不同濃度鹽脅迫下枸杞實時熒光定量PCR內(nèi)參基因的篩選

張得芳，于 倩，史文君

（青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016）

實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團（帶有熒光標(biāo)記的特異性探針等），并利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對DNA模板進行定量分析的方法，常用于檢測基因表達譜、基因表達量分析、轉(zhuǎn)錄組結(jié)果驗證分析等方面[1]，是一種應(yīng)用廣泛、靈敏度高[2]的分析方法。在qRT-PCR的分析過程中，多種因素如RNA和cDNA的濃度純度[3]、各階段的反應(yīng)條件等都會對分析結(jié)果產(chǎn)生影響[4]，選擇表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因可對熒光定量PCR反應(yīng)進行準(zhǔn)確校正，從而減小數(shù)據(jù)誤差[5]，不恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因會導(dǎo)致表達譜的偏移從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性[6]，因此選擇合適的內(nèi)參基因?qū)υ囼灲Y(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。

內(nèi)參基因是在基因表達過程中不受溫度等外部條件影響且在不同樣品中均穩(wěn)定表達的參照基因[7]，利用這個基因的表達水平可以準(zhǔn)確量化初始材料的載量。管家基因在所有細胞中均有表達，且表達水平受環(huán)境因素影響較小，因此在進行基因表達水平的研究時常用其作為內(nèi)參基因進行試驗。常見的管家基因有：肌動蛋白基因（ACT/Actin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF1α）、多聚泛素酶基因（UBI/UBQ）、18S核糖體RNA（18S）、β2-微球蛋白基因（B2M）和親環(huán)蛋白基因（CYP）等[8]?，F(xiàn)有的研究表明，在所有組織、發(fā)育時期、生理條件下均穩(wěn)定表達的理想內(nèi)參基因并不存在，所以其表達的穩(wěn)定性是相對的，需要研究者根據(jù)自己的樣品類型及試驗條件來選擇合適的內(nèi)參基因。由于時空的變化，RNA的表達水平并不恒定的，細胞周期的不同階段內(nèi)以及不同類型的細胞或組織都可能存在差異，因此需要根據(jù)實際研究的細胞和組織類型以及實驗要求，從多種內(nèi)參基因中篩選出適合自己試驗的穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，同時也可以選擇多內(nèi)參基因的研究方法，設(shè)置兩個或兩個以上的內(nèi)參基因，取均值后校正目的基因，從而得到更可靠的結(jié)果。常見的內(nèi)參基因在不同植物[9]、不同處理的樣本中表達并不穩(wěn)定，盲目選擇不適宜的內(nèi)參基因往往會導(dǎo)致結(jié)果分析的偏離甚至得到錯誤結(jié)論[10]，所以研究特定植物表達模式前進行其內(nèi)參基因篩選是很有必要的。正確選擇內(nèi)參基因，很大程度上依賴于所研究的細胞或組織及試驗條件，不同的試驗需要尋找適合試驗體系的內(nèi)參基因[11]?，F(xiàn)已篩選出在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[12]、茄子（Solanum melongema）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、水稻（Oryza sativa）、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、蘋果（Malus pumila）、棉花（Gossypium hirsutum）、甘蔗（Saccharum officinarum）、銀杏（Ginkgo biloba）、杉木（Cunninghamia lanceolata）等植物中在特定條件或組織部位中穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，用于植物基因表達譜表達分析、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析和脅迫下作用機制等方面的研究。

寧夏枸杞（Lycium barbarum）和黑果枸杞（Lycium ruthenicum）均為茄科枸杞屬灌木，耐鹽堿、干旱、荒漠，常在綠化造林中用作水土保持的樹種，在我國西北等地體現(xiàn)出較高的生態(tài)價值，也是中國特有的藥食同源類植物[13]，具有較高的研究價值和應(yīng)用前景。目前枸杞的研究大部分主要集中在育種栽培、化學(xué)成分分析、藥理學(xué)與臨床應(yīng)用、食品及食品保健品開發(fā)等方面，對于枸杞耐鹽性的相關(guān)報道大多是生理生化變化等內(nèi)容，關(guān)于離子吸收轉(zhuǎn)運的調(diào)控機制及相關(guān)基因的功能研究方面涉及比較少，有待于進行更多、更全面地研究來填補空缺，因此對于枸杞抗鹽堿的研究具有重要的意義。

