超高壓輔助超聲波法提取紫玉米籽?；ㄉ盏墓に囇芯?/h1>
2022-12-21 10:44:48鄧微，馮穎
沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2022年5期
鄧 微，馮 穎
（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽 110161）
花色苷是一種水溶性的具有強抗氧化活性的黃酮類植物色素，能夠抗癌抗腫瘤、控制血糖[1]，強化人體免疫系統(tǒng)及抗炎的作用[2-3]。紫玉米（Zea maysL.)是一種原產(chǎn)于秘魯?shù)淖魑?，在世界上一些國家也廣泛種植[4]。紫玉米對生長條件要求不苛刻，不僅產(chǎn)量高，而且耐貯存[5]，是一種便宜且富含高質(zhì)量高含量花色苷的原材料。紫玉米中的花色苷含量非常高且花色苷單體種類也豐富，中國的紫玉米籽粒中，花色苷總量為42~354mg·100g-1[6]。
超聲波提取法是目前比較常用的花色苷提取方法[7]，提取效率高，時間短，對有效成分的結(jié)構(gòu)破壞小[8]。張鐘等[9]用超聲輔助法提取黑糯玉米穗軸的色素，不僅很大程度地縮短了提取時間，而且提取率高達18.66%。劉長龍[10]采用超聲法提取黑玉米花色苷得到提取率為2.93mg·g-1。孫夢洋等[11]在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法得到黑糯玉米芯中花色苷含量為57.29mg·g-1。
超高壓是指壓力在100～1000MPa的液體靜壓力，超高壓輔助提取技術(shù)是利用水或其他流體為媒介。在超高壓的作用下，富含活性物質(zhì)的植物原料發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，其細胞壁被破壞，從而原料內(nèi)的活性物質(zhì)能夠釋放，并且與提取溶劑充分接觸反應(yīng)，提取率得到明顯的提升[12]。目前，已有應(yīng)用于多酚[13]、多糖[14]等物質(zhì)提取的研究報道。李鵬等[15]應(yīng)用超高壓提取桑葚花色苷得到含量為(1.97±0.02)mg·g-1。許志新[16]應(yīng)用超高壓提取紫玉米穗軸花色苷，得到含量為(743.158±11.304)mg·100g-1。目前，將超高壓與超聲波兩種提取技術(shù)相結(jié)合用于提取的工藝鮮有報道，本研究將二者聯(lián)合來對紫玉米籽?；ㄉ者M行提取，旨在進一步提高花色苷提取率，節(jié)約提取時間，以期為紫玉米花色苷產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
紫玉米籽粒（烘干后磨成粉過60目篩備用）、無水乙醇、檸檬酸、（AR,上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、DPPH、ABTS試劑盒（上海源葉生物技術(shù)有限公司）、透明光面真空袋（福創(chuàng)辰品牌食品級全新PET+PE復(fù)合材質(zhì)）。
1.2 主要儀器與設(shè)備
JGY-2500B打粉機（廣州大祥電子機械設(shè)備有限公司）、KQ5200B超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）、全自動超高壓殺菌機（德陽四創(chuàng)科技有限公司）、TU-1810紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、ELX-800酶標儀（美國BIOTEK公司）。
1.3 試驗方法
1.3.1 紫玉米花色苷提取步驟稱取研磨過篩的紫玉米籽粒粉2.0g于真空袋中，按照1:16的料液比向其加入乙醇和檸檬酸提取溶劑，使料液充分混合均勻后封口，進行超高壓預(yù)提取。
預(yù)處理結(jié)束后，將樣品置于超聲波中超聲提取，超聲功率為200W，超聲結(jié)束后離心收集上清液，即為花色苷提取液。
1.3.2 提取紫玉米籽粒花色苷單因素試驗（1）超高壓壓力。選取超高壓力為50，150，250，350，450MPa，保壓時間為2min，超聲波處理時間為5min，以總花色苷含量為評價指標。（2）超高壓時間。選取超高壓時間為1，2，3，4，5min，超高壓力為250MPa，超聲波處理時間為5min，以總花色苷含量為評價指標。（3）超聲時間。選取超高壓時間為2min，超高壓壓力為250MPa，超聲時間為4，6，8，10，12，14，16min，以總花色苷含量為評價指標。
1.3.3 紫玉米籽?；ㄉ盏暮繙y定采用pH示差法[17-18]測定花色苷含量：提取完成后無損轉(zhuǎn)移到離心管，離心條件為4℃、8000r·min-1離心20min，離心結(jié)束后將收集好的上清液加入提取溶劑定容至50mL，再吸取定容后的樣液0.5mL和鹽酸-氯化鉀緩沖液（pH=1）與鹽酸-乙酸鈉緩沖液（pH=4.5）4.5mL分別于試管內(nèi)，每組3個平行，在40℃的水浴鍋中反應(yīng)0.5h，接著將其無損轉(zhuǎn)移進行二次離心，條件為4℃、8000r·min-1離心10min，收取上清液分別測定吸光度OD520、OD700，計算花色苷收率，具體公式為[19]：
式中:A=(A510－A700)pH1.0－(A510－A700)pH4.5；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(449.2g·mol-1)；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積(mL)；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(26900L·mol·cm-1)；m為稱取的紫玉米籽粒粉質(zhì)量(g)；L為比色皿的光距長度(1cm)。
1.4 響應(yīng)面優(yōu)化超高壓輔助超聲提取花色苷
