長(zhǎng)鏈非編碼RNA NRSN2-AS1通過miR-129-5p/Wnt5a軸靶向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展的影響

徐同欣，顏朝陽，路軍濤，李曉旭，董稚明，郭 煒

食管癌是全球病死率較高的惡性腫瘤，根據(jù)病理類型可分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma， ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma， EAC)[1]。ESCC是我國(guó)食管癌的主要類型，約占食管癌的90%以上[2]。雖然ESCC的多學(xué)科治療取得了一定進(jìn)展，但與其他惡性腫瘤相比，ESCC患者的預(yù)后仍較差，5年總生存率不足30%[3-5]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長(zhǎng)度介于200～100 000 nt的無編碼能力RNA。研究表明，lncRNA在ESCC等多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6-8]。lncRNA NRSN2-AS1最早在卵巢癌中發(fā)現(xiàn)，可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合微小RNA(microRNA， miRNA)促進(jìn)卵巢癌的進(jìn)展，但其在ESCC中的作用和機(jī)制尚未完全闡明[9]。本文通過檢測(cè)NRSN2-AS1在ESCC組織及細(xì)胞中的表達(dá)，探討NRSN2-AS1過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，旨在為ESCC的靶向治療提供潛的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年1月～2015年12月我院存檔的96例ESCC手術(shù)切除標(biāo)本，其中男性患者55例，女性患者41例?；颊咝g(shù)前均未接受任何放、化療，每例患者組織標(biāo)本包括ESCC組織和癌旁正常組織(距原發(fā)灶邊緣3～5 cm)。組織標(biāo)本均經(jīng)兩位病理醫(yī)師證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞及主要試劑人類ESCC細(xì)胞系Eca109、TE1、TE13和KYSE150，由我院腫瘤研究所病理研究室保留并傳代。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MTS試劑盒和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Promega公司；SYBR PCR Master Mix試劑，購(gòu)自北京索萊寶公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；TOP-FLASH和FOP-FLASH質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Millipore Corporation公司。本實(shí)驗(yàn)引物、NRSN2-AS1過表達(dá)質(zhì)粒和miR-129-5p mimic，均購(gòu)自于上海生工公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染細(xì)胞系Eca109、TE1、TE13和KYSE150，均常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)條件為恒溫37 ℃，CO2體積濃度為5%。將狀態(tài)良好且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109細(xì)胞接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合70%～80%時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別或同時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(pcDNA3.1-negative control，pcDNA3.1-NC)、pcDNA3.1-NRSN2-AS1或陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-129-5p mimic。

1.4 qRT-PCR法使用TRIzol試劑提取組織或細(xì)胞總RNA，RNA提取后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA樣品260/280 nm吸光度值，其數(shù)值位于1.8～2.0的樣品為合格。RNA完整性的檢測(cè)通過RNA瓊脂糖電泳進(jìn)行測(cè)定，電泳結(jié)果：28、18、5 S，且28 S條帶亮度約為18 S條帶2倍則認(rèn)定提取的RNA樣品合格。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于檢測(cè)NRSN2-AS1、miR-129-5p及Wnt5a mRNA的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照。qRT-PCR運(yùn)行參數(shù)：95 ℃ 50 s、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃30 s，合計(jì)35個(gè)循環(huán)。基因的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法計(jì)算，所用引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.5 MTS實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染24 h后的Eca109細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)副孔。待細(xì)胞貼壁后分別于0、24、48、72、96 h，每孔加入20 μL的MTS試劑(500 μg/mL)。震蕩混勻后，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中孵育2 h，隨后將96孔板置于多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定490 nm處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)開始前在6孔板背面均勻繪制水平橫線，將轉(zhuǎn)染24 h后的Eca109細(xì)胞重新接種于6孔板中，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，每孔加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基至2 mL。待細(xì)胞長(zhǎng)至完全融合時(shí)，用200 μL移液槍頭垂直于橫線輕輕劃痕；分別于劃痕后0、24 h在倒置顯微鏡下(100×)觀察細(xì)胞，計(jì)算劃痕愈合率；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)將50 μL稀釋好的Matrigel基質(zhì)膠，均勻涂于Transwell小室的上室表面，37 ℃孵育過夜。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h，向小室的上室內(nèi)加入1×105個(gè)細(xì)胞，再加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，總量為200 μL；下室內(nèi)加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基600 μL。常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS沖洗3次，使用棉簽輕柔地擦去上室內(nèi)未能穿透膜的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色、固定在倒置顯微鏡下觀察，并計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)采用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)NRSN2-AS1序列中可與miR-129-5p相結(jié)合的片段，并將該片段插入至雙熒光素酶報(bào)告基因載體pmir GLO中，構(gòu)建NRSN2-AS1野生型和突變型質(zhì)粒。將NRSN2-AS1野生型和突變型質(zhì)粒，分別與miR-129-5p-mimic共轉(zhuǎn)染至Eca109細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)48 h，使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒測(cè)定各組的相對(duì)熒光強(qiáng)度；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

