扶正消癭湯對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠的干預(yù)及免疫調(diào)節(jié)作用

喬佳君，張雨陽，石京平，夏仲元

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院中醫(yī)外科，北京 100029）

橋本氏甲狀腺炎（hashimoto's thyroiditis，HT）以抗甲狀腺抗體陽性為臨床主要診斷標準，中國成年人群甲狀腺抗體陽性的患病率為14.19%，位居甲狀腺疾病第2 位［1］。本病易合并甲狀腺功能異常，尤其是引發(fā)甲減的主要原因，同時，自身抗體升高與不孕或女性不良妊娠結(jié)局相關(guān)。其發(fā)病機制尚不清楚，其中自身免疫因素占據(jù)主要因素之一，Th17-Treg 細胞平衡失調(diào)是近年來研究的熱點，而IL-38 作為白介素1 家族成員，可以發(fā)揮抗炎特性，抑制Th17 成熟，調(diào)節(jié)Th17-Treg 平衡［2］?，F(xiàn)有研究表明硒元素的補充如服用硒酵母片能夠降低抗甲狀腺抗體，減輕甲狀腺損害，可作為HT 的輔助療法［3］。筆者認為HT 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵病機為本虛標實，以扶正消癭為主要治療原則［4］，夏仲元教授自擬的扶正消癭湯是常用于HT 臨床治療的經(jīng)驗方。本實驗以扶正消癭湯作為實驗組用藥，通過硒酵母片陽性對照，觀察扶正消癭湯降低EAT 大鼠抗甲狀腺抗體、改善甲狀腺功能和組織病理損傷的作用，以及對IL-38 水平和Th17-Treg 平衡的影響，以期為扶正消癭湯臨床應(yīng)用提供實驗研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

40 只SPF 級雌性6～8 周齡的Sprague-Dawley大鼠，體重160～180 g，購于斯貝福（SCXK（京）2019-0010）；在中日醫(yī)院臨研所SPF 級小動物實驗室（符合國標GB14925-2010）中飼養(yǎng)。

1.2 倫理審查

本實驗已經(jīng)通過中日醫(yī)院實驗動物倫理（編號：zryhyy21-21-03-06）。

1.3 中藥制備

扶正消癭湯組成為：生黃芪20 g、穿山龍15 g、炒白術(shù)15 g、法半夏10 g、夏枯草12 g、當歸10 g、玄參15 g、土貝母15 g、炙甘草3 g 等，生藥材購自國藥集團北京華邈藥業(yè)有限公司及北京美康堂醫(yī)藥科技有限公司，將成人設(shè)為60 kg 后按照6.2 的大鼠與人體重劑量折算系數(shù)折算生藥量，上述中藥飲片，煎煮2 次，濾過后合并，濃縮為生藥量1.715 g/mL的藥液，高溫高壓滅菌后分裝，冷藏保存。

1.4 藥物與試劑

硒酵母片（商品名：西維爾，批號：210204）、豬甲狀腺球蛋白（PTg，天府新區(qū)華陽正龍生化制品研究室，批號：202102）；完全弗氏佐劑（CFA，美國Sigma，批號：SLBW7430）、不完全弗氏佐劑（IFA，美國Sigma，批號：SLCB8702）；碘化鈉（NaI，北京酷來搏科技有限公司，批號：CS30143404）；甲狀腺球蛋白抗體（thyroglobulinantibody，TGAb）、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）、三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、甲狀腺素（thyroxine，T4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）、甲狀腺過氧化物酶抗體（thyroid peroxidaseantibody，TPOAb）、白細胞介素38（interleukin-38，IL-38）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號分別為：20210922-0582、20210922-70747、20210922-20356、20210922-0584、20210922-0573、20210922-20215、20210922-0519、220415-71280R1）；Pacific Blue anti-rat CD45 Antibody （Biolegend，USA，Cat# 202225）；FITC anti-rat CD3 Antibody（Biolegend，USA，Cat# 201403）；CD8 PerCP（Biolegend，USA，Cat# 201712）；PE-Cy7 Mouse Anti-Rat CD4（BD，USA，Cat#561578）；CD25 PE（Thermo Fisher，USA，Cat#12-0390-82）；FOXP3 APC（Thermo Fisher，USA，Cat#17-5773-82）；Rat IgG2a（Thermo Fisher，USA，Cat#12-4321-80/17-4321-81）；IL-17A PE（Thermo Fisher，USA，Cat#12-7177-81）。

