-CoV-2 Mpro活性抑制的IC50值為1.977 mg·mL-1。用log（inhibition）vs.response-Variable slope方法進(jìn)行曲線擬合，見圖7。

圖7 金蓮清熱顆粒和對(duì)照化合物對(duì)SARS-CoV-2 Mpro的抑制活性劑量效應(yīng)擬合曲線

表3 金蓮清熱顆粒對(duì)SARS-CoV-2 Mpro活性的抑制率（%）

表4 對(duì)照化合物對(duì)SARS-CoV-2 Mpro活性抑制率（%）

3 討論

金蓮清熱顆粒有解熱鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、止咳平喘、抑制細(xì)菌、抑制病毒、抑制炎癥等作用。目前，金蓮清熱顆粒已被用于甲型流感、呼吸道合胞病毒等所致的病毒性肺炎的臨床治療。

牡荊苷是金蓮花中主要的黃酮類物質(zhì)，具有清熱消炎等作用，其含量是否達(dá)到《中國藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)是評(píng)價(jià)金蓮清熱顆粒質(zhì)量的主要指標(biāo)[6-7]。本研究按照《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定金蓮清熱顆粒中牡荊苷的含量，結(jié)果顯示：三批產(chǎn)品金蓮花中牡荊苷平均轉(zhuǎn)移率為63.55%，平均含量值為0.42 mg·g-1。據(jù)此可見金蓮清熱顆粒中牡荊苷含量達(dá)到《中國藥典》的質(zhì)量要求。Mpro是冠狀病毒的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制酶復(fù)合體成熟過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，是冠狀病毒感染防治藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。GC376是一種廣譜性3C類蛋白酶抑制劑，能抑制多種病毒復(fù)制。有研究[8-11]顯示，GC376與瑞德西韋組合使用，可產(chǎn)生累加的病毒抑制作用，結(jié)構(gòu)分析表明，兩種抑制劑與SARS-CoV-2蛋白酶Mpro的催化活性側(cè)結(jié)合是抑制的主要機(jī)制。本研究應(yīng)用體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)，以化合物GC376體外抑制SARS-CoV-2 Mpro活性的抑制率作為參照對(duì)象，根據(jù)抑制率數(shù)據(jù)，用log（inhibition）vs.response--Variable slope方法進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果顯示金蓮清熱顆粒抑制SARS-CoV-2 Mpro蛋白酶活性的IC50值為1.977 mg·mL-1。

綜上所述，金蓮清熱顆粒中牡荊苷含量達(dá)到《中國藥典》的質(zhì)量要求，對(duì)冠狀病毒SARS-CoV-2 Mpro活性有一定的抑制作用，為更深入研究金蓮清熱顆粒的抑制冠狀病毒活性的有效成分與結(jié)構(gòu)特征等提供了線索。