四種FDA 批準(zhǔn)藥物抑制發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的作用研究

王田田，尹志蕓，鄧雅麗，朱 瓊，周 敏，胡思靖，吳巧麗，靳佳音，張丹娜，劉希佳，蔣柏勇，沈 姝，鄧 菲，史君明

（1.國(guó)家病毒資源庫(kù)，中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，湖北 武漢 430071；2.南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071）

發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）是發(fā)熱伴血小板綜合征（SFTS）的病原體，屬于布尼亞病毒目（Bunyavirales）、白纖病毒科（Phenuiviridae）、班 大 病 毒 屬（Bandavirus）［1，2］。SFTSV 感 染的主要臨床癥狀包括發(fā)熱、胃腸道癥狀、肌痛、局部淋巴結(jié)病、血小板減少、肝酶水平升高等，嚴(yán)重者可發(fā)展為多器官衰竭或死亡，其病死率為13%～30%，被世界衛(wèi)生組織列為十大優(yōu)先傳染病之一［1，3］。目前發(fā)熱伴血小板減少綜合征的臨床治療主要以對(duì)癥支持性治療為主，包括：通過(guò)注射丙種球蛋白沖擊治療法（臨床個(gè)案治療有效）或激素聯(lián)合免疫球蛋白（臨床個(gè)案治療有效）增強(qiáng)機(jī)體免疫力，以及激素沖擊療法（臨床個(gè)案治療有效）、血漿置換（臨床治療有效）等［4-6］。由于針對(duì)SFTS 尚無(wú)有效疫苗和特效藥，特異性抗病毒藥物的研發(fā)成為亟待解決的科學(xué)問題。

SFTSV 的基因組由3 個(gè)單鏈負(fù)義RNA 片段構(gòu)成，分別為大片段（L）、中等片段（M）和小片段（S）。其中L 片段編碼RNA 聚合酶RdRp，M 片段編碼糖蛋白Gn 和Gc，S 片段編碼核蛋白NP 和非結(jié)構(gòu)蛋白NSs［3］。與 大 部 分 負(fù) 鏈RNA 病 毒 轉(zhuǎn) 錄 復(fù) 制 機(jī) 制 類似，SFTSV 基因組UTR 區(qū)存在保守基序，能夠與RdRp 和NP 形 成RNA-蛋 白 復(fù) 合 物（RNP）負(fù) 責(zé)SFTSV 的基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄［7-9］。RNP 是SFTSV 基因復(fù)制轉(zhuǎn)錄最簡(jiǎn)需求，基于這一理論前期筆者成功構(gòu)建了能表達(dá)eGFP 熒光蛋白的SFTSV 微復(fù)制子報(bào)告系統(tǒng)［10］。微復(fù)制子系統(tǒng)通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠有效體現(xiàn)病毒RNA 的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程，啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，通過(guò)讀取報(bào)告基因表達(dá)水平分析病毒RNA 轉(zhuǎn)錄復(fù)制的效率，是研究RNA 病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)制以及篩選特異性靶向RNA 復(fù)制過(guò)程藥物的重要手段［11，12］。

迄今為止，已有研究報(bào)道過(guò)幾種具有對(duì)SFTSV 抗病毒效果的藥物，包括：（1）抗病毒類：廣譜抗病毒藥物利巴韋林（細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效）、干擾素聯(lián)合利巴韋林用藥（細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有效）、血漿置換聯(lián)合利巴韋林（臨床個(gè)案治療有效）、法匹拉韋（動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效）；（2）鈣通道阻滯劑（CCBs）類：鹽酸貝尼地平和硝苯地平（臨床回顧性發(fā)現(xiàn)有效）［4］。這些藥物對(duì)SFTSV 抗病毒作用的發(fā)現(xiàn)均是從“老藥新用”的角度，通過(guò)對(duì)其他病毒具有抗病毒作用的藥物針對(duì)SFTSV 抑制作用進(jìn)行評(píng)估或針對(duì)臨床SFTS 案例給藥記錄進(jìn)行回顧分析而被確定。從FDA 批準(zhǔn)藥物中篩選抗SFTSV 藥物能極大縮短研發(fā)周期、降低研發(fā)成本。本研究利用SFTSV微復(fù)制子系統(tǒng)，對(duì)FDA 批準(zhǔn)的1 430 個(gè)化合物進(jìn)行抗病毒藥物篩選。進(jìn)一步通過(guò)活病毒感染細(xì)胞體系對(duì)篩選獲得的藥物抗SFTSV 效果進(jìn)行評(píng)估，并確定藥物作用的具體階段。本研究的發(fā)現(xiàn)將為微復(fù)制子用于SFTSV 抗病毒藥物研發(fā)提供重要的理論參考，促進(jìn)SFTSV 特效藥的開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒 Vero 細(xì)胞（ATCC no. CCL-81）、HEK293T（ATCC no. CRL-3216），均購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（ATCC），由本實(shí)驗(yàn)室保存；病毒 種 子 液 SFTSV（WCH/97/HN/China/2011 strain；S/M/L GenBank no.：JQ341190，JQ341189，JQ341188）來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所國(guó)家病毒資源庫(kù)。