為測(cè)定Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活情況，將TOP-FLASH、FOP-FLASH、空白對(duì)照質(zhì)粒，分別與pcDNA3.1-NRSN2-AS1質(zhì)粒、miR-129-5p-mimic共轉(zhuǎn)染至Eca109細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)48 h，使用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒測(cè)定TOP/FOP比值；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 ESCC中NRSN2-AS1的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，NRSN2-AS1在ESCC組織(2.48±0.90)中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(1.02±0.73，t=4.480，P<0.01，圖1)。

圖1 ESCC組織及癌旁組織中NRSN2-AS1的表達(dá)

2.2 ESCC細(xì)胞系中NRSN2-AS1的表達(dá)隨機(jī)選取10例ESCC癌旁組織的cDNA，混合后作為對(duì)照組(Pool)。qRT-PCR檢測(cè)顯示：NRSN2-AS1在ESCC細(xì)胞系Eca109(1.99±0.04)、TE1(2.43±0.09)、TE13(3.68±0.21)和KYSE150(4.44±0.26)中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(1.00±0.08)(P均<0.01，圖2)。由于NRSN2-AS1在Eca109細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)較低，故選擇其用于后續(xù)過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

圖2 ESCC細(xì)胞系中NRSN2-AS1的表達(dá)

2.3 NRSN2-AS1過表達(dá)的效率本實(shí)驗(yàn)在Eca109細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NRSN2-AS1，采用qRT-PCR法檢測(cè)過表達(dá)效率。與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NC組中NRSN2-AS1(1.01±0.13)相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中NRSN2-AS1(44.98±3.30)的表達(dá)水平顯著提高(t=18.826，P<0.01)。

2.4 NRSN2-AS1過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響MTS結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-NC組相比，pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中NRSN2-AS1過表達(dá)可促進(jìn)Eca109細(xì)胞的增殖能力(P<0.01，圖3)。

圖3 MTS檢測(cè)NRSN2-AS1過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞增殖的影響

2.5 NRSN2-AS1過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞遷移及侵襲的影響劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NRSN2-AS1組Eca109細(xì)胞的劃痕愈合率(69.03%±4.11%)顯著高于pcDNA3.1-NC(82.12%±3.08%)(t=12.651，P<0.01，圖4A)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-NRSN2-AS1組Eca109細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)(618.52±7.78)顯著高于pcDNA3.1-NC(467.51±3.54)(t=22.667，P<0.01，圖4B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRSN2-AS1可顯著提高Eca109細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖4 Eca109細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測(cè)：A.劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NRSN2-AS1過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞遷移能力的影響；B.Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NRSN2-AS1過表達(dá)對(duì)Eca109細(xì)胞侵襲能力的影響：1.pcDNA3.1-NC組;2.pcDNA3.1-NRSN2-AS1組

2.6 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NRSN2-AS1的靶基因及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證使用RNA22數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)， NRSN2-AS1的3’UTR區(qū)存在miR-129-5p的結(jié)合位點(diǎn)，并將3’UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變(圖5)。qRT-PCR結(jié)果顯示，pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中miR-129-5p的表達(dá)量分別為1.02±0.03和0.62±0.06，NRSN2-AS1過表達(dá)可顯著下調(diào)miR-129-5p的表達(dá)(t=9.812，P<0.01，圖6A)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，miR-129-5p-mimic可顯著降低NRSN2-AS1野生質(zhì)粒的熒光活性(t=23.273，P<0.01，圖6B)，但對(duì)NRSN2-AS1突變質(zhì)粒的熒光活性無明顯影響(P>0.05)；提示NRSN2-AS1可靶向調(diào)控miR-129-5p的表達(dá)。

圖5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NRSN2-AS1的靶基因

圖6 NRSN2-AS1的靶基因：A.qRT-PCR檢測(cè)Eca109細(xì)胞中NRSN2-AS1過表達(dá)對(duì)miR-129-5p表達(dá)的影響；B.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證NRSN2-AS1與miR-129-5p的靶向調(diào)控關(guān)系