本研究在枸杞以及其他茄科植物如番茄、馬鈴薯、茄子等植物中挑選出GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S這5個常用基因為候選內(nèi)參基因，以不同濃度NaCl處理后的寧夏枸杞、黑果枸杞組培苗的葉片部分為試驗材料，對5個候選內(nèi)參基因進行熒光定量PCR等試驗，通過反應(yīng)循環(huán)閾值（Ct）、變異系數(shù)等指標(biāo)分析評估表達最穩(wěn)定的基因，并利用GeNorm、Normfinder和BestKeeper軟件進行穩(wěn)定性分析，進而篩選出最適合寧夏枸杞、黑果枸杞熒光定量PCR的內(nèi)參基因，為后續(xù)通過qRT-PCR分析枸杞基因表達趨勢等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗材料選用長勢良好的寧夏枸杞和黑果枸杞組培幼苗，將根部培養(yǎng)基洗凈后移至裝有清水的培養(yǎng)瓶中，并對枸杞幼苗進行0（CK），100，200，300，400mmol·L-1NaCl溶液處理培養(yǎng)，每個濃度均設(shè)置3次重復(fù)，每瓶培養(yǎng)瓶內(nèi)放5~8株幼苗，處理7d后分別采樣編號，用液氮速凍后，放置于-80℃超低溫冰箱中備用。

1.2 枸杞總RNA的提取與檢測

稱取400mg不同濃度鹽脅迫后的冷凍枸杞葉片，在液氮中充分研磨，使用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Ex‐traction Kit試劑盒提取枸杞葉片部分的總RNA，通過Nanodrop OneC超微量分光光度計對提取的RNA進行濃度和純度（OD值）的測定和檢驗，篩選出濃度大于100ng·μL-1且A260/280在1.90~2.20的RNA樣品，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性對其濃度純度進行驗證。

1.3 cDNA合成

使用PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。反應(yīng)使用10μL體系：5x PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μL、Total RNA模板 根據(jù)濃度計算（最多500ng）、RNase Freed dH2O補充到10μL。反應(yīng)條件為：37℃15min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）、85℃5s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置于-20℃冰箱中，用于后續(xù)的PCR驗證以及qRT-PCR的反應(yīng)。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)枸杞的其他現(xiàn)有研究中篩選出5個枸杞、番茄、馬鈴薯等茄科植物常用的內(nèi)參基因GAPDH、Actin、EF1α、UBI、18S為候選內(nèi)參基因（表1），通過NCBI等數(shù)據(jù)平臺或已有文獻中檢索獲得候選內(nèi)參基因的序列信息，使用Primer5.0軟件設(shè)計引物，長度20~25bp，CG%為45%~55%，并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，在進行試驗前將上下游引物均稀釋到工作濃度。

表1 候選內(nèi)參基因的qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers of candidate internal reference genes

1.5 普通PCR和qRT-PCR

先通過普通PCR驗證引物的特異性，反應(yīng)體系為25μL，其中包括：模板（第一鏈cDNA）1μL、Premix Taq（Ex TaqVersion 2.0 plus dye）12.5μL、上游引物（20μM）0.5μL、下游引物（20μM）0.5μL、滅菌水10.5μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min、共35個循環(huán)、72℃后延伸5min，再通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行特異性驗證。

使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒進行qRT-PCR試驗，反應(yīng)在BIO-RAD CFX Connect Real-Time Systern（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，上海）qRT-PCR儀上進行。反應(yīng)以2μL枸杞第一鏈cDNA為模板，加入TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5μL、PCR Forward Primer（10μM）1μL、PCR Reverse Primer（10μM）1μL、滅菌水8.5μL，體系共25μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共50個循環(huán)，溶解曲線65~95℃，增加0.5℃用時0.05s。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010對qRT-PCR結(jié)果中的周期閾值（Ct）進行統(tǒng)計分析，分析候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，并用OriginPro 9.1軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計圖的繪制，評估其是否適宜用作熒光定量PCR反應(yīng)的內(nèi)參基因。

使用RefFinder平臺基于GeNorm、Normfinder和BestKeeper軟件算法對5個候選基因的試驗結(jié)果進行計算驗證，綜合各方法得到適用于本研究后續(xù)試驗中最為準(zhǔn)確、合適的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞RNA的檢測與引物特異性驗證

