藥用和茶飲絞股藍(lán)中總黃酮及多糖含量分析

盧澤雨，吳芳蕾，韋曉敏，溫秀萍*，于虹敏，林青青，楊成梓，林 羽，2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122)

絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生攀援草本植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的全草，別名七葉膽、小苦藥、公羅鍋底等，生長于山坡林地、路旁灌叢中，主要分布于陜西南部和長江以南各地[1]。性寒,味苦，具有清熱解毒、止咳祛痰之功效。在 《救荒本草》一書中，絞股藍(lán)被廣泛用作蔬菜和食品[2]。明代醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍在《本草綱目》中有關(guān)絞股藍(lán)的功效記載為“治瘡癤，蟲咬，涼血解毒，利小便”[3]。絞股藍(lán)中含有皂苷、黃酮、多糖、氨基酸以及無機(jī)元素等多種成分[4-8]?，F(xiàn)代藥理研究表明，絞股藍(lán)具有多種藥理活性，如降血糖血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟及心血管、抗氧化等[9-15]。因此，絞股藍(lán)也被全國各地茶葉加工企業(yè)成功制成絞股藍(lán)茶等保健品銷往市場，是一味藥茶兼用的常用中藥[16]。

目前關(guān)于絞股藍(lán)化學(xué)成分的研究多停留于其最主要有效成分皂苷上，而對(duì)藥用和茶飲絞股藍(lán)的總黃酮和多糖類成分研究較少。本文以藥用和茶飲絞股藍(lán)作為研究對(duì)象，優(yōu)化絞股藍(lán)總黃酮的提取方法，測定不同產(chǎn)地絞股藍(lán)的總黃酮和多糖含量，把握絞股藍(lán)的市場現(xiàn)狀，以期為絞股藍(lán)的臨床安全有效用藥和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

絞股藍(lán)樣品收集自各產(chǎn)地及藥材市場共14批次藥用絞股藍(lán)和17批次茶飲絞股藍(lán)(表1)，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓教授鑒定為葫蘆科絞股藍(lán)屬植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino。

1.2 試劑與儀器

試劑：D-無水葡萄糖(526H021，北京索萊寶科技有限公司)、蘆丁(B20771，上海源葉生物科技有限公司)；無水乙醇，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉，蒽酮，濃硫酸，均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)制劑試劑有限公司生產(chǎn)。

儀器：UV-9000型紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，XM7D-8222型電熱恒溫干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司)，KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

表1 絞股藍(lán)樣品信息

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 波長選擇 精密吸取一定量的待測樣品溶液、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加蒸餾水至10 mL，再加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再滴加10%硝酸鋁溶液1 mL，輕輕振搖，靜置6 min，最后加入10 mL的4%氫氧化鈉溶液，并加蒸餾水至刻度，搖勻，靜置15 min，顯色后于紫外分光光度計(jì)在400～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，掃描結(jié)果確定絞股藍(lán)中總黃酮最大吸收波長為510 nm。

精密吸取D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液30 mL，置于100 mL量瓶中定容，為標(biāo)準(zhǔn)品母液。再各取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品母液于具塞試管中，冰水浴中分別加入4 mL蒽酮-硫酸溶液(4 ℃冷藏)，加完后置于沸水中煮沸10 min(自水重新沸起)，立即冷卻至室溫，顯色后于紫外分光光度計(jì)在400～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，確定絞股藍(lán)中多糖最大吸收波長為620 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱定蘆丁對(duì)照品0.100 g置于100 mL量瓶中，加60%乙醇置于水浴鍋中，加熱溶解，再加乙醇定容，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品母液(蘆丁含量為1 mg/mL)。精密吸取蘆丁對(duì)照品母液各0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，再加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min，再滴加10%硝酸鋁溶液1 mL，輕輕振搖，靜置6 min，最后加入10 mL的4%氫氧化鈉溶液，并加蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min顯色，以只加顯色劑溶液作為空白對(duì)照，在510 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)[17-18]。以蘆丁對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)X，吸光度A為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=10.781X+0.047 1(R2=0.999 8)，由此可知其在0.02～0.22 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密吸取10、20、30、40、50 mL D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液，100 mL量瓶中定容。冰水浴中分別加入4 mL蒽酮-硫酸溶液(4 ℃冷藏)，加完后置于沸水中煮沸10 min(自水重新沸起)，立即冷卻至室溫，以相應(yīng)空白試劑作為對(duì)照，在620 nm處測定吸光度值。以D-無水葡萄糖對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)X，吸光度A為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程Y=3.195X+0.112(R2=0.994 8)。該方程表明，當(dāng)濃度在0.02～0.10 mg/mL時(shí)，其與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3.3 總黃酮含量測定 樣品粉碎過三號(hào)篩，干燥，稱取5 g，置于錐形瓶中，加入65%乙醇65 mL，超聲90 min，抽濾，濾渣回收，提取4次。將濾液合并濃縮，定容于100 mL量瓶中，搖勻，得總黃酮供試品溶液。精密吸取2 mL總黃酮供試品溶液，放置于25 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法顯色。以相應(yīng)空白試劑作為對(duì)照，在510 nm波長處測定吸光度值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其總黃酮含量[17-18]。