1.1.2 化合物 Vidofludimus、硝唑尼特、麥考酚酸、嗎替麥考酚酯等1430 個(gè)FDA 批準(zhǔn)化合物，購(gòu)于Selleck 生物科技有限公司，化合物均由二甲基亞砜（DMSO）配制母液，使用時(shí)用含2 % FBS 的DEME 培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

1.1.3 質(zhì)粒和檢測(cè)試劑 SFTSV 微復(fù)制子系統(tǒng)需要 的 質(zhì) 粒 pRF42-SFTSV-MeGFP、pCAGGs-SFTSV-NP、pCAGGs-SFTSV-RdRp 均 由 實(shí) 驗(yàn) 室自行構(gòu)建［13］；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑采用Lipofectamine 3000（ThermoFisher，美國(guó)）；鼠抗SFTSV-NP 多克隆抗體為本實(shí)驗(yàn)室免疫制備［13］。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Vero 細(xì)胞、HEK-293T 細(xì)胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 病毒培養(yǎng) 用T-75 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Vero 細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)量達(dá)到80% 左右棄去舊培養(yǎng)基并加6 mL 含2%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞表面，加入100 μL SFTSV WCH/97/HN/China/2011 毒 株種子液，此時(shí)MOI 約為0.1，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h ，期間每15 min 輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶。孵育完成后補(bǔ)充6 mL 新鮮的含2% FBS 的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，5 d 后收集培養(yǎng)瓶中的上清于4 ℃、3 000 g/min 離心10 min，然后取上清500 μL/管分裝于凍存管并-80℃保存待用。

1.2.3 病毒滴度TCID50（50% 組織培養(yǎng)感染劑量）測(cè)定 將Vero 細(xì)胞稀釋到密度約105/mL 密度用于96 孔板鋪板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待測(cè)滴度的病毒原液用含2 % FBS的DEME 培養(yǎng)基進(jìn)行10 倍梯度稀釋，將病毒從10-1稀釋至10-10，并做3 組重復(fù)，其中從10-3到10-10的病毒稀釋液將用于下一步檢測(cè)。將96 孔板中的舊培養(yǎng)基棄去，每孔加入100 μL 的病毒稀釋液，每個(gè)梯度6 個(gè)復(fù)孔，共做3 組重復(fù)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，隨即通過(guò)免疫熒光檢測(cè)病毒感染孔。通過(guò)觀察記錄每個(gè)病毒稀釋梯度下產(chǎn)生綠色熒光的孔的數(shù)量，若孔中有熒光則記為陽(yáng)性，孔中沒有熒光則記為陰性，以Reed ＆ Muench 法計(jì)算出該病毒液的TCID50。