先使用超微量分光光度計對提取的RNA進行濃度和純度的檢測，得到的濃度值均高于100ng·μL-1，OD值（A260/280）在2.00~2.20；通過1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的RNA進行檢測，結(jié)果如圖1，雙條帶型（18s、28s）清晰無拖帶，完整度較好，表明提取的枸杞RNA濃度和純度都達到試驗要求，可用于下一步研究。

由圖2可知，以所有候選內(nèi)參基因的cDNA為模板進行普通PCR擴增，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測可知，擴增結(jié)果均可得到清晰、單一的特異性條帶，明亮無雜帶，表明擴增產(chǎn)物無引物二聚體和非特異性擴增，可用于后續(xù)的qRT-PCR試驗。

2.2 鹽脅迫條件下枸杞內(nèi)參基因的qRT-PCR分析

以枸杞cDNA為模板，根據(jù)設(shè)計的引物進行熒光定量PCR分析，根據(jù)5個候選內(nèi)參基因的熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜（圖3）可知，在不同濃度的NaCl溶液（0，100，200，300，400mmol·L-1）處理下，熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜中均只出現(xiàn)單一主峰，前后無其他雜峰；由擴增曲線（圖4）可知，擴增曲線為S型，無其他異常波動，表明熒光定量PCR中引物特異性較好，其中，GAPDH、Actin、EF1α基因的曲線更集中、重復(fù)性高，其引物特異性表現(xiàn)優(yōu)于UBI、18S基因。

M.D2000；1-5.0，100，200，300，400mmol·L-1 NaCl Lycium barbarum；6-10.0，100，200，300，400mmol·L-1 NaCl Lycium ruthenicum

M.D2000；1.GAPDH；2.Actin；3.EF1α；4.UBI；5.18S

圖3 qRT-PCR的熔解曲線導(dǎo)數(shù)圖譜Figure 3 The melting curve derivative map of qRT-PCR

圖4 qRT-PCR的擴增曲線圖譜Figure 4 The amplification curve map of qRT-PCR

5個候選內(nèi)參基因在經(jīng)不同濃度NaCl處理后的寧夏枸杞與黑果枸杞中的熒光定量PCR結(jié)果如圖5。循環(huán)閾值（Ct）是選擇內(nèi)參基因的重要標(biāo)準(zhǔn)，通過Ct值的變化趨勢判斷基因的表達量穩(wěn)定情況。由圖5可知，5個候選內(nèi)參基因的Ct值均值大部分集中在18~25之間，其表達水平存在差異。其中，EF1α、UBI、18S基因的反應(yīng)Ct值變化幅度很大，穩(wěn)定性不高：EF1α基因的表達情況隨著鹽脅迫濃度的升高呈先下降后上升再下降的情況，且在寧夏枸杞中最高濃度下有所回升；UBI基因的變化趨勢在寧夏枸杞和黑果枸杞中都為明顯的持續(xù)下調(diào)；18S基因的變化趨勢為先下降后上升再下降，在黑果枸杞中400mmol·L-1NaCl處理下變化趨勢又有所上升。綜上，這3個基因均不宜作為內(nèi)參基因用于熒光定量PCR的試驗，且與上述3個基因相比，GAPDH、Actin基因的穩(wěn)定性較好，其中Actin基因的Ct值變化最小，更適合作為內(nèi)參基因進行后續(xù)試驗。

圖5 5個候選內(nèi)參基因的Ct值變化Figure 5 Changes in Ct values of five candidate internal reference genes

2.3 鹽脅迫條件下枸杞內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性分析

2.3.1 GeNorm軟件分析將不同候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值由高到低進行排序，表達穩(wěn)定值越低代表基因的穩(wěn)定性越好，反之越差，程序默認低于1.5的穩(wěn)定值是內(nèi)參基因穩(wěn)定表達的數(shù)值范圍。由表2可知，寧夏枸杞和黑果枸杞中，排名前兩位的內(nèi)參基因為Actin和GAPDH，其表達穩(wěn)定值分別為1.142和0.560，小于1.5的預(yù)定范圍，穩(wěn)定性較好，表明這兩個基因適合作為內(nèi)參基因用于寧夏枸杞和黑果枸杞的qRT-PCR試驗中，而EF1α、UBI和18S基因的表達穩(wěn)定值均大于1.5，這些基因在枸杞中表達的穩(wěn)定性較差,不適合作為內(nèi)參基因用于后續(xù)反應(yīng)。