通過單因素試驗確定對超聲波提取紫玉米籽粒花色苷影響最大的3個因素為超高壓壓力、超高壓時間和超聲時間。每個因素設(shè)3個水平，以花色苷含量為響應(yīng)值，值越大，提取效果越好，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計分析，確定各因素配比。試驗因素與水平設(shè)計見表1[20-21]。
表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment
1.5 生物活性測定
1.5.1 DPPH自由基清除活性測定根據(jù)CHEN等[22]的方法稍加改動。取0.2mL經(jīng)過稀釋處理過的樣品溶液于96孔板中，再向其加入0.2mL DPPH-乙醇工作液（乙醇配制），使其振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)30min后，測定其在波長為517nm處吸光度值記A1，取0.2mL同等條件稀釋的樣液與0.2mL無水乙醇混合均勻于96孔板中，相同波長測吸光度值記A2，平行測定3次取平均值，結(jié)果以DPPH自由基清除率來表示。
式中：A0為以蒸餾水替代樣品的吸光值；A1為樣品吸光值；A2為以乙醇替代工作液的吸光值。
1.5.2 ABTS自由基清除能力測定根據(jù)黃彪等[23]方法稍作修改。制備的ABTS工作液用80%無水乙醇稀釋，調(diào)節(jié)其吸光值在734nm波長下為0.7±0.05，同時在405nm波長下為1.4。取10μL紫玉米花色苷樣液與200μL ABTS工作液共同加入到96孔板中，避光孵育6min，在734nm下測定吸光值，記為A1。再取10μL紫玉米花色苷樣液提取液與200μL ABTS工作液共同加入到96孔板中，反應(yīng)條件相同測定吸光值，記為A0。再以等體積80%無水乙醇代替ABTS工作液，其他反應(yīng)條件不改變測吸光值，記為A2。重復(fù)3次平行試驗取平均值。
式中：A0為以紫玉米花色苷提取液替代樣品的吸光值；A1為樣品吸光值；A2為以80%乙醇替代工作液的吸光值。
1.6 超聲波提取和結(jié)合提取紫玉米籽?；ㄉ战M成分析
使用HPLC-MS法鑒定和測定紫玉米籽?；ㄉ战M成。采集軟件：Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition(versions B.06.00)。處理軟件：Agilent MassHunter Qualitative Analysis(versions B.06.00)。
1.6.1 液相條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 column(4.6×100mm,1.8μm)；進樣量：5uL；柱溫：30℃；流速：0.5mL·min-1；流動相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈；梯度洗脫A：95%~0%(0~35min)，A：0%(35~40min)。
1.6.2 質(zhì)譜條件采用正離子掃描模式，用于鑒定的MS參數(shù)如下：霧化氣溫度：360℃；霧化氣氣流：7L·min-1；鞘氣溫度：400℃；鞘氣氣流：11L·min-1；掃描范圍為100~950Da；碎裂電壓：150V；碰撞能量：20/30/40V。定量的MS參數(shù)如下：霧化氣溫度：350℃；霧化氣氣流：8L·min-1；鞘氣溫度：380℃；鞘氣氣流：11L·min-1；掃描范圍為100~1000Da。用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等繪制標準曲線，并用其當量表示其葡萄糖苷衍生物的含量。
1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
所有試驗步驟都重復(fù)3次取平均值±標準差(X±SD)，單因素試驗的每個因素的顯著性分析用SPSS 22.0來計算，然后用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計。
2 結(jié)果與分析
2.1 超高壓輔助超聲波提取花色苷的單因素試驗結(jié)果
2.1.1 超高壓壓力對花色苷提取量的影響由圖1可知，經(jīng)超聲波與超高壓結(jié)合處理的紫玉米籽?；ㄉ仗崛×扛哂诔邏簡为毺幚恚覊毫υ?0~250MPa范圍內(nèi)，超高壓壓力在不斷增大的同時，紫玉米籽?；ㄉ仗崛÷试谥饾u升高。這是因為壓力的增大會對紫玉米表面直接產(chǎn)生影響，其細胞膜的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，使其細胞膜表面的膜孔發(fā)生改變，通透性變強，細胞內(nèi)的活性物質(zhì)傳輸能力增大[15]；壓力的不斷增加，會使紫玉米原料更多的細胞膜發(fā)生破壞，這樣原料內(nèi)的花色苷釋放的更多，整個體系也會達到最佳狀態(tài)[24]，從而達到了花色苷提取的最佳提取條件。當壓力達到250MPa時，紫玉米籽?；ㄉ盏奶崛×孔畲鬄?4.01mg·100g-1。但是隨著壓力繼續(xù)增加時，提取量開始下降，可能是因為花色苷的結(jié)構(gòu)被破壞，從而影響了花色苷的提取。張唯等[25]在用超高壓提取玫瑰花色苷時也得到了相同的結(jié)論。所以，選取150~350MPa進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖1 超高壓壓力對花色苷提取量的影響Figure 1 Effect of ultra-high pressure on anthocyanin extraction