1.2.4 免疫熒光檢測(cè) 棄去96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中舊培養(yǎng)基，每孔加100 μL 4 % 多聚甲醛，避光固定30 min；用水沖洗3 遍；隨后每孔加入100 μL 0.2% Triton X-100 透化細(xì)胞15 min；用水沖洗3 遍；用PBS配制的含5%牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）封閉液于37 ℃封閉1 h 或4 ℃過(guò)夜封閉，每孔100 μL；棄掉封閉液，每孔加入100 μL 稀釋好的一抗孵育液（抗體1∶2 000 稀釋）37 ℃孵育2 h 或4 ℃過(guò)夜孵育；棄掉一抗稀釋液，用水沖洗3 次；用含1% BSA的PBS 按1∶2 000 稀釋FITC 標(biāo)記的山羊抗兔血清，每孔加入100 μL 二抗稀釋液37 ℃孵育1 h；棄掉二抗稀釋液，用水沖洗3 次后即可使用熒光顯微鏡觀察記錄。

1.2.5 藥物細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）的確定 Vero 細(xì)胞按照細(xì)胞密度約1.0×104個(gè)/孔鋪入96 孔板，每孔100 μL 體積，放入37 ℃培養(yǎng)箱24 h 后待細(xì)胞匯合度達(dá)到90 %左右；棄除舊培養(yǎng)基，將梯度稀釋好的藥物（100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L），按照每孔100 μL 的體積加入到細(xì)胞孔中，每個(gè)藥物梯度做3 個(gè)實(shí)驗(yàn)復(fù)孔，放在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)孵育24 h；將96 孔板從培養(yǎng)箱中取出，按照每孔10 μL 的體系加入CCK-8 試劑，放置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h；最后通過(guò)酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞活性百分比。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活性百分比為縱坐標(biāo)，利用GraphPad Prism 8.0. 軟件繪制細(xì)胞活性的劑量依賴曲線并進(jìn)行回歸，計(jì)算細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）。

1.2.6 微復(fù)制子系統(tǒng)上抗病毒藥物的篩選 按2×105/孔將HEK-293T 細(xì)胞鋪入24 孔板，每孔500 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行下一步 實(shí) 驗(yàn) ；將 pCAGGs-SFTSV-RdRp、pRF42-SFTSV-MeGFP、pCAGGs-SFTSV-NP 3 種質(zhì)粒按照質(zhì)量比2∶1∶1 的比例進(jìn)行混合，參照Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書每孔2 μg 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，37 ℃培養(yǎng)。將藥物母液用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行2 倍梯度稀釋，棄去轉(zhuǎn)染6 h 后細(xì)胞培養(yǎng)板中的舊培養(yǎng)基，每孔中加入200 μL 對(duì)應(yīng)濃度的藥物稀釋液，對(duì)照孔為僅含DMSO（藥物最高濃度時(shí)所加的量）的藥物稀釋液，繼續(xù)培養(yǎng)42 h。隨后用高內(nèi)涵分析儀進(jìn)行eGFP 計(jì)數(shù)，用GraphPad Prism 8.0.1軟件的非線性回歸方法計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度。

1.2.7 活病毒體系上藥物抑制SFTSV 不同感染階段的定量分析 按每孔5×104將Vero 細(xì)胞鋪入24孔板，每孔500 μL 體積，于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)24 h 待用。用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將藥物稀釋成所需濃度，用含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基將病毒稀釋成滴度為1×105pfu/mL，每孔加入500 μL病毒稀釋液感染細(xì)胞，按照如下方式開展藥物抑制實(shí)驗(yàn)（圖1），具體包括：（1）藥物作用于整個(gè)病毒感染階段：感染前1 h 細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入稀釋好的藥物，隨后加入稀釋好的SFTSV 病毒液共孵育1 h 后棄去舊培養(yǎng)基，換新的含有藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（2）藥物作用于病毒感染前：稀釋好的藥物與病毒液共孵育1 h 后感染細(xì)胞，且病毒與細(xì)胞孵育1 h后換上不含藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（3）藥物作用于病毒入侵階段：病毒與藥物同時(shí)加到細(xì)胞培養(yǎng)孔孵育1 h 后棄去舊培養(yǎng)基換上新的不含藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；（4）藥物作用于病毒入侵后階段：病毒感染細(xì)胞1 h 后棄去舊的培養(yǎng)基，隨后換上含有藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)23 h 后，棄掉孔中舊培養(yǎng)基，用無(wú)菌PBS 潤(rùn)洗3 遍，每孔加入400 μL Trizol 作用5 min 后，用移液器吹打混勻并吸取到1.5 mL EP 管中，進(jìn)行后續(xù)的RNA 提取和絕對(duì)定量分析。