表2 GeNorm軟件分析5個候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性Table 2 GeNorm analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.2 NormFinder軟件軟件得出的數(shù)據(jù)中表達穩(wěn)定值與基因穩(wěn)定性呈負相關(guān)，即數(shù)值越小，基因的表達越穩(wěn)定。由表3可知，寧夏枸杞中，候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值由低到高依次為UBI、Actin、GAPDH、EF1α和18S，黑果枸杞中由低到高排序依次為Actin、GAPDH、EF1α、18S、UBI，Actin基因的表達穩(wěn)定值最小，即穩(wěn)定性最好。

表3 NormFinder軟件分析5個候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性Table 3 NormFinder analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.3 BestKeeper軟件通過qRT-PCR反應(yīng)得出的Ct值判斷內(nèi)參基因表達的穩(wěn)定程度，標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）越低的基因表達的穩(wěn)定性越好。由表4可知，5個候選內(nèi)參基因中，GAPDH、EF1α、UBI、18S基因在寧夏枸杞和黑果枸杞中的標(biāo)準(zhǔn)差大于1，即這些基因的表達在本試驗中鹽脅迫條件下不穩(wěn)定，不宜作為鹽脅迫試驗中用作后續(xù)熒光定量PCR試驗的內(nèi)參基因使用。綜合兩種枸杞中基因的表達情況，Actin基因的標(biāo)準(zhǔn)差均小于1，表達的穩(wěn)定性最高。

表4 BestKeeper軟件分析5個候選內(nèi)參基因在不同條件下的表達穩(wěn)定性Table 4 BestKeeper analysis of five candidate reference genes with respect to their expression stability under different conditions

2.3.4 綜合分析由表5可知，本試驗以經(jīng)過不同濃度NaCl脅迫后的寧夏枸杞和黑果枸杞幼苗的葉片部分為材料，根據(jù)不同軟件算法綜合排名以及qRT-PCR結(jié)果篩選出的最適合進行寧夏枸杞與黑果枸杞實時熒光定量分析試驗的內(nèi)參基因為Actin基因，EF1α、UBI和18S基因的表達穩(wěn)定性較差,不適合用作內(nèi)參基因。

表5 5個候選內(nèi)參基因在不同條件下表達穩(wěn)定性的綜合分析Table 5 Comprehensive analysis of expression stability of five candidate reference genes under different conditions

3 討論與結(jié)論

實時熒光定量PCR因其靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性、范圍廣等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于mRNA定量分析、基因表達譜等多方面研究中，其試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性主要依托于根據(jù)不同類型的植物樣本以及反應(yīng)進行的條件選擇合適的內(nèi)參基因。在qRT-PCR中，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性非常重要，直接影響著試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)進行表達分析時，選擇多個內(nèi)參基因作為校正標(biāo)準(zhǔn)，更有利于研究的準(zhǔn)確進行。GeNorm、Norm‐Finder和BestKeeper程序在對參考基因的打分排名中會產(chǎn)生輕微的差異[14]，這可以由統(tǒng)計算法的差異來解釋[11]。本研究使用了3種不同的統(tǒng)計算法，結(jié)合熒光定量反應(yīng)中各基因的表現(xiàn)，盡量減少參考基因穩(wěn)定性評估中可能出現(xiàn)的偏差。

GAPDH基因是光合作用固氮循環(huán)、糖降解、糖異生等反應(yīng)的關(guān)鍵因子，是最常用的內(nèi)參基因之一，因其同源性較低，較為獨特[15]。CRYSTIAN等[16]對甘蔗在不同脅迫條件下穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因進行篩選得出，GAPDH基因在所有軟件中表現(xiàn)最穩(wěn)定，表明其適用于甘蔗干旱脅迫的基因表達研究；WANG等[17]對不同組織部位和鹽堿、干旱脅迫下的棉花內(nèi)參基因進行篩選發(fā)現(xiàn)，GAPDH和UBQ7基因均可作為內(nèi)參基因用于根、葉片的鹽堿以及干旱條件下熒光定量分析中，適用范圍較廣。但也有研究表明GAPDH基因在某些特定條件下其表達存在不穩(wěn)定性，L?VDAL等[18]對不同非生物脅迫下番茄內(nèi)參基因篩選結(jié)果表明，GAPDH和PGK基因在光脅迫期條件下排名最高，但在氮元素和寒冷脅迫期時排名不佳。