1.5 儀器

正置光學(xué)顯微鏡BX-53（Olympus 公司）；酶標分析儀RT-6100（Rayto 公司），；37 ℃、5%CO2孵箱（Thermo Fisher 公司）；流式細胞儀FACS（Becton Dickinson 公司）。

1.6 方法

1.6.1 EAT 大鼠模型的建立 隨機數(shù)字表法取10只SD 大鼠作為空白組，其余大鼠通過給予含0.05% NaI 的高碘飲水，以及弗氏佐劑與PTg 混合免疫注射，分為初次免疫1 周和加強免疫6 周，每次每只大鼠注射含PTg 100 μg，造EAT 模型，成模后隨機平均分為3 組：模型組、硒酵母片組、扶正消癭湯組。具體造模方法參照本課題組前期研究［5，6］?？瞻捉M同時間點則予普通動物飲用水，每次給予PBS 緩沖液0.2 mL 皮下注射。造模后大鼠血清中TGAb、TPOAb 升高，則符合疾病臨床診斷。甲狀腺組織內(nèi)有淋巴細胞和漿細胞的浸潤，膠質(zhì)減少，濾泡縮小，甚至破壞，以及后期出現(xiàn)纖維化改變等符合疾病病理診斷［7］。

1.6.2 分組及給藥 造模成功后，扶正消癭湯組大鼠給予10 mL·kg-1·d-1扶正消癭湯；硒酵母片組給予20.67 μg·kg-1·d-1硒 酵 母 片［按 成 人 劑 量3.33 μg·kg-1·d-1計算］；空白組與模型組大鼠給予10 mL·kg-1·d-1雙蒸水灌胃。測體重根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，療程為2個月，末次給藥后各組大鼠禁食12 h后取材。

1.6.3 檢測指標

1.6.3.1 抗甲狀腺抗體TPOAb、TGAb 檢測 取材當天，各組大鼠禁食禁水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.1 mL/100 g）麻醉，每只大鼠通過腹主動脈采血，收集5 mL 全血，離心（3 000 r/min）10 min 后獲得血清。遵從大鼠TPOAb、TGAb 的ELISA 試劑盒說明書分別檢測TPOAb、TGAb 水平。

1.6.3.2 甲狀腺功能及IL-38 檢測 同上述方法獲得大鼠血清，遵從大鼠T3、FT3、T4、FT4、TSH 和IL-38 的ELISA 試劑盒說明書分別 檢測T3、FT3、T4、FT4、TSH 和IL-38 濃度。

1.6.3.3 組織病理形態(tài)觀察 大鼠甲狀腺取材稱重后用10%的中性福爾馬林溶液固定48 h 后進行石蠟包埋，連續(xù)切片4 μm 厚，予蘇木精和伊紅進行染色，脫水透明后用中性樹膠封片。于電子顯微鏡下觀察大鼠甲狀腺組織，包括上皮細胞和濾泡的大小形態(tài)、淋巴細胞的浸潤程度、間質(zhì)的纖維化程度。光鏡下觀察病理變化分級指數(shù)：正常甲狀腺組織計為0 分；局灶性甲狀腺炎計為1 分；不超過40%的嚴重甲狀腺炎計為2 分；40%到80%的彌漫性甲狀腺炎計為3 分；超過80% 的彌漫性甲狀腺炎計為4 分［8］。