2.1.2 超高壓時間對花色苷提取量的影響由圖2可知，經(jīng)超聲波與超高壓結(jié)合處理的紫玉米籽?；ㄉ仗崛×扛哂诔邏簡为毺幚?，在增加超高壓提取時間的情況下，花色苷的提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是因為超高壓提取起初紫玉米原料細胞內(nèi)花色苷含量高，而原料細胞外部也就是整個提取體系的花色苷含量較低，從而以原料細胞為界限形成了較大的濃度差，也就是濃度梯度，有利于花色苷向外釋放，使得花色苷含量增加[24]。當超高壓提取時間為2min時，此時花色苷提取量最大為48.03mg·100g-1。時間超過2min后，花色苷提取量開始下降，原因可能是過長的時間會造成已經(jīng)從細胞內(nèi)釋放的花色苷在外界條件作用下產(chǎn)生降解而變少，而且超高壓時間過長也會造成資源浪費[26]。陳亞利等[27]在超高壓提取紫薯花色苷時得到了相同的結(jié)論。所以，選取1~3min進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖2 超高壓時間對花色苷提取量的影響Figure 2 Effect of ultra-high pressure time on anthocyanin extraction
2.1.3 超聲時間對花色苷提取量的影響由圖3可知，超聲時間在4~8min時，花色苷提取量不斷增加，超聲8min后，花色苷提取量顯著下降，可能是由于在超聲處理過程中，整個提取體系的溫度在不斷上升，便會對花色苷的結(jié)構(gòu)、活性造成破壞，因為花色苷不耐熱，一旦溫度超過花色苷的耐受范圍，就會發(fā)生降解，從而使花色苷的提取量降低[28]，當超聲時間達到8min時，花色苷提取量最大為50.81mg·100g-1。所以，選取超聲溫度為6~10min進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖3 超聲時間對花色苷提取量的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on anthocyanin extraction
2.2 響應(yīng)面優(yōu)化紫玉米籽?；ㄉ仗崛×拷Y(jié)果
2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以超高壓壓力（A）、超高壓時間（B）、和超聲時間（C）為自變量，以花色苷含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面優(yōu)化法進行結(jié)果分析。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。
表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
2.2.2 回歸模型的建立及方差分析運用Design-Expert 8.0.6軟件分析實驗結(jié)果得到的回歸方程如下：
為了檢驗方程的有效性，對結(jié)果進行分析。由表3可知，對于響應(yīng)值花色苷含量，模型p<0.05，說明顯著；模型失擬項p>0.05，說明不顯著。由表4可知，該響應(yīng)值的模型相關(guān)系數(shù)R2為0.98，校正后R2為0.96，表示模型相關(guān)度良好；模型的變異系數(shù)小于10%，說明該模型可以較好地反應(yīng)試驗的真實性。綜上，此回歸模型及方差分析合理的呈現(xiàn)響應(yīng)值與每個自變量之間的作用關(guān)系，擬合程度較好。
表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations
表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis of models
2.2.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化根據(jù)Design-Expert8.0軟件繪制的三維曲面圖以及等高線圖，可以清楚地看出每個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。圖4和圖5中，花色苷含量隨著超高壓壓力的增加先升高后降低。圖5和圖6中，花色苷含量隨著超高壓時間的增加先升高后降低。圖4和圖6中，花色苷含量隨著超聲時間的增加先升高后降低。3個提取因素對花色苷提取量的影響可以比較直觀地從響應(yīng)面分析圖和等高線分布圖得出，若交互作用顯著等高線則會呈現(xiàn)橢圓形，越接近圓形越不顯著；3D曲面的陡峭則可以得出每個因素對花色苷提取量的影響大小，交互作用是否明顯[28]。因此得出超高壓時間（B）>超高壓壓力（A）>超聲時間（C）。超高壓壓力和超高壓時間、超高壓時間和超聲波時間交互作用顯著，超高壓壓力和超聲波時間交互作用不顯著。
圖4 因素A、因素B響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Figure 4 Response surface analysis and contour distribution of factors A and B
圖5 因素A、因素C響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Figure 5 Response surface analysis and contour distribution of factors A and C
圖6 因素B、因素C響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Figure 6 Response surface analysis and contour distribution of factors B and C
2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果回歸模型預(yù)測的紫玉米籽?；ㄉ盏奶崛∽罴压に嚍槌邏簤毫?66.75MPa、超高壓時間為1.81min、超聲時間為8.33min，花色苷提取的理論值達到50.02mg·100g-1。根據(jù)實際情況進行調(diào)整，超高壓壓力為270MPa、超高壓時間為1.9min、超聲時間為8.5min，此條件下進行3次試驗得到花色苷提取量最大為49.68mg·100g-1，與模型預(yù)測值吻為合度達到99.31%，說明此條件為回歸模型擬合出紫玉米籽粒提取花色苷的最佳條件，這樣也證明了響應(yīng)面法對紫玉米籽?；ㄉ仗崛l件參數(shù)優(yōu)化具有可行性。