2.7 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NRSN2-AS1/miR-129-5p軸下游機(jī)制及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證采用StarbaseⅤ3.0數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-129-5p的下游靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示：Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是miR-129-5p的下游作用靶點(diǎn)(圖7)。TOP/FOP雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-129-5p-mimic轉(zhuǎn)染后可降低TOP/FOP熒光素酶活性(t=16.053，P<0.01，圖8A)，而NRSN2-AS1過表達(dá)可顯著增強(qiáng)TOP/FOP熒光素酶活性(t=10.473，P<0.01，圖8B)。TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果表明，miR-129-5p與Wnt5a的3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(圖9)。qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-NC組和miR-129-5p-mimic組中Wnt5a的表達(dá)量分別為1.01±0.04和0.66±0.02，miR-129-5p過表達(dá)可降低Wnt5a的表達(dá)水平(t=10.291，P<0.01，圖10A)；而pcDNA3.1-NC組和pcDNA3.1-NRSN2-AS1組中Wnt5a表達(dá)量分別為1.00±0.05和1.48±0.06，NRSN2-AS1過表達(dá)可上調(diào)Wnt5a的表達(dá)水平(t=7.882，P<0.01，圖10B)。結(jié)果表明：NRSN2-AS1可通過靶向調(diào)控miR-129-5p/Wnt5a軸激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。

圖7 miR-129-5p的下游靶基因的KEGG富集分析

圖8 miR-129-5p過表達(dá)(A)和NRSN2-AS1過表達(dá)(B)對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

圖9 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-129-5p的靶基因

圖10 miR-129-5p過表達(dá)(A)和NRSN2-AS1過表達(dá)(B)對(duì)Wnt5a表達(dá)的影響

3 討論

ESCC屬于侵襲性和病死率均較高的惡性腫瘤，由于其早期癥狀不明顯，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期[10]。因此，探索ESCC的發(fā)病機(jī)制并尋找新的潛在治療靶點(diǎn)，有助于提高ESCC患者的生存率。近年隨著對(duì)lncRNA的相關(guān)研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)其異常表達(dá)與惡性腫瘤的形成及進(jìn)展密切相關(guān)[11]。例如lncRNA MALAT1在肺癌、胰腺癌、直腸癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[12-13]。lncRNA NRSN2-AS1作為新近發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，位于人類染色體20p13。目前，NRSN2-AS1在ESCC中的表達(dá)及相關(guān)分子機(jī)制尚未見報(bào)道。

本組發(fā)現(xiàn)NRSN2-AS1在ESCC組織和細(xì)胞系中均呈高表達(dá)，為進(jìn)一步了解NRSN2-AS1在ESCC中的生物學(xué)作用，本組構(gòu)建了NRSN2-AS1過表達(dá)的ESCC細(xì)胞。體外功能實(shí)驗(yàn)表明，NRSN2-AS1可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。以上結(jié)果提示，NRSN2-AS1可能在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮促癌基因的作用。

在作用機(jī)制上，lncRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA與相應(yīng)miRNA結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用[14-15]。本實(shí)驗(yàn)證明，NRSN2-AS1可靶向調(diào)控miR-129-5p的表達(dá)。大量研究結(jié)果表明，miR-129-5p在多種腫瘤中呈低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用。在ESCC中miR-129-5p可通過下調(diào)Cyclin D1的表達(dá)抑制腫瘤進(jìn)展[16-18]。本組通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了Wnt5a是miR-129-5p的下游靶基因。Wnt5a是Wnt蛋白家族的成員，Wnt5a的表達(dá)上調(diào)可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。本組應(yīng)用TOP/FOP雙熒光素酶報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)，NRSN2-AS1通過靶向調(diào)控miR-129-5p/Wnt5a軸激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。本組結(jié)果與NRSN2-AS1在卵巢癌中的作用機(jī)制一致[9]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在人類多種惡性腫瘤中被激活，在腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲、抗凋亡及化療耐藥等方面的調(diào)控發(fā)揮重要作用[19-20]。在ESCC中Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后可刺激β-catenin的核移位，促進(jìn)下游靶基因Cyclin D1和C-myc的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展[21]。

綜上所述，NRSN2-AS1在ESCC組織及細(xì)胞中呈高表達(dá)，NRSN2-AS1可通過靶向調(diào)控miR-129-5p激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，提示NRSN2-AS1在ESCC的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，有望成為潛在的治療靶點(diǎn)。