1.6.3.4 Th17 及Treg 流式細胞術(shù)檢測 每組取5只大鼠脾臟，制備脾細胞懸液，用篩子過濾，加入相應(yīng)染色抗體，孵育后上機檢測。其中CD4+IL-17A+用于確定Th17；CD4+CD25+FoxP3+用于確定Treg。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 扶正消癭湯對EAT 大鼠抗甲狀腺抗體的作用

模型組TPOAb 和TGAb 水平顯著高于空白組（P＜0.05），說明模型成功。硒酵母片組與扶正消癭湯組的TPOAb 和TGAb 水平明顯低于模型組（P＜0.05）。但硒酵母片組與扶正消癭湯組之間的TPOAb 和TGAb 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 治療組對EAT 模型大鼠TPOAb 和TGAb 水平的影響（IU/mL,n=10，±s）Tab 1 Effect of the treatment group on TPOAb and TGAb levels of EAT model rats（IU/mL,n=10，±s）

表1 治療組對EAT 模型大鼠TPOAb 和TGAb 水平的影響（IU/mL,n=10，±s）Tab 1 Effect of the treatment group on TPOAb and TGAb levels of EAT model rats（IU/mL,n=10，±s）

注：對比空白組，*P＜0.05；對比模型組，△P＜0.05。

TGAb 130.13±26.69 204.32±34.12*162.34±29.84*△173.98±28.17*△9.966 0.000組別空白組模型組硒酵母片組扶正消癭湯組F P TPOAb 11.20±4.13 22.24±5.19*15.98±3.05*△15.67±4.39*△10.848 0.000

2.2 扶正消癭湯對EAT 大鼠甲狀腺組織病理的影響

空白組甲狀腺濾泡排列緊密且規(guī)則，腔內(nèi)均勻分布著淡紅色膠質(zhì)，上皮細胞呈低柱狀，未見淋巴細胞浸潤。小葉間有薄壁纖維組織間隔，未見纖維化（圖1A）。模型組甲狀腺濾泡排列紊亂、其內(nèi)膠質(zhì)不均勻，部分濾泡破壞，可見大量淋巴細胞浸潤，上皮細胞有的脫落到濾泡腔內(nèi)，小葉間隔略有增寬（圖1B），提示造模成功。硒酵母組濾泡內(nèi)膠質(zhì)含量較正常組少，可見部分濾泡結(jié)構(gòu)破壞，上皮細胞有的脫落到濾泡腔內(nèi)，可見少量淋巴細胞分布，小葉間隔增寬，纖維組織增生，與模型組對比其淋巴細胞浸潤減少（圖1C）。扶正消癭湯組甲狀腺濾泡形態(tài)基本規(guī)則，腔內(nèi)膠質(zhì)分布較均勻，可見散在淋巴細胞，與模型組對比其濾泡破壞和淋巴細胞浸潤均有改善（圖1D）。觀察各組大鼠甲狀腺組織病理分級，發(fā)現(xiàn)與空白組比較，模型組病理分級更高（P＜0.05）。與模型組比較，扶正消癭湯組病理分級降低（P＜0.05）。同時扶正消癭湯組病理分級較硒酵母組更低（P＜0.05）。見表2。

圖1 大鼠甲狀腺組織HE 染色（×200 倍）Fig 1 HE staining of rat thyroid tissue（200×）

表2 治療組對EAT 模型大鼠甲狀腺病理分級的影響（n=10，±s）Tab 2 Effect of the treatment group on thyroid pathological grade in EAT model rats（n=10，±s）

表2 治療組對EAT 模型大鼠甲狀腺病理分級的影響（n=10，±s）Tab 2 Effect of the treatment group on thyroid pathological grade in EAT model rats（n=10，±s）