1.3.4 總多糖含量測定 稱定干燥后的絞股藍(lán)樣品粉末約1 g，包裝好后置于索氏提取器內(nèi)，加入適量95%乙醇，多次虹吸至樣品提取液近乎透明，將藥渣小心取出并干燥，再采用水加熱回流提取2次，每次1 h。合并兩次濾液后，將濾液濃縮到100 mL，加入乙醇，使醇含量達(dá)到80%，存放于4 ℃冰箱中靜置12 h。過濾，用水溶解沉淀，溶液全部轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻，即得多糖供試品溶液。精密吸取1 mL多糖供試品溶液，置于試管中，按照“1.3.2”項(xiàng)下多糖方法顯色。以相應(yīng)空白試劑作為對(duì)照，在620 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其多糖含量[19-21]。

1.3.5 單因素試驗(yàn) 分別設(shè)置不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、不同提取時(shí)間、不同提取次數(shù)，探究其對(duì)絞股藍(lán)總黃酮得率的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn) 以單因素實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果作為主要參考依據(jù)，選擇提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)、料液比為考察研究對(duì)象，提取得到的總黃酮含量為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案，稱取9份絞股藍(lán)干燥粉末，每份約5 g，進(jìn)行提取分析。

1.3.7 總黃酮含量方法學(xué)考察 精密度考察。精密吸取“1號(hào)”供試品溶液2 mL，根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下方法操作測定吸光度，于同一環(huán)境下連續(xù)測定6次，測定A值，計(jì)算總黃酮提取量分別為1.410、1.441、1.433、1.423、1.443、1.435 mg/g，RSD為0.9%，說明實(shí)驗(yàn)儀器精密度良好。

穩(wěn)定性考察。精密稱取“1號(hào)”樣品提取液2 mL，根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下方法操作，于10、20、30、40、50、60 min分別測定吸光度，計(jì)算總黃酮提取量分別為1.443、1.440、1.435、1.431、1.421、1.410 mg/g，RSD值為0.9%，實(shí)驗(yàn)顯色60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重現(xiàn)性考察。精密稱取“1號(hào)”樣品粉末6份，每份5 g，根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，測定A值，計(jì)算總黃酮提取量分別為32.8842、31.934 1、31.824 8、32.451 2、32.211 5、32.058 7 mg/g，總黃酮平均提取量為32.227 4 mg/g，RSD值1.3%，說明實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性較好。

加樣回收考察。精密稱取6份已知總黃酮含量的“1號(hào)”樣品0.2 g，均加入一定的蘆丁對(duì)照品。根據(jù)“1.3.3”項(xiàng)下方法并提取、顯色測定其吸光度值，按比例得到回收率為98.14%、101.04%、97.10%、97.50%、99.86%、99.68%，平均回收率為98.89%，RSD值為1.6%。說明該方法具有較好的準(zhǔn)確性，可以作為絞股藍(lán)總黃酮含量的測定方法。