2.3 超高壓輔助超聲波提取方式與單一提取方式的比較
由表5可得出，單一超聲波提取，隨超聲時間延長，先增加后下降，其中以超聲12.5min時提取率最高，為（42.18±0.27）mg·100g-1。超高壓輔助超聲波提取較單一超聲波提取方式相比，花色苷提取率顯著提升，提取時間也大大縮短。輔助提取方式比單一超聲波提取方式花色苷提取率增幅為17.80%。輔助提取方式在提高花色苷提取率的同時縮短了提取時間，有效提高了提取效率。
表5 超高壓輔助超聲波提取方式與單一提取方式的比較Table 5 Comparison between compound and single extraction
2.4 紫玉米花色苷提取液活性的測定結(jié)果
紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫夯钚越Y(jié)果如圖7。DPPH溶液由于形成自由基呈深紫色，ABTS溶液可被強氧化劑氧化呈現(xiàn)綠色，加入花色苷提取液后發(fā)生反應(yīng)使DPPH自由基濃度下降，所呈現(xiàn)出的顏色相應(yīng)變淺[29-30]。單一超聲提取所得紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫旱腄PPH自由基和ABTS+自由基清除率分別為54.74%和42.48%，超高壓輔助超聲波提取所得提取液DPPH自由基和ABTS自由基清除率分別為57.62%和44.83%。
圖7 紫玉米花色苷籽粒提取液活性結(jié)果Figure 7 Activity of purple corn anthocyanin seed extract
2.5 單一超聲波提取和超高壓輔助超聲波提取紫玉米籽粒花色苷組成分析結(jié)果
由表6可知，在超聲提取紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫褐需b定出11種花色苷，結(jié)合提取花色苷提取液中也鑒定出11種花色苷，兩種提取方式鑒定出的花色苷中有10種是相同的。其中矢車菊-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷等7種花色苷在紫玉米中廣泛存在，而其他花色苷未見報道[31-34]。從含量測定結(jié)果來看，矢車菊-3-O-丙二?；咸烟擒?、矢車菊-3-O-葡萄糖苷等5種花色苷為主要花色苷。其中，以天竺葵素-3-O-丙二?；咸烟擒蘸孔罡撸瑔我怀曁崛『洼o助提取的提取含量分別達到(1254.37±85.45)μg·g-1和(12477.06±77.18)μg·g-1，而芍藥素-3-O-葡萄糖苷在12種花色苷中含量最低，兩種提取方式所得提取含量分別為(0.10±0.01)μg·g-1和(0.07±0.01)μg·g-1。SURIANO等[34]檢測的紫玉米中矢車菊-3-O-丙二?；咸烟呛孔罡?，這可能與品種和生長條件有關(guān)[35]。
表6 超聲波提取和結(jié)合提取紫玉米籽?；ㄉ盏慕M分鑒定及含量測定結(jié)果Table 6 Identification and determination results of anthocyaninfrom purple corn seeds by ultrasonic extraction and compound extraction
續(xù)表
3 討論與結(jié)論
超聲提取時間過長會導(dǎo)致提取體系溫度的升高，從而造成熱敏性物質(zhì)的損失[22]。將超高壓輔助超聲波對原料中花色苷進行提取，原料首先進行超高壓輔助處理，可破壞原料細胞膜的通透性，促進花色苷的充分釋放及其與提取劑的充分接觸，從而有效減少超聲波提取的時間，這樣會避免熱敏性物質(zhì)因熱度過高而導(dǎo)致降解及生物活性降低。本研究以紫玉米籽粒為原料，采用超高壓輔助超聲波提取紫玉米籽粒中的花色苷，以響應(yīng)面法優(yōu)化確定了最佳提取工藝為：超高壓壓力為270MPa、超高壓時間為1.9min、超聲時間為8.5min，在此條件下，花色苷提取的理論值達到49.68mg·100g-1。與單一超聲波法提取紫玉米籽?；ㄉ障啾容^，花色苷提取率增幅達到17.80%，提取時間較單一超聲波提取相比縮短了30.58%。超聲波單一提取紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫篋PPH自由基清除率為54.74%，超高壓輔助超聲波提取花色苷提取液DPPH自由基清除率為57.62%；超聲波單一提取紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫篈BTS自由基清除率為42.48%，超高壓輔助超聲波提取花色苷提取液ABTS自由基清除率為44.83%。由此可見，輔助提取相較于單一超聲提取，不僅提高花色苷提取率、縮短了提取時間，而且其提取液對自由基清除能力并沒有被破壞，甚至同單一超聲提取相比有所增強。說明相較于單一超聲提取，采用超高壓輔助超聲波法可以在更短時間內(nèi)得到產(chǎn)量更高、活性相當甚至更強的紫玉米花色苷提取物。通過HPLC-MS對兩種提取方式下提取所得的花色苷進行分析鑒定，共鑒定出12種花色苷，其中，兩種提取方式下所得花色苷提取液中花色苷組成和含量并不相同，矢車菊素-3-O-二丙二酰基葡萄糖苷只存在于輔助提取所得紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫褐?，錦葵素-3-O-葡萄糖苷只存在于單一超聲波提取液中，而且，矢車菊-3-O-丙二酰基葡萄糖苷、芍藥素-3-O-丙二?；咸烟擒赵谳o助提取的提取液中含量較高，這可能與兩種提取條件下不同結(jié)構(gòu)花色苷化合物穩(wěn)定性不同有關(guān)。目前，關(guān)于紫玉米中各種花色苷自由基清除活性及其在超高壓和超聲波提取條件下穩(wěn)定性的研究鮮有報道，有待下一步深入研究。綜上所述，超高壓輔助超聲波提取紫玉米籽?；ㄉ站哂刑崛×扛?、速度快、抗氧化能力強等優(yōu)點，這也為紫玉米籽粒花色苷的工業(yè)化生產(chǎn)提取提供了有力的支持。