注：對比空白組，*P＜0.05；對比模型組，△P＜0.05；對比硒酵母組，#P＜0.05。

甲狀腺病理分級0.50±0.55 2.33±0.82*2.33±0.52 1.17±0.98△#14.860 0.002組別空白組模型組硒酵母片組扶正消癭湯組FP

2.3 扶正消癭湯對EAT 大鼠甲狀腺功能的影響

模型組T3、FT3、T4、FT4 水平均高于空白組（P＜0.05）；而兩組TSH 水平比較差異未見統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。硒酵母片組與扶正消癭湯組的T4水平明顯低于模型組（P＜0.05）。但硒酵母片組、扶正消癭湯組分別與模型組之間的T3、FT3、FT4 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 治療組對EAT 模型大鼠甲狀腺功能的影響（n=10，±s）Tab 3 Effect of the treatment group on thyroid function of EAT model rats（n=10，±s）

表3 治療組對EAT 模型大鼠甲狀腺功能的影響（n=10，±s）Tab 3 Effect of the treatment group on thyroid function of EAT model rats（n=10，±s）

注：對比空白組，*P＜0.05；對比模型組，△P＜0.05。

組別空白組模型組硒酵母片組扶正消癭湯組TSH(mU/L)20.37±2.96 26.99±3.79 24.48±7.28 23.20±6.52 7.030 0.071 FP T3(ng/mL)5.78±1.46 10.18±1.91*8.99±2.75*8.06±1.98*7.432 0.001 T4(ng/mL)177.38±72.03 351.98±82.78*232.29±104.34△213.78±81.74△7.454 0.001 FT3(pmol/L)3.64±1.81 10.75±3.74*9.44±2.99*8.45±2.98*9.988 0.000 FT4(pmol/L)20.08±5.90 33.79±8.90*28.03±7.73*31.70±5.86*6.492 0.001

2.4 扶正消癭湯對EAT 模型大鼠IL-38 及Th17-Treg 的影響

與空白組比較，模型組IL-38 水平降低，Th17%升高，Th17/Treg 比值升高（P＜0.05）。硒酵母片組與扶正消癭湯組的IL-38 水平高于模型組（P＜0.05）。用藥干預(yù)的兩組Th17%和Th17/Treg 均低于模型組，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組間Treg%差異比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 治療組對EAT 模型大鼠IL-38 及Th17/Treg 的影響（n=5，±s）Tab 4 Effect of the treatment group on IL-38 and Th17/Treg in rats with EAT model（n=5，±s）

表4 治療組對EAT 模型大鼠IL-38 及Th17/Treg 的影響（n=5，±s）Tab 4 Effect of the treatment group on IL-38 and Th17/Treg in rats with EAT model（n=5，±s）

注：對比空白組，*P＜0.05；對比模型組，△P＜0.05。

Th17/Treg 0.32±0.09 0.63±0.08*0.56±0.20 0.56±0.30 2.453 0.101組別空白組模型組硒酵母片組扶正消癭湯組FP IL-38(pg/mL)143.24±13.07 73.11±15.94*115.49±25.10*△127.07±20.93△12.049 0.000 Th17(%)4.70±1.16 9.46±2.89*6.45±2.84 6.94±3.11 2.817 0.072 Treg(%)13.55±1.48 15.36±0.62 14.63±2.93 15.50±2.52 0.913 0.457