Actin基因是一類高度保守的球狀微絲結(jié)構(gòu)蛋白，可分為α、β、γ 3種，β-Actin基因在不同組織中的表達量最高、變化量最小[19]，也作為內(nèi)參基因廣為使用。蘇西婭等[20]對銀杏雌雄株不同組織部位的最適內(nèi)參基因進行研究發(fā)現(xiàn)，不同候選基因的穩(wěn)定性有所不同，GbUBQ在不同發(fā)育時期的雄株葉片中表達最穩(wěn)定，GbACT在雌株葉片表達最穩(wěn)定。EF1α是細胞內(nèi)含量僅次于肌動蛋白的蛋白質(zhì)因子，其基因在根和葉片中穩(wěn)定高度保守性表達[21]。NICOT等[22]使用GeNorm軟件對馬鈴薯進行了寒冷、鹽堿等非生物脅迫，結(jié)果表明EF1α表現(xiàn)最穩(wěn)定；樊連梅等[23]對蘋果果實著色期的qRT-PCR理想內(nèi)參基因進行篩選，結(jié)果表明EF-1α的表達水平高且最穩(wěn)定；但DA CRUZSARAIVA等[24]在大豆的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在不同的發(fā)育時期和不同條件的脅迫下表達量會有不同程度的變化，其穩(wěn)定性表現(xiàn)不佳。

UBI/UBQ基因是泛素家族基因，主要作用于蛋白質(zhì)的降解過程[25]，該基因在同一物種的不同品系之間以及不同的軟件之間的計算結(jié)果都會顯示出基因表達的差異，但是在紫花苜蓿（Medicago lupulina）的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因的表達在不同濃度的鋅脅迫下處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)[26]；AULER等[27]在水稻內(nèi)參基因的研究中發(fā)現(xiàn)UBQ5基因可作為內(nèi)參基因用于所有樣品和軟件的評估，在基因表達時穩(wěn)定性表現(xiàn)較好。

18S基因主要在維持細胞內(nèi)基礎(chǔ)代謝等途徑發(fā)揮作用[28]，是真核生物細胞中最保守的基因之一[29]。MIKA‐MI等[30]在對紅毛菜屬植物的研究中發(fā)現(xiàn)，在營養(yǎng)缺乏、鹽脅迫和溫度脅迫條件下，18S基因的表達也會出現(xiàn)隨著脅迫時間和濃度的變化而變化的現(xiàn)象。這些基因因其特定的表達特點常被用作內(nèi)參基因進行熒光定量PCR分析。

研究表明，在不同處理、不同植物組織中，最適合的內(nèi)參基因存在差異。鹽堿環(huán)境等非生物脅迫會影響到植物中的看家基因的表達量。例如，GALLI等[31]在草莓（Fragaria ananassa）的鹽脅迫發(fā)現(xiàn)GAPDH基因的表達水平隨著鹽堿的濃度而改變；ZHANG等[32]對罌粟（Papaver somniferum）中的研究表明，不同的脅迫處理也影響著看家基因的表達量；CHEN等[33]對狗牙根（Cynodon dactylon）的8個參考基因在不同非生物條件脅迫下的基因表達進行研究得出，在鹽、干旱、冷和熱脅迫下在葉和根中不同的基因表現(xiàn)出差異表達穩(wěn)定性，PP2A和CACS的表達水平在鹽脅迫下的根和葉中、干旱脅迫下的葉中以及冷熱脅迫下的根中的表達水平穩(wěn)定，EF1α和TIP41在干旱脅迫植物的根中表達穩(wěn)定，UPL7、TUB和GAPDH在冷脅迫下在葉片中穩(wěn)定表達，PP2A和TIP41在熱脅迫下的葉片中是穩(wěn)定的。因此，針對不同處理、不同組織部位的植物樣品，在進行不同的qRT-PCR反應(yīng)時應(yīng)選擇與之對應(yīng)的內(nèi)參基因，不應(yīng)一概而論，這也在一定程度上表明了進行表達分析時篩選合適內(nèi)參基因的重要性。

本研究從5個候選基因中篩選出Actin基因的表達的穩(wěn)定性最高，其表達并沒有受到不同脅迫處理的影響，是最適合寧夏枸杞、黑果枸杞qRT-PCR反應(yīng)進行的內(nèi)參基因，保證了后續(xù)試驗結(jié)果的可靠性，也為后續(xù)對相關(guān)基因的表達模式分析以及在鹽脅迫條件下的抗逆機制等方面的研究提供理論指導(dǎo)。