圖1 藥物抑制SFTSV 不同感染階段的給藥流程圖Fig 1 Flowchart of drug administration in different stages of SFTSV infection

RT-qPCR 定量檢測(cè)SFTSV 所用引物為HEX染料標(biāo)記的序列：HEX-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ-2，檢測(cè)試劑盒為HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit（諾唯贊，南京，中國(guó)）。

2 結(jié)果

2.1 藥物細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）

使用CCK-8 法檢測(cè)了候選的4 種藥物對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果顯示各作用濃度時(shí)，細(xì)胞活性仍大于80 %，回歸分析顯示各藥物的CC50均＞100 μmol/L（表1）。因而進(jìn)一步在＜100 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)研究藥物對(duì)病毒感染的抑制效果并確定藥物的IC50。

表1 4 種候選藥物的細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（CC50）Tab 1 Median cytotoxic concentration（CC50）of four drug candidates

2.2 微復(fù)制子系統(tǒng)上抗病毒藥物的篩選

通過(guò)高內(nèi)涵掃描分析1 430 個(gè)FDA 批準(zhǔn)藥物對(duì)SFTSV 微復(fù)制子的影響，共篩選出4 種能起顯著抑制作用的藥物，分別為嗎替麥考酚酯、麥考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus。藥物梯度抑制實(shí)驗(yàn)表明隨著藥物濃度的增高，藥物對(duì)SFTSV 的抑制效果逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出強(qiáng)的劑量相關(guān)性（圖2）。計(jì)算分析顯示嗎替麥考酚酯、麥考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus 4 種藥物在微復(fù)制子系統(tǒng)上的半數(shù)抑制濃度分別為0.014、0.627、1.283、0.059 μmol/L。結(jié)合藥物的CC50，各藥物的治療指數(shù)（TI）均＞10，表明這些藥物安全性高（表2）。

圖2 微基因組系統(tǒng)上4 種藥物不同濃度下對(duì)SFTSV 的抑制作用Fig 2 Inhibition of SFTSV by the four drugs at different concentrations on the mini-replicon system

表2 微基因組系統(tǒng)上4 種藥物不同濃度下對(duì)SFTSV 的抑制效果和安全性Tab 2 Inhibitory effect and safety of the four drugs at different concentrations to SFTSV infection

2.3 活病毒體系上4 種藥物抑制SFTSV 不同感染階段的定量分析

為進(jìn)一步確定藥物對(duì)病毒感染的作用階段，本研究在細(xì)胞水平開展了4 種不同的給藥方式：藥物全程作用于SFTSV（entire stage）、藥物作用于SFTSV 感 染 前（virion stability）、藥 物 作 用 于SFTSV 感 染 入 侵 時(shí)（entry stage）、藥 物 作 用 于SFTSV 入侵細(xì)胞后（post-entry）。結(jié)果如圖3 和表2 所示：藥物全程作用于SFTSV 時(shí)，4 種藥物在3 種濃度下對(duì)SFTSV 均有顯著抑制效果；用藥物對(duì)SFTSV 進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，4 種藥物對(duì)SFTSV 增值不起抑制作用；藥物作用于SFTSV 入侵細(xì)胞時(shí)，只有嗎替麥考酚酯在較高濃度下對(duì)SFTSV 有若的抑制效果，其余3 種藥物對(duì)SFTSV 沒有抑制效果（圖3A）；當(dāng)藥物作用于SFTSV 入侵細(xì)胞后階段，4 種藥物對(duì)SFTSV 的增值抑制效果顯著，值得注意的是Vidofludimus 在3 種濃度下對(duì)SFTSV 的抑制效果均達(dá)到99% 以上。綜合結(jié)果表明4 種藥物對(duì)SFTSV的抑制作用主要發(fā)生在SFTSV入侵細(xì)胞后。

圖3 4 種藥物在SFTSV 感染細(xì)胞不同階段的抑制效果Fig 3 Inhibitory effects of the four drugs on SFTSV infected cells at different stages

