兩和輔心飲通過(guò)NRG1-ErbB2 通路對(duì)心肌細(xì)胞損傷的干預(yù)研究

秦 琦,王有雪,左 芳,王東海

心肌梗死(MI)是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)上,因斑塊破裂導(dǎo)致急性血供中斷,造成心肌缺血壞死的一種疾病,是致死率最高的疾病之一,嚴(yán)重威脅人類健康。近年來(lái),該疾病的發(fā)病率急劇上升,而且呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì),造成病人的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降[1]。近年來(lái)在藥物治療缺血性心肌損傷方面有了最新進(jìn)展,神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)/erb-b2 受體酪氨酸激酶(ErbB)2 通路成了國(guó)內(nèi)外最新研究熱點(diǎn),有研究表明,NRG1-ErbB2 通路可以減少心肌細(xì)胞的缺血損傷、凋亡,抑制心肌細(xì)胞增殖及平滑肌過(guò)度增生[2]。Polizzotti 等[3]研究應(yīng)用局部冷凍的方法損傷新生小鼠的心肌細(xì)胞,應(yīng)用NRG1 治療后心肌細(xì)胞功能明顯保留,而且依然保持了心肌細(xì)胞的再生能力。有研究推測(cè)NRG1 療法有可能是通過(guò)刺激新生血管來(lái)保護(hù)心肌免于損傷[4]。而且有研究表明缺氧可以增高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力,并誘導(dǎo)心肌凋亡,而NRG1 療法可以減少其導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷從而保護(hù)心臟[5]。然而大量補(bǔ)充N(xiāo)RG1 存在副作用,如心功能損傷及致癌風(fēng)險(xiǎn)等,因此,合理的劑量及應(yīng)用療程成了目前研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)在冠心病治療上具有安全有效、副作用小等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。前期臨床研究表明,兩和輔心飲具有理氣和血、寧心安神之功效,能有效改善冠心病病人疼痛及活動(dòng)后氣短等臨床癥狀。另外,還發(fā)現(xiàn)部分病人服用兩和輔心飲后復(fù)查心臟彩超梗死面積較前縮小,但具體作用機(jī)制尚不清楚。因此,進(jìn)一步研究其作用機(jī)制是本課題組下一步擬進(jìn)行的工作。結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本研究旨在尋找兩和輔心飲與心肌代謝通路NRG1-ErbB2 的關(guān)系,并探討其對(duì)心肌細(xì)胞損傷的修復(fù)作用,以期為冠心病的治療以及該方劑的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供科研數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與取材

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 3～6 月齡無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)Wistar 雄性大鼠80 只,體質(zhì)量(200±20)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(遼)2018-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5 組:假手術(shù)組(Sham 組)、模型組(MIRI 組)、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組16 只。

1.1.2 動(dòng)物造模方法 參照楊建業(yè)等改進(jìn)的造模方法,制造液氮冷凍大鼠心肌梗死模型[6]。取Wistar 大鼠,按照250 mg/kg 劑量腹腔注射10%水合氯醛,待其麻醉成功后氣管切開(kāi)、插管,應(yīng)用動(dòng)物呼吸機(jī)正壓輔助通氣。胸部去毛,消毒,沿左鎖骨中線縱行切開(kāi)皮膚2～3 cm,分別剝離深淺筋膜,在第4 肋間或第5 肋間鈍性分離肌層,撕開(kāi)心包,用棉簽推開(kāi)胸腺,暴露心臟,在主動(dòng)脈根部約1/3 處找到左冠狀動(dòng)脈,用圓柱形鋼釘頭部(頭直徑0.2 cm)迅速置于該區(qū)域并冷凍約10 s。此時(shí)觀察心電圖動(dòng)態(tài)變化,如發(fā)現(xiàn)兩個(gè)及以上導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST 段上抬＞0.2 mV 且肉眼可見(jiàn)被冷凍的區(qū)域心肌逐漸變灰白,結(jié)霜,繼而呈紅色腫脹,即可判斷手術(shù)成功。術(shù)后常規(guī)應(yīng)用青霉素3 d(每只每天10×104U)以預(yù)防感染,加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)支持1 周。