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（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，沈陽 110161）
花色苷是一種水溶性的具有強抗氧化活性的黃酮類植物色素，能夠抗癌抗腫瘤、控制血糖[1]，強化人體免疫系統(tǒng)及抗炎的作用[2-3]。紫玉米（Zea maysL.)是一種原產(chǎn)于秘魯?shù)淖魑?，在世界上一些國家也廣泛種植[4]。紫玉米對生長條件要求不苛刻，不僅產(chǎn)量高，而且耐貯存[5]，是一種便宜且富含高質(zhì)量高含量花色苷的原材料。紫玉米中的花色苷含量非常高且花色苷單體種類也豐富，中國的紫玉米籽粒中，花色苷總量為42~354mg·100g-1[6]。
超聲波提取法是目前比較常用的花色苷提取方法[7]，提取效率高，時間短，對有效成分的結(jié)構(gòu)破壞小[8]。張鐘等[9]用超聲輔助法提取黑糯玉米穗軸的色素，不僅很大程度地縮短了提取時間，而且提取率高達18.66%。劉長龍[10]采用超聲法提取黑玉米花色苷得到提取率為2.93mg·g-1。孫夢洋等[11]在單因素實驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法得到黑糯玉米芯中花色苷含量為57.29mg·g-1。
超高壓是指壓力在100～1000MPa的液體靜壓力，超高壓輔助提取技術(shù)是利用水或其他流體為媒介。在超高壓的作用下，富含活性物質(zhì)的植物原料發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，其細胞壁被破壞，從而原料內(nèi)的活性物質(zhì)能夠釋放，并且與提取溶劑充分接觸反應(yīng)，提取率得到明顯的提升[12]。目前，已有應(yīng)用于多酚[13]、多糖[14]等物質(zhì)提取的研究報道。李鵬等[15]應(yīng)用超高壓提取桑葚花色苷得到含量為(1.97±0.02)mg·g-1。許志新[16]應(yīng)用超高壓提取紫玉米穗軸花色苷，得到含量為(743.158±11.304)mg·100g-1。目前，將超高壓與超聲波兩種提取技術(shù)相結(jié)合用于提取的工藝鮮有報道，本研究將二者聯(lián)合來對紫玉米籽?；ㄉ者M行提取，旨在進一步提高花色苷提取率，節(jié)約提取時間，以期為紫玉米花色苷產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
紫玉米籽粒（烘干后磨成粉過60目篩備用）、無水乙醇、檸檬酸、（AR,上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、DPPH、ABTS試劑盒（上海源葉生物技術(shù)有限公司）、透明光面真空袋（福創(chuàng)辰品牌食品級全新PET+PE復(fù)合材質(zhì)）。
1.2 主要儀器與設(shè)備
JGY-2500B打粉機（廣州大祥電子機械設(shè)備有限公司）、KQ5200B超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）、全自動超高壓殺菌機（德陽四創(chuàng)科技有限公司）、TU-1810紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）、ELX-800酶標儀（美國BIOTEK公司）。
1.3 試驗方法
1.3.1 紫玉米花色苷提取步驟稱取研磨過篩的紫玉米籽粒粉2.0g于真空袋中，按照1:16的料液比向其加入乙醇和檸檬酸提取溶劑，使料液充分混合均勻后封口，進行超高壓預(yù)提取。
預(yù)處理結(jié)束后，將樣品置于超聲波中超聲提取，超聲功率為200W，超聲結(jié)束后離心收集上清液，即為花色苷提取液。
1.3.2 提取紫玉米籽粒花色苷單因素試驗（1）超高壓壓力。選取超高壓力為50，150，250，350，450MPa，保壓時間為2min，超聲波處理時間為5min，以總花色苷含量為評價指標。（2）超高壓時間。選取超高壓時間為1，2，3，4，5min，超高壓力為250MPa，超聲波處理時間為5min，以總花色苷含量為評價指標。（3）超聲時間。選取超高壓時間為2min，超高壓壓力為250MPa，超聲時間為4，6，8，10，12，14，16min，以總花色苷含量為評價指標。
1.3.3 紫玉米籽?；ㄉ盏暮繙y定采用pH示差法[17-18]測定花色苷含量：提取完成后無損轉(zhuǎn)移到離心管，離心條件為4℃、8000r·min-1離心20min，離心結(jié)束后將收集好的上清液加入提取溶劑定容至50mL，再吸取定容后的樣液0.5mL和鹽酸-氯化鉀緩沖液（pH=1）與鹽酸-乙酸鈉緩沖液（pH=4.5）4.5mL分別于試管內(nèi)，每組3個平行，在40℃的水浴鍋中反應(yīng)0.5h，接著將其無損轉(zhuǎn)移進行二次離心，條件為4℃、8000r·min-1離心10min，收取上清液分別測定吸光度OD520、OD700，計算花色苷收率，具體公式為[19]：
式中:A=(A510－A700)pH1.0－(A510－A700)pH4.5；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(449.2g·mol-1)；DF為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積(mL)；ε為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(26900L·mol·cm-1)；m為稱取的紫玉米籽粒粉質(zhì)量(g)；L為比色皿的光距長度(1cm)。
1.4 響應(yīng)面優(yōu)化超高壓輔助超聲提取花色苷