表3 4 種藥物在SFTSV 感染細(xì)胞不同階段的抑制效果統(tǒng)計(jì)分析（±s）Tab 3 Statistical analysis of the inhibitory effects of the four drugs in different stages of SFTSV infected cells（±s）

表3 4 種藥物在SFTSV 感染細(xì)胞不同階段的抑制效果統(tǒng)計(jì)分析（±s）Tab 3 Statistical analysis of the inhibitory effects of the four drugs in different stages of SFTSV infected cells（±s）

實(shí)驗(yàn)組t/P給藥方式整個(gè)階段入侵前入侵時(shí)入侵后整個(gè)階段入侵前入侵時(shí)入侵后整個(gè)階段藥物對(duì)照組嗎替麥考酚酯麥考酚酸硝唑尼特20 μmol/L 6.535±0.080 8.900±0.050 7.190±0.100 5.870±0.229 6.663±0.276 8.664±0.130 7.326±0.096 5.623±0.136 7.341±0.054 5 μmol/L vs.Vehicle 6.425/0.003 0.7265/0.500 1.876/0.133 3.972/0.057 13.100/0.000 1.463/0.217 0.735/0.503 4.222/0.014 0.598/0.582 10 μmol/L vs.Vehicle 13.83/0.000 2 1.210/0.292 0.350/0.743 4.463/0.047 7.19/0.002 2.046/0.110 0.708/0.518 3.076/0.037 2.397/0.075 20 μmol/L vs.Vehicle 5.034/0.007 5.984/0.004 3.837/0.019 4.971/0.038 5.953/0.004 1.632/0.178 2.739/0.052 4.965/0.008 12.160/0.000入侵前6.686±0.127 7.352/0.002 0.032/0.976 0.332/0.756 Vidofludiums入侵時(shí)入侵后整個(gè)階段入侵前入侵時(shí)入侵后8.467±0.123 8.430±0.058 7.630±0.055 7.367±0.194 8.467±0.123 8.430±0.058 7.630±0.055 7.122±0.269 8.707±0.098 6.736±0.080,n=3 6.814±0.149 6.874±0.182 8.568±0.091 7.141±0.297 7.216±0.175 7.464±0.136 5 μmol/L 6.042±0.125 8.565±0.176 7.357±0.134 6.590±0.015 6.535±0.081 8.580±0.084 7.560±0.077 5.728±0.191 8.629±0.086 6.14±0.011,n=3 6.191±0.292 7.227±0.046 6.294±0.080 7.254±0.086 7.595±0.088 4.980±0.149 10 μmol/L 6.454±0.38 8.539±0.068 7.610±0.013 6.471±0.048 7.113±0.142 8.573±0.038 7.563±0.076 5.743±0.358 8.470±0.011 6.742±0.164,n=3 7.008±0.120 6.800±0.172 5.671±0.133 7.126±0.115 7.433±0.025 4.563±0.096 6.951±0.228 6.261±0.062 5.742±0.250 7.017±0.185 7.647±0.042 4.774±0.013 1.898/0.131 1.878/0.123 18.610/＜0.0001 0.363/0.735 1.926/0.127 12.28/0.000 1.011/0.369 0.293/0.784 17.910/＜0.0001 0.049/0.963 1.220/0.290 17.37/＜0.0001 0.500/0.644 3.185/0.033 10.580/0.001 0.355/0.740 2.381/0.076 19.670/＜0.0001