3 討論

Th17 淋巴細胞主要參與誘導(dǎo)趨化因子和炎性細胞因子的表達，發(fā)揮促炎作用，故引起自身免疫?。?］；而Treg 細胞可以通過維持自身免疫耐受和控制自身活化的CD4+T 細胞增殖來抑制自身免疫病的發(fā)展［10］。Th17 細胞作用增強，Treg 細胞功能下降，可使B 淋巴細胞產(chǎn)生大量抗體，抗體依賴性介導(dǎo)的細胞毒作用、補體系統(tǒng)的激活及自然殺傷細胞（NK 細胞）介導(dǎo)的細胞毒作用共同導(dǎo)致淋巴細胞浸潤甲狀腺，使甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)受到破壞，導(dǎo)致HT 的發(fā)生［11］。甲狀腺自身抗體水平與HT 患者抑郁、生活質(zhì)量降低等癥狀相關(guān)，但西醫(yī)治療的主要目的是控制甲狀腺功能異常，恢復(fù)甲狀腺功能后患者仍有癥狀［12］。而中醫(yī)治療近年來大量臨床研究發(fā)現(xiàn)在降低HT 抗甲狀腺抗體、改善臨床癥狀、延緩病情發(fā)展等方面均有較好的臨床療效［13］，現(xiàn)代醫(yī)家多從肝、脾、腎論治，散結(jié)以化瘀、化痰、軟堅為法，本實驗首次以健脾扶正配合化痰消癭為基本大法干預(yù)EAT。已有部分研究證明中藥方劑可調(diào)節(jié)自身免疫性甲狀腺炎Th17-Treg 細胞平衡，如益氣化痰活血方可增強Th1、Th2、Treg 細胞對Th17 細胞的免疫抑制作用［14］，芪蠣消癭湯則可調(diào)控IL-23/IL-17 炎癥軸［15］。此外，陽和湯［16］、消癭合劑［17］、軟堅消癭顆粒［18］等均通過影響IL-6，IL-8，IL-10，IL-17 及TNFα 等相關(guān)細胞因子，調(diào)控影響Th17-Treg 細胞分化的Foxp3 和RORγt 基因表達。

HT 因其甲狀腺腫大為主要臨床癥狀，屬于中醫(yī)“癭病”范疇，《濟生方·癭瘤論治》和《外科正宗·癭瘤門》中均有言癭瘤者因氣凝瘀血痰滯而成。本課題組認為痰-氣-血凝滯于頸前而成癭病，主要源于臟腑功能失調(diào)，而脾為氣血生化之源，“脾氣虛則四肢不用，五臟不安”，故從脾論治是關(guān)鍵，當健脾益氣以扶正治其本?！鞍俨〗杂商底魉睢保±硪蛩貏t以痰為首，凝結(jié)于頸前兩側(cè)，故出現(xiàn)甲狀腺腫大、結(jié)節(jié)，凝滯于周身則出現(xiàn)乏力氣短、畏寒怕冷等癥，故化痰散結(jié)以消癭治其標［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)補中益氣顆粒對改善HT 有良好的療效［5，19］，而扶正消癭湯以補中益氣湯合消瘰丸為底方加減，在健脾的基礎(chǔ)上增強了化痰消癭散結(jié)之功，對于臨床改善HT 患者甲狀腺腫大等臨床癥狀具有更突出的療效［20］。本方以生黃芪為君，黨參、炒白術(shù)為臣，增強黃芪的藥力，共奏補中益氣之功，佐以玄參、生牡蠣、土貝母化痰消癭散結(jié)，陳皮、法半夏理氣行滯，補氣防壅，兼化痰散結(jié)，香附、當歸理氣解郁，養(yǎng)血和營，夏枯草消痰散結(jié)消腫，穿山龍活血除濕通絡(luò)。炙甘草健脾益氣，調(diào)和諸藥為佐使。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究扶正消癭湯組成中黃芪、白術(shù)、黨參、陳皮、夏枯草、生牡蠣、當歸、穿山龍、玄參、土貝母、炙甘草等藥物都具有調(diào)節(jié)免疫作用［21，22］。本研究通過高碘飲水聯(lián)合免疫注射法造模，并通過血清抗體和甲狀腺病理確定造模成功，結(jié)果顯示，扶正消癭湯可以降低EAT 模型大鼠抗甲狀腺抗體水平（包括TPOAb、TGAb），且治療作用與硒酵母片相似。同時該方可以改善病變大鼠甲狀腺組織的淋巴細胞浸潤和濾泡破壞程度，通過病理分級結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)其療效優(yōu)于硒酵母片，表明扶正消癭湯對于HT 患者有積極作用。