通過單因素試驗確定對超聲波提取紫玉米籽粒花色苷影響最大的3個因素為超高壓壓力、超高壓時間和超聲時間。每個因素設(shè)3個水平，以花色苷含量為響應(yīng)值，值越大，提取效果越好，通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計分析，確定各因素配比。試驗因素與水平設(shè)計見表1[20-21]。
表1 響應(yīng)面設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment
1.5 生物活性測定
1.5.1 DPPH自由基清除活性測定根據(jù)CHEN等[22]的方法稍加改動。取0.2mL經(jīng)過稀釋處理過的樣品溶液于96孔板中，再向其加入0.2mL DPPH-乙醇工作液（乙醇配制），使其振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)30min后，測定其在波長為517nm處吸光度值記A1，取0.2mL同等條件稀釋的樣液與0.2mL無水乙醇混合均勻于96孔板中，相同波長測吸光度值記A2，平行測定3次取平均值，結(jié)果以DPPH自由基清除率來表示。
式中：A0為以蒸餾水替代樣品的吸光值；A1為樣品吸光值；A2為以乙醇替代工作液的吸光值。
1.5.2 ABTS自由基清除能力測定根據(jù)黃彪等[23]方法稍作修改。制備的ABTS工作液用80%無水乙醇稀釋，調(diào)節(jié)其吸光值在734nm波長下為0.7±0.05，同時在405nm波長下為1.4。取10μL紫玉米花色苷樣液與200μL ABTS工作液共同加入到96孔板中，避光孵育6min，在734nm下測定吸光值，記為A1。再取10μL紫玉米花色苷樣液提取液與200μL ABTS工作液共同加入到96孔板中，反應(yīng)條件相同測定吸光值，記為A0。再以等體積80%無水乙醇代替ABTS工作液，其他反應(yīng)條件不改變測吸光值，記為A2。重復(fù)3次平行試驗取平均值。
式中：A0為以紫玉米花色苷提取液替代樣品的吸光值；A1為樣品吸光值；A2為以80%乙醇替代工作液的吸光值。
1.6 超聲波提取和結(jié)合提取紫玉米籽?；ㄉ战M成分析
使用HPLC-MS法鑒定和測定紫玉米籽?；ㄉ战M成。采集軟件：Agilent MassHunter Workstation Data Acquisition(versions B.06.00)。處理軟件：Agilent MassHunter Qualitative Analysis(versions B.06.00)。
1.6.1 液相條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 column(4.6×100mm,1.8μm)；進樣量：5uL；柱溫：30℃；流速：0.5mL·min-1；流動相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈；梯度洗脫A：95%~0%(0~35min)，A：0%(35~40min)。
1.6.2 質(zhì)譜條件采用正離子掃描模式，用于鑒定的MS參數(shù)如下：霧化氣溫度：360℃；霧化氣氣流：7L·min-1；鞘氣溫度：400℃；鞘氣氣流：11L·min-1；掃描范圍為100~950Da；碎裂電壓：150V；碰撞能量：20/30/40V。定量的MS參數(shù)如下：霧化氣溫度：350℃；霧化氣氣流：8L·min-1；鞘氣溫度：380℃；鞘氣氣流：11L·min-1；掃描范圍為100~1000Da。用矢車菊素-3-O-葡萄糖苷等繪制標準曲線，并用其當量表示其葡萄糖苷衍生物的含量。
1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法
所有試驗步驟都重復(fù)3次取平均值±標準差(X±SD)，單因素試驗的每個因素的顯著性分析用SPSS 22.0來計算，然后用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計。
2 結(jié)果與分析
2.1 超高壓輔助超聲波提取花色苷的單因素試驗結(jié)果
2.1.1 超高壓壓力對花色苷提取量的影響由圖1可知，經(jīng)超聲波與超高壓結(jié)合處理的紫玉米籽?；ㄉ仗崛×扛哂诔邏簡为毺幚恚覊毫υ?0~250MPa范圍內(nèi)，超高壓壓力在不斷增大的同時，紫玉米籽?；ㄉ仗崛÷试谥饾u升高。這是因為壓力的增大會對紫玉米表面直接產(chǎn)生影響，其細胞膜的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，使其細胞膜表面的膜孔發(fā)生改變，通透性變強，細胞內(nèi)的活性物質(zhì)傳輸能力增大[15]；壓力的不斷增加，會使紫玉米原料更多的細胞膜發(fā)生破壞，這樣原料內(nèi)的花色苷釋放的更多，整個體系也會達到最佳狀態(tài)[24]，從而達到了花色苷提取的最佳提取條件。當壓力達到250MPa時，紫玉米籽?；ㄉ盏奶崛×孔畲鬄?4.01mg·100g-1。但是隨著壓力繼續(xù)增加時，提取量開始下降，可能是因為花色苷的結(jié)構(gòu)被破壞，從而影響了花色苷的提取。張唯等[25]在用超高壓提取玫瑰花色苷時也得到了相同的結(jié)論。所以，選取150~350MPa進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖1 超高壓壓力對花色苷提取量的影響Figure 1 Effect of ultra-high pressure on anthocyanin extraction