1.3.8 總多糖含量方法學(xué)考察 精密度考察。精密吸取同一份 D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液，按照“1.3.3”項(xiàng)下方法操作，在同一條件下連續(xù)測定6次吸光度，分別為0.289、0.299、0.292、0.305、0.294、0.295，RSD為1.91%，表明該方法精密度良好。

穩(wěn)定性考察。取絞股藍(lán)藥材樣品(1號(hào))，按照“1.3.4”項(xiàng)下方法操作，于30、60、90、120、150 min分別測定吸光度，A值分別為0.385、0.396、0.377、0.390、0.387、0.381，RSD為1.73%，表明絞股藍(lán)多糖溶液在150 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重現(xiàn)性考察。取同一批絞股藍(lán)藥材樣品(1號(hào))6份，按照“1.3.4”項(xiàng)下方法操作，在同一條件下分別測定吸光度，A值分別為0.388、0.381、0.371、0.387、0.390、0.377，RSD為1.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率考察。取已知含量的絞股藍(lán)藥材樣品(1號(hào))6份，按照“1.3.4”項(xiàng)下方法操作，在同一條件下分別測定吸光度，計(jì)算回收率分別為98.95%、100.80%、99.44%、99.30%、99.05%、100.04%，平均回收率為99.60%，RSD為0.71%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010和Graphpad Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

用超聲波提取方法對(duì)總黃酮類化合物成分進(jìn)行了提取，借助于乙醇能夠溶解黃酮類化合物的特性，故將提取溶劑確定為乙醇，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步選擇不同乙醇體積分?jǐn)?shù)[40%、50%、60%、70%、80%、90%(乙醇-蒸餾水)]、不同料液比[1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15(g/mL)]、不同提取時(shí)間(30、60、90、120、150 min)、不同提取次數(shù)(1、2、3、4次)4種影響因素對(duì)絞股藍(lán)總黃酮含量進(jìn)行單因素考察。各因素分析結(jié)果表明，總黃酮含量分別在60%乙醇、提取時(shí)間90 min、提取次數(shù)3次、料液比1∶14(g/mL)時(shí)達(dá)到最大。

2.2 正交試驗(yàn)選取最優(yōu)提取方法

在單因數(shù)試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，其中提取時(shí)間70、90、110 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、60%、65%，提取次數(shù)2、3、4次，料液比1∶13、1∶14、1∶15(g/mL)，其余處理與“2.2.3”項(xiàng)下方法操作相同，提取顯色在510 nm測定A值。正交試驗(yàn)結(jié)果得出最佳提取方法為提取時(shí)間90 min、65%乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)3次、料液比1∶13。最佳提取方法進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平行測定3次，結(jié)果RSD值為1.25%，說明該方法真實(shí)，故確定用此最優(yōu)提取方法對(duì)31批次絞股藍(lán)樣品的總黃酮含量進(jìn)行測定。

2.3 不同產(chǎn)地絞股藍(lán)總黃酮含量分析

根據(jù)供試絞股藍(lán)總黃酮含量測定結(jié)果，不同產(chǎn)地31批次絞股藍(lán)樣品中，總黃酮含量均值為3.62%。絞股藍(lán)不同用途之間的總黃酮含量無顯著性差異(表2)。陜西的樣品無論是藥用還是茶飲絞股藍(lán)的總黃酮含量均高于其他產(chǎn)地的樣品；此外，廣西、吉林和云南的總黃酮含量較高，而安徽的含量較低，見圖1。14批次藥用絞股藍(lán)樣品中，總黃酮含量范圍為2.78%～4.17%，陜西、廣西和云南樣品的總黃酮含量較高，而四川、安徽和福建樣品的含量較低；17批次茶飲絞股藍(lán)樣品中，總黃酮含量范圍為2.51%～5.01%，總黃酮含量均值大于4.0%，從高到低分別來源于陜西、廣西、吉林和云南，且安徽樣品的總黃酮含量均值最低，為2.76%。