此外，本研究通過對EAT 大鼠模型的甲狀腺功能檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)EAT 大鼠成模后T3、T4、FT3、FT4 水平明顯高于空白組，但TSH 水平組間比較并無統(tǒng)計學(xué)差異，處于甲狀腺功能亢進期，相當于HT早期，其甲亢可能源于甲狀腺濾泡受淋巴細胞、漿細胞浸潤破壞后，甲狀腺激素釋放入血所致。唐偉等［23］研究亦發(fā)現(xiàn)EAT 模型組FT3，F(xiàn)T4 均較空白組顯著升高（P＜0.05），而TSH 水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而姚婷［24］、俞靈鶯等［25］研究結(jié)果中EAT 模型組TSH 水平高于空白組（P＜0.05），侯麗萍等［26］研究結(jié)果中EAT 模型組FT3、FT4 和TSH 水平都高于空白組（P＜0.05），亦可能由于外源性甲狀腺球蛋白免疫的造模方式導(dǎo)致的FT3、FT4 水平與TSH水平同方向改變，但由于各文獻中EAT 大鼠的觀察時限均1～3 個月，未跟蹤長期甲狀腺功能的改變，具體原因有待進一步實驗驗證。本研究結(jié)果中扶正消癭湯能夠降低模型大鼠甲狀腺激素T4 水平，但對于FT3、FT4、T3 的降低作用尚無統(tǒng)計學(xué)意義。既往研究發(fā)現(xiàn)臨床上甲狀腺功能亢進患者常表現(xiàn)為心肝火旺證［27］，心肝陰虛證［28］等。以健脾益氣，消癭散結(jié)為主要治法的扶正消癭湯既往主要以甲狀腺功能正常期、甲減期為主，是否能改善臨床HT合并甲亢患者的甲狀腺功能狀態(tài)仍需進一步臨床研究。

研究發(fā)現(xiàn)IL-38 在慢性炎癥性疾病中常表達異常［29］，Xu 等［30］發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，HT 患者的IL-38 濃度降低，本研究亦發(fā)現(xiàn)模型組大鼠IL-38 水平低于空白組（P＜0.05），藥物治療后IL-38 水平升高（P＜0.05）。IL-38 可通過與IL-1 受體1、IL-36 受體和IL-1 受體10 等潛在受體結(jié)合發(fā)揮抗炎作用，其中IL-38 主要功能之一是抑制與Th17 細胞因子相關(guān)的反應(yīng)的誘導(dǎo)［31］。既往文獻顯示HT 患者甲狀腺組織和/或外周血中有異常高水平的Th17 細胞和與Th17 相關(guān)的促炎細胞因子［32］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組Th17%和Th17/Treg 比值均較空白組升高，符合既往研究。硒酵母與扶正消癭湯治療組Th17%和Th17/Treg 比值較模型組降低，但差異尚無統(tǒng)計學(xué)意義。故扶正消癭湯可能通過增加IL-38 水平進而抑制Th17 分化及相關(guān)細胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，改善HT 病情。

綜上所述，本實驗結(jié)果顯示扶正消癭湯可降低EAT 模型大鼠抗甲狀腺抗體水平，修復(fù)和減輕甲狀腺組織濾泡破壞與淋巴細胞浸潤，其可能的作用機制為調(diào)節(jié)IL-38 水平進而抑制Th17 相關(guān)炎癥反應(yīng)，為臨床應(yīng)用本方治療HT 提供了實驗依據(jù)，未來可進一步探究具體作用通路，為從脾論治HT 提供新的靶點和研究方向。

作者貢獻度說明：

喬佳君：負責共同完成實驗、論文書寫、數(shù)據(jù)分析；張雨陽、石京平：負責共同完成實驗及文章核對等工作；夏仲元：負責實驗指導(dǎo)、論文指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。