2.1.2 超高壓時間對花色苷提取量的影響由圖2可知，經(jīng)超聲波與超高壓結(jié)合處理的紫玉米籽?；ㄉ仗崛×扛哂诔邏簡为毺幚?，在增加超高壓提取時間的情況下，花色苷的提取量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是因為超高壓提取起初紫玉米原料細胞內(nèi)花色苷含量高，而原料細胞外部也就是整個提取體系的花色苷含量較低，從而以原料細胞為界限形成了較大的濃度差，也就是濃度梯度，有利于花色苷向外釋放，使得花色苷含量增加[24]。當超高壓提取時間為2min時，此時花色苷提取量最大為48.03mg·100g-1。時間超過2min后，花色苷提取量開始下降，原因可能是過長的時間會造成已經(jīng)從細胞內(nèi)釋放的花色苷在外界條件作用下產(chǎn)生降解而變少，而且超高壓時間過長也會造成資源浪費[26]。陳亞利等[27]在超高壓提取紫薯花色苷時得到了相同的結(jié)論。所以，選取1~3min進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖2 超高壓時間對花色苷提取量的影響Figure 2 Effect of ultra-high pressure time on anthocyanin extraction
2.1.3 超聲時間對花色苷提取量的影響由圖3可知，超聲時間在4~8min時，花色苷提取量不斷增加，超聲8min后，花色苷提取量顯著下降，可能是由于在超聲處理過程中，整個提取體系的溫度在不斷上升，便會對花色苷的結(jié)構(gòu)、活性造成破壞，因為花色苷不耐熱，一旦溫度超過花色苷的耐受范圍，就會發(fā)生降解，從而使花色苷的提取量降低[28]，當超聲時間達到8min時，花色苷提取量最大為50.81mg·100g-1。所以，選取超聲溫度為6~10min進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖3 超聲時間對花色苷提取量的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on anthocyanin extraction
2.2 響應(yīng)面優(yōu)化紫玉米籽?；ㄉ仗崛×拷Y(jié)果
2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以超高壓壓力（A）、超高壓時間（B）、和超聲時間（C）為自變量，以花色苷含量為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面優(yōu)化法進行結(jié)果分析。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。
表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis
2.2.2 回歸模型的建立及方差分析運用Design-Expert 8.0.6軟件分析實驗結(jié)果得到的回歸方程如下：
為了檢驗方程的有效性，對結(jié)果進行分析。由表3可知，對于響應(yīng)值花色苷含量，模型p<0.05，說明顯著；模型失擬項p>0.05，說明不顯著。由表4可知，該響應(yīng)值的模型相關(guān)系數(shù)R2為0.98，校正后R2為0.96，表示模型相關(guān)度良好；模型的變異系數(shù)小于10%，說明該模型可以較好地反應(yīng)試驗的真實性。綜上，此回歸模型及方差分析合理的呈現(xiàn)響應(yīng)值與每個自變量之間的作用關(guān)系，擬合程度較好。
表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equations
表4 模型可信度分析Table 4 Reliability analysis of models
2.2.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化根據(jù)Design-Expert8.0軟件繪制的三維曲面圖以及等高線圖，可以清楚地看出每個因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。圖4和圖5中，花色苷含量隨著超高壓壓力的增加先升高后降低。圖5和圖6中，花色苷含量隨著超高壓時間的增加先升高后降低。圖4和圖6中，花色苷含量隨著超聲時間的增加先升高后降低。3個提取因素對花色苷提取量的影響可以比較直觀地從響應(yīng)面分析圖和等高線分布圖得出，若交互作用顯著等高線則會呈現(xiàn)橢圓形，越接近圓形越不顯著；3D曲面的陡峭則可以得出每個因素對花色苷提取量的影響大小，交互作用是否明顯[28]。因此得出超高壓時間（B）>超高壓壓力（A）>超聲時間（C）。超高壓壓力和超高壓時間、超高壓時間和超聲波時間交互作用顯著，超高壓壓力和超聲波時間交互作用不顯著。
圖4 因素A、因素B響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Figure 4 Response surface analysis and contour distribution of factors A and B
圖5 因素A、因素C響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Figure 5 Response surface analysis and contour distribution of factors A and C
圖6 因素B、因素C響應(yīng)面分析圖及等高線分布圖Figure 6 Response surface analysis and contour distribution of factors B and C
2.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果回歸模型預(yù)測的紫玉米籽?；ㄉ盏奶崛∽罴压に嚍槌邏簤毫?66.75MPa、超高壓時間為1.81min、超聲時間為8.33min，花色苷提取的理論值達到50.02mg·100g-1。根據(jù)實際情況進行調(diào)整，超高壓壓力為270MPa、超高壓時間為1.9min、超聲時間為8.5min，此條件下進行3次試驗得到花色苷提取量最大為49.68mg·100g-1，與模型預(yù)測值吻為合度達到99.31%，說明此條件為回歸模型擬合出紫玉米籽粒提取花色苷的最佳條件，這樣也證明了響應(yīng)面法對紫玉米籽?；ㄉ仗崛l件參數(shù)優(yōu)化具有可行性。