表2 藥用和茶飲絞股藍(lán)總黃酮、多糖含量比較

圖1 不同產(chǎn)地絞股藍(lán)的總黃酮含量

2.4 不同產(chǎn)地絞股藍(lán)多糖含量分析

根據(jù)供試絞股藍(lán)多糖含量測定結(jié)果，不同產(chǎn)地31批次絞股藍(lán)樣品中，多糖含量均值為3.43%。絞股藍(lán)不同用途之間的多糖含量無顯著性差異(表4)。陜西的樣品無論是藥用還是茶飲絞股藍(lán)的多糖含量均高于其他產(chǎn)地的樣品；湖南、安徽、云南和吉林樣品中多糖含量較高，而廣西、江西的含量較低，見圖2。14批次藥用絞股藍(lán)樣品中，多糖含量范圍在2.78%～4.19%，陜西樣品的多糖含量均值最高、為4.09%，湖南、安徽、云南和河北樣品的多糖含量較高，而廣西、福建、河南和四川樣品的含量較低；17批次茶飲絞股藍(lán)樣品中，多糖含量范圍在2.97%～4.27%，均值從高到低分別來源于陜西、河南、安徽、云南和吉林,其樣品的多糖含量均值較高，而福建、甘肅、廣西和江西樣品的多糖含量均值較低。

圖2 不同產(chǎn)地絞股藍(lán)的多糖含量

3 討論

3.1 絞股藍(lán)總黃酮和多糖含量分析

31批樣品的總黃酮含量在2.51%～5.01%之間，多糖含量在2.78%～4.27%之間。不同產(chǎn)地之間的含量差異可能與產(chǎn)地之間的環(huán)境氣候不同有關(guān)，無論是茶飲還是藥用，安徽產(chǎn)地的絞股藍(lán)總黃酮含量均較低，而陜西、云南和廣西的含量均較高；多糖含量方面，陜西的含量較高，而廣西的含量較低。故從總黃酮和多糖的含量來看，陜西產(chǎn)地的質(zhì)量略好于其他產(chǎn)地，安徽次之。

藥用絞股藍(lán)總黃酮含量平均為3.52%，茶飲平均為3.71%，可見茶飲絞股藍(lán)的總黃酮含量略高于藥用品；藥用絞股藍(lán)多糖平均含量3.41%，茶飲為3.45%，茶飲略高于藥用。但對(duì)茶用、藥用絞股藍(lán)總黃酮含量和多糖含量分別進(jìn)行方差分析(表2)，藥用和茶飲絞股藍(lán)樣品中總黃酮、多糖含量差異均不顯著(P>0.05)。故茶飲和藥用絞股藍(lán)之間品質(zhì)無明顯差別。

3.2 總黃酮提取工藝優(yōu)化

黃酮和多糖均屬于絞股藍(lán)中的有效成分。黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，查閱文獻(xiàn)可知常見提取試劑即為甲醇、乙醇，而水提法易混入大量雜質(zhì)，導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確[17，22]，因此本實(shí)驗(yàn)采用乙醇作為提取溶劑。總黃酮提取方法較多，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)比較了回流法、索氏提取法、超聲提取法等，結(jié)果表明3種方法提取效率均較高，但考慮到超聲提取法操作簡便、耗時(shí)相對(duì)較短、提取效率高、提取溫度低等優(yōu)點(diǎn)，采用超聲提取絞股藍(lán)中總黃酮[23]。

優(yōu)化的絞股藍(lán)總黃酮的最佳提取工藝為提取時(shí)間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%、提取次數(shù)4次、料液比1∶13。該方法操作簡便、提取完全，工藝可行可靠，適用于絞股藍(lán)中總黃酮含量測定。本次實(shí)驗(yàn)測定了31批絞股藍(lán)的總黃酮和多糖含量，發(fā)現(xiàn)不同用途絞股藍(lán)的總黃酮和多糖含量略有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明藥用和茶用的絞股藍(lán)品質(zhì)相當(dāng)。不同產(chǎn)地絞股藍(lán)的總黃酮和多糖含量有一定差異，陜西產(chǎn)絞股藍(lán)的總黃酮和多糖含量略高于其他產(chǎn)地，分析可能與藥材種植及加工處理方式、產(chǎn)地自然條件等因素有關(guān)。后續(xù)可對(duì)其進(jìn)行深入研究，為制定藥用和茶飲絞股藍(lán)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。