3 討論

SFTSV 流行范圍不斷擴(kuò)大，除中國(guó)至少15 個(gè)省，韓國(guó)、日本和越南等其他亞洲國(guó)家也陸續(xù)報(bào)道了該病，SFTSV 已嚴(yán)重威脅人類公共健康［14］。研發(fā)有效的抗SFTSV 藥物成為急需解決的科學(xué)問題。本研究通過(guò)微復(fù)制子系統(tǒng)對(duì)FDA 批準(zhǔn)的1 430個(gè)化合物進(jìn)行抗SFTSV 藥物篩選，結(jié)果表明嗎替麥考酚酯、麥考酚酸、硝唑尼特、Vidofludimus 4 種藥物對(duì)SFTSV 具有抑制作用，同時(shí)4 種藥物中硝唑尼特、Vidofludimus 具有較好的劑量依賴性，隨著濃度的升高對(duì)SFTSV 的抑制效果增強(qiáng)?；畈《靖腥炯?xì)胞模型檢測(cè)結(jié)果顯示這4 種藥物均能明顯降低SFTSV 的拷貝數(shù)，能有效抑制活病毒感染；通過(guò)在SFTSV 感染過(guò)程的不同階段給藥，進(jìn)一步確定這4種藥物主要作用于SFTSV 入侵細(xì)胞后的階段，與微復(fù)制子系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果一致。微復(fù)制子系統(tǒng)能夠有效體現(xiàn)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制效率，通過(guò)該系統(tǒng)進(jìn)行藥物篩選更能有效精準(zhǔn)的靶向病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制過(guò)程。因此，利用微復(fù)制子是不涉及活病毒操作篩選抗RNA 病毒藥物的重要且安全的手段。

本研究篩選鑒定的對(duì)SFTSV 具有抑制作用的4 種藥物的臨床應(yīng)用與抗病毒并不相關(guān)。嗎替麥考酚酯［15］和麥考酚酸［16］是一種非競(jìng)爭(zhēng)性、可逆的次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶抑制劑，具有強(qiáng)大的抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用，主要用于移植術(shù)的免疫排斥治療。基于SFTSV 微復(fù)制子系統(tǒng)的測(cè)試結(jié)果顯示嗎替麥考酚酯的IC50值最小，在較低的濃度下對(duì)SFTSV 具有良好的抑制效果，提示嗎替麥考酚酯是一種潛在的有效抗SFTSV 藥物。而這類次黃嘌呤核苷磷酸脫氫酶抑制劑的藥物是否具有抗RNA病毒廣譜性值得深入探究。硝唑尼特是一種人工合成的硝噻柳酸酰胺的衍生物，主要用于抗原蟲、抗腸道寄生蟲［17］，也有一些研究報(bào)道該藥物具有好的抗病毒效果，例如抗犬流感病毒（IC50為0.17～0.21 μmol/L），同時(shí)表現(xiàn)出對(duì)HBV 和HCV 復(fù)制的有效抑制［18］。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示硝唑尼特的抗病毒效應(yīng)可能具有廣譜性。Vidofludimus 是一種口服的二氫乳清酸脫氫酶（dihydroorate dehydrogenase，DHODH）抑制劑，是一種免疫抑制劑。盡管目前幾乎還沒有針對(duì)該化合物用于抗病毒研究的報(bào)道，但該化合物的新一代衍生物Vidofludimus calcium（又被稱為IMU-838）可用于治療一種自身免疫性疾病肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥，并已進(jìn)入二期臨床實(shí)驗(yàn)；該衍生物對(duì)新冠病毒SARS-CoV-2、人巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency type 1，HIV-1）有抑制作用［15，19-21］，提示該藥物可能具有廣譜的抗病毒作用及潛在應(yīng)用價(jià)值。

解析藥物、宿主、病毒之間的復(fù)雜關(guān)系和作用機(jī)制是發(fā)現(xiàn)抗病毒作用新靶點(diǎn)，篩選抗病毒藥物的重要理論基礎(chǔ)。本研究從“老藥新用”的角度，基于微復(fù)制子和病毒感染細(xì)胞模型篩選出具有良好的抗SFTSV 效果的4 種藥物，提示“老藥新用”是快速獲得有效抗病毒藥物的重要手段。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

孫鑫：課題主持人，論文撰寫者，完成主要的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并參與實(shí)驗(yàn)造模取材及指標(biāo)檢測(cè)等相關(guān)工作。王田田、沈姝、鄧菲、史君明：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；王田田、尹志蕓、朱瓊、鄧雅麗：實(shí)驗(yàn)主要實(shí)施；周敏、靳佳音、胡思靖、張丹娜：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)研究涉及細(xì)胞、試劑耗材；劉希佳、蔣柏勇、吳巧麗：抗體制備；王田田：文章執(zhí)筆；沈姝、鄧菲、史君明：文章審閱和修訂。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。

［本文編輯］ 鄒 洲 宋睿璞 朱 昊