2.3 超高壓輔助超聲波提取方式與單一提取方式的比較
由表5可得出，單一超聲波提取，隨超聲時間延長，先增加后下降，其中以超聲12.5min時提取率最高，為（42.18±0.27）mg·100g-1。超高壓輔助超聲波提取較單一超聲波提取方式相比，花色苷提取率顯著提升，提取時間也大大縮短。輔助提取方式比單一超聲波提取方式花色苷提取率增幅為17.80%。輔助提取方式在提高花色苷提取率的同時縮短了提取時間，有效提高了提取效率。
表5 超高壓輔助超聲波提取方式與單一提取方式的比較Table 5 Comparison between compound and single extraction
2.4 紫玉米花色苷提取液活性的測定結(jié)果
紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫夯钚越Y(jié)果如圖7。DPPH溶液由于形成自由基呈深紫色，ABTS溶液可被強氧化劑氧化呈現(xiàn)綠色，加入花色苷提取液后發(fā)生反應(yīng)使DPPH自由基濃度下降，所呈現(xiàn)出的顏色相應(yīng)變淺[29-30]。單一超聲提取所得紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫旱腄PPH自由基和ABTS+自由基清除率分別為54.74%和42.48%，超高壓輔助超聲波提取所得提取液DPPH自由基和ABTS自由基清除率分別為57.62%和44.83%。
圖7 紫玉米花色苷籽粒提取液活性結(jié)果Figure 7 Activity of purple corn anthocyanin seed extract
2.5 單一超聲波提取和超高壓輔助超聲波提取紫玉米籽粒花色苷組成分析結(jié)果
由表6可知，在超聲提取紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫褐需b定出11種花色苷，結(jié)合提取花色苷提取液中也鑒定出11種花色苷，兩種提取方式鑒定出的花色苷中有10種是相同的。其中矢車菊-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-葡萄糖苷等7種花色苷在紫玉米中廣泛存在，而其他花色苷未見報道[31-34]。從含量測定結(jié)果來看，矢車菊-3-O-丙二?；咸烟擒?、矢車菊-3-O-葡萄糖苷等5種花色苷為主要花色苷。其中，以天竺葵素-3-O-丙二?；咸烟擒蘸孔罡撸瑔我怀曁崛『洼o助提取的提取含量分別達到(1254.37±85.45)μg·g-1和(12477.06±77.18)μg·g-1，而芍藥素-3-O-葡萄糖苷在12種花色苷中含量最低，兩種提取方式所得提取含量分別為(0.10±0.01)μg·g-1和(0.07±0.01)μg·g-1。SURIANO等[34]檢測的紫玉米中矢車菊-3-O-丙二?；咸烟呛孔罡?，這可能與品種和生長條件有關(guān)[35]。
表6 超聲波提取和結(jié)合提取紫玉米籽?；ㄉ盏慕M分鑒定及含量測定結(jié)果Table 6 Identification and determination results of anthocyaninfrom purple corn seeds by ultrasonic extraction and compound extraction
續(xù)表
3 討論與結(jié)論
超聲提取時間過長會導(dǎo)致提取體系溫度的升高，從而造成熱敏性物質(zhì)的損失[22]。將超高壓輔助超聲波對原料中花色苷進行提取，原料首先進行超高壓輔助處理，可破壞原料細胞膜的通透性，促進花色苷的充分釋放及其與提取劑的充分接觸，從而有效減少超聲波提取的時間，這樣會避免熱敏性物質(zhì)因熱度過高而導(dǎo)致降解及生物活性降低。本研究以紫玉米籽粒為原料，采用超高壓輔助超聲波提取紫玉米籽粒中的花色苷，以響應(yīng)面法優(yōu)化確定了最佳提取工藝為：超高壓壓力為270MPa、超高壓時間為1.9min、超聲時間為8.5min，在此條件下，花色苷提取的理論值達到49.68mg·100g-1。與單一超聲波法提取紫玉米籽?；ㄉ障啾容^，花色苷提取率增幅達到17.80%，提取時間較單一超聲波提取相比縮短了30.58%。超聲波單一提取紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫篋PPH自由基清除率為54.74%，超高壓輔助超聲波提取花色苷提取液DPPH自由基清除率為57.62%；超聲波單一提取紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫篈BTS自由基清除率為42.48%，超高壓輔助超聲波提取花色苷提取液ABTS自由基清除率為44.83%。由此可見，輔助提取相較于單一超聲提取，不僅提高花色苷提取率、縮短了提取時間，而且其提取液對自由基清除能力并沒有被破壞，甚至同單一超聲提取相比有所增強。說明相較于單一超聲提取，采用超高壓輔助超聲波法可以在更短時間內(nèi)得到產(chǎn)量更高、活性相當甚至更強的紫玉米花色苷提取物。通過HPLC-MS對兩種提取方式下提取所得的花色苷進行分析鑒定，共鑒定出12種花色苷，其中，兩種提取方式下所得花色苷提取液中花色苷組成和含量并不相同，矢車菊素-3-O-二丙二酰基葡萄糖苷只存在于輔助提取所得紫玉米籽?；ㄉ仗崛∫褐?，錦葵素-3-O-葡萄糖苷只存在于單一超聲波提取液中，而且，矢車菊-3-O-丙二酰基葡萄糖苷、芍藥素-3-O-丙二?；咸烟擒赵谳o助提取的提取液中含量較高，這可能與兩種提取條件下不同結(jié)構(gòu)花色苷化合物穩(wěn)定性不同有關(guān)。目前，關(guān)于紫玉米中各種花色苷自由基清除活性及其在超高壓和超聲波提取條件下穩(wěn)定性的研究鮮有報道，有待下一步深入研究。綜上所述，超高壓輔助超聲波提取紫玉米籽?；ㄉ站哂刑崛×扛?、速度快、抗氧化能力強等優(yōu)點，這也為紫玉米籽粒花色苷的工業(yè)化生產(chǎn)提取提供了有力的支持。
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