1.1.3 給藥方案及取材 按“動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”確定低、中、高劑量,折合大鼠生藥量為0.96 g/100 g,1.92 g/100 g,3.84 g/100 g;按10 mL/kg 給藥體積及大鼠體質(zhì)量計(jì)算給藥量,灌胃給藥,假手術(shù)組及模型組給予等量蒸餾水。兩和輔心飲由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院制劑中心提供。每日灌胃給藥2次,連續(xù)給藥21 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食不禁水12 h,予10%水合氯醛麻醉,沿著左鎖骨中線用剪刀剪開(kāi)皮膚,以鈍器分離組織,暴露心臟,取左心室前壁壞死區(qū)及周?chē)男募〗M織,一部分予10%甲醛溶液固定;另一部分心肌組織存于EP 管中,置于-70 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑與耗材 蘇木素-伊紅(HE)染液試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,KGA224);蘇木素染色液(南京建成公司,D005);二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,1330-20-7);中性樹(shù)膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,10004160);磷酸鹽緩沖液(PBS)(KGB5001)、檸檬酸鈉緩沖液(KGB5001)、免疫組化筆(KGSP10)、全蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(KGP113)、預(yù)染蛋白分子量(KGP441)、5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(KGP101)、1 × Tris-甘 氨 酸 蛋 白 電 泳 緩 沖 液(KGP103X)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法檢測(cè)試劑盒,均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;NC膜(USA PALL 66485);TRIzol(美國(guó)Invitrogen 15596-026);氯仿、異丙醇(南京化學(xué)試劑500 mL);70%乙醇[焦碳酸二乙脂(DEPC)處理]、0.1% DEPC Water(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,KGDN4500);cDNA 第一鏈合成試劑盒(日本TaKaRa RR036B);One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(SYBR Green,日本TaKaRa RR086B)。

1.2.2 儀器與設(shè)備 電熱扶風(fēng)干燥箱(上海圣欣科學(xué)儀器有限公司101AS-3);生物熒光顯微鏡(日本Olympus,BX43);臺(tái)式恒溫振蕩器(中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,THZ-312);電泳儀(美國(guó)Bio-rad Power Supplies Basic);Trans-Blot Turbo 全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad,170-4150);凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)SYNGENE G:BOXChemiXR5);臺(tái)式恒溫振蕩器(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司,THZ-312);脫色搖床(江蘇正基儀器有限公司);渦旋振蕩器(海門(mén)其林貝爾,XW-80A);高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Sorvall ST,16R);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) MD Spectramac,M3);pH 計(jì)(美國(guó)OHAUS STARTER,2C);立式壓力鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司,YXQ-LS-50);電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海圣欣科學(xué)儀器股份有限公司,101AS-3);分析天平(德國(guó)Sartorius,BL310/BL21S);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司,SW-CJ-1FD);臺(tái)式低速離心機(jī)(上海醫(yī)療器械有限公司);紫外光度儀(日本SHIMADZU,UV-2450);普通梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國(guó)ABI Veriti 96 well Thermal cycler);熒光定量PCR 循環(huán)儀(美國(guó)ABI Step one plus Real time-PCR system)。

1.3 HE 染色 按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟,水合,將切片用二甲苯浸泡5 min,更換二甲苯后再浸泡5 min;分別于無(wú)水乙醇中浸泡5 min;在95%、85%、70%的乙醇中分別浸泡5 min,PBS 浸洗3 min×3 次;浸入試劑盒中試劑一核染液染缸內(nèi)染色3～5 min,水洗30～60 s;浸入試劑盒中試劑二分色液Ⅰ中約20 s,水洗30～60 s;浸入試劑盒中試劑三分色液Ⅱ中40 s,水洗30～60 s;置于試劑盒中試劑死漿染液中染色2 min,再用試劑五增色液洗去多余染液,洗2 次,濾紙吸干,封片鏡檢。用光學(xué)顯微鏡400 倍視野下觀察心肌組織病理情況。

1.4 Western Blot 檢測(cè) 蛋白提取定量,進(jìn)行SDSPAGE,而后使用半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜,完成后按比例依次加入一抗、二抗進(jìn)行孵育,孵育最佳時(shí)間后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影、拍照并晾干。用掃描儀掃描圖片后結(jié)果進(jìn)行灰度分析(Gel-Pro32 軟件)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR) ①RNA 提取:將心肌組織切碎放入研缽中,加入1 mL 預(yù)冷的TRIzol,研磨至無(wú)明顯的顆粒,將樣品倒入1.5 mL 離心管中,室溫下放置5 min 后;加入氯仿,蓋緊管蓋后,將其上下振蕩約15 s,在室溫下再靜置3 min;然后以1 200 r/min、4 ℃離心15 min;小心吸取上清至空白離心管,并加入等體積的異丙醇,其后再慢慢混勻,常溫靜置約10 min;再次以1 200 r/min、4 ℃離心10 min;去除上清,并沿管壁加入70%乙醇1 mL,搖勻;1 200 r/min、4 ℃離心10 min;在室溫下干燥沉淀5 min,加入無(wú)RNase 水30～50 μL溶解RNA 沉淀,于-70 ℃條件下保存。②cDNA 第一鏈合成(20μL 體系):混勻,2 000 r/min 條件下離心20 s;取0.2 mL PCR 管,加 入 RNA(2 μg)2 μL,5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL,無(wú)核酸酶的雙蒸水至總體積10μL;輕輕混勻后,然后以2 000 r/min 離心20 s,37 ℃保溫15 min,85 ℃保溫5 s,然后置于冰上5 min;立即進(jìn)行下一步的PCR 反應(yīng)。RT-PCR 正式實(shí)驗(yàn):每個(gè)樣本基因做3 個(gè)復(fù)孔,在0.1 mL PCR 管依次加入如下組分:2× RT-PCR Master Mix(SYBR Green)10μL;模板(cDNA 稀釋10 倍)1 μL;引物MIX(F/R 各10 μmol/L)2 μL;0.1% DEPC 水7 μL;Total volume 20μL。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色觀察心肌組織病理變化 Sham 組:心肌細(xì)胞排列整齊,界限清楚,無(wú)變性,未見(jiàn)間質(zhì)充血,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。MIRI 組:心肌細(xì)胞紊亂,界限不清,心肌細(xì)胞腫脹明顯,無(wú)變性,部分間質(zhì)充血,可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量組:心肌細(xì)胞紊亂,界限不清,心肌細(xì)胞腫脹有所減輕,無(wú)變性,部分間質(zhì)充血,可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。中劑量組:心肌細(xì)胞紊亂,界限不清,心肌細(xì)胞腫脹有所減輕,無(wú)變性,部分間質(zhì)充血,可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。高劑量組:心肌細(xì)胞排列整齊,界限清楚,部分心肌細(xì)胞腫脹,無(wú)變性,部分間質(zhì)充血,可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。詳見(jiàn)圖1。可見(jiàn),經(jīng)過(guò)兩和輔心飲治療后,低劑量組、中劑量組、高劑量組心肌細(xì)胞排列逐漸整齊,心肌細(xì)胞腫脹明顯減輕,間質(zhì)充血減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所緩解。

圖1 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果

2.2 各組NRG1、ErbB2 蛋白表達(dá)情況比較 以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,與Sham 組比較,MIRI 組NRG1、ErbB2 蛋白表達(dá)均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);低劑量組、中劑量組、高劑量組NRG1及ErbB2 蛋白表達(dá)隨著藥物濃度的增加而升高,呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。另外,蛋白相對(duì)表達(dá)水平(經(jīng)內(nèi)參GAPDH 校正后以NRG1/GAPDH、ErbB2/GAPDH)灰度分析顯示:與MIRI 組比較,各給藥組NRG1/GAPDH 表達(dá)水平明顯升高,ErbB2/GAPDH 表達(dá)水平也升高,并呈劑量依賴性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見(jiàn)圖2、表1。

圖2 Western Blot 法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞蛋白表達(dá)條帶圖

表1 各組GAPDH 校正值灰度分析(±s)

表1 各組GAPDH 校正值灰度分析(±s)

MIRI 組與Sham 組比較,①P ＜0.05;與MIRI 組比較,②P ＜0.05。

組別 只數(shù) NRG1/GAPDH ErbB2/GAPDH Sham 組 16 0.62±0.03 0.59±0.07 MIRI 組 16 0.22±0.02① 0.10±0.01①低劑量組 16 0.30±0.01② 0.17±0.01②中劑量組 16 0.46±0.01② 0.35±0.01②高劑量組 16 0.52±0.01② 0.43±0.01②

2.3 各組NRG1、ErbB2 mRNA 表達(dá)情況比較 采用RT-PCR 法檢測(cè)各組NRG1、ErbB2 mRNA 表達(dá)情況,與Sham 組相比,MIRI 組NRG1、ErbB2 的mRNA 表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05)。表明隨著心肌缺血缺氧的發(fā)生,NRG1、ErbB2 在心肌中的含量降低。低劑量組、中劑量組、高劑量組NRG1、ErbB2 mRNA 表達(dá)水平較MIRI 組明顯升高(P＜0.05),且劑量越高其mRNA 表達(dá)越接近于Sham 組,呈劑量依賴性。詳見(jiàn)表2。

表2 各組NRG1、ErbB2 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

表2 各組NRG1、ErbB2 mRNA表達(dá)水平比較(±s)

MIRI 組與Sham 組比較,①P ＜0.05;與MIRI 組比較,②P ＜0.05。

組別 只數(shù) NRG1 ErbB2 Sham 組 16 1.00±0.04 1.00±0.06 MIRI 組 16 0.26±0.02① 0.33±0.02①低劑量組 16 0.42±0.02② 0.52±0.01②中劑量組 16 0.70±0.01② 0.74±0.04②高劑量組 16 0.87±0.03② 0.83±0.03②

3 討 論

冠心病以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)病理改變,其發(fā)生發(fā)展機(jī)制與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞損傷等相關(guān)。NRG1 作為表皮生長(zhǎng)因子家族成員之一,在心血管系統(tǒng)含量最多[6-7],通過(guò)激活ErbB2 參與心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖,具有維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的重要作用[8]。NRG1 可激活多重下游信號(hào)通路,進(jìn)而維持心肌細(xì)胞的正常功能[9]。酪氨酸激酶受體(ErbBs)分為4 個(gè)亞型,其中,分布在心肌細(xì)胞的為ErbB2、ErbB4。ErbB2 作為表皮生長(zhǎng)因子家族中的一員,有研究發(fā)現(xiàn)在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞類型中表達(dá),據(jù)報(bào)道,其出現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化性損傷處,且由配體受體相互作用被激活后參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的多條信號(hào)通路[10-11]。有研究表明,NRG1-ErbB2 通路在心力衰竭心臟修復(fù)及心肌再生中起到了很重要的調(diào)節(jié)作用[12]。還有研究顯示,冠心病急性心肌梗死導(dǎo)致心肌肥厚,通過(guò)補(bǔ)充重組NRG1 可改善其癥狀及心肌細(xì)胞存活,表明NRG1-ErbB2 信號(hào)通路參與心肌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖并對(duì)維持心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮重要作用[13-14]。因此,研究中藥湯劑對(duì)該通路的影響可能提示該藥對(duì)心肌細(xì)胞損傷有修復(fù)作用。目前國(guó)內(nèi)研究中藥對(duì)此通路干預(yù)的文獻(xiàn)較少,具有很好的研究?jī)r(jià)值。冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”范疇,“陽(yáng)微陰弦”是對(duì)“胸痹”“心痛”病機(jī)的高度概括,“陽(yáng)微”意指上焦陽(yáng)氣不足,“陰弦”指下焦陰寒氣盛,由于上焦陽(yáng)氣不振,陰寒之邪乘虛而犯,痹阻胸陽(yáng),胸陽(yáng)失展,則發(fā)胸痹而痛,乃本虛標(biāo)實(shí)之證。胸痹心痛虛多實(shí)少,乃“心氣不足,營(yíng)氣不周”,根據(jù)“損其心者,調(diào)其營(yíng)衛(wèi)”的原則,以補(bǔ)為本,以通為用。本研究選用具有益氣活血通絡(luò)功效的兩和輔心飲,由黨參、丹參、雞血藤、郁金、石菖蒲、沒(méi)藥、香附、遠(yuǎn)志、茯神、砂仁、檀香、三七組成。方中以黨參一味為君藥,大補(bǔ)心氣;丹參、雞血藤為臣藥,養(yǎng)血活血;三七為佐藥,化瘀止痛;遠(yuǎn)志、菖蒲、香附子、茯神4 味為使藥,化痰開(kāi)竅、調(diào)氣安神,這4 味藥又暗合《千金要方》定志丸、《雜病源流犀燭》交感丹在內(nèi),共同交通心腎,定志寧心。雞血藤為養(yǎng)血活血藥,郁金活血而不傷正氣,石菖蒲具有止痛、運(yùn)中、強(qiáng)心作用,本方目的是“助心氣”,意在以補(bǔ)心氣則推動(dòng)血行,合丹參飲活血化瘀,行氣止痛,血行通暢,則痰瘀可化解于無(wú)形?，F(xiàn)代藥理研究表明,作為黨參主要成分之一的黨參蒼術(shù)內(nèi)脂Ⅲ具有明顯的抗炎作用[15]。另外,丹參還能夠擴(kuò)張動(dòng)脈,尤其是對(duì)于冠狀動(dòng)脈和肢體動(dòng)脈,擴(kuò)張作用顯著[16]。

本課題組前期臨床研究表明該方能明顯減少梗死后心絞痛病人的發(fā)作次數(shù),但該方的作用機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)兩和輔心飲治療后,大鼠心肌細(xì)胞排列逐漸整齊,心肌細(xì)胞的腫脹程度明顯減輕,間質(zhì)充血減輕,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所緩解,體現(xiàn)其對(duì)心肌細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。應(yīng)用兩和輔心飲能明顯提高大鼠心肌細(xì)胞NRG1-ErbB2 的蛋白表達(dá),并呈劑量依賴性;另外RT-PCR 結(jié)果也表明,應(yīng)用兩和輔心飲后,NRG1-ErbB2 的mRNA 表達(dá)上調(diào)。提示兩和輔心飲對(duì)該通路的表達(dá)確實(shí)存在上調(diào)作用。因此,推斷兩和輔心飲可以通過(guò)上調(diào)NRG1-ErbB2 通路改善心肌細(xì)胞損傷。另外,該方是否對(duì)心肌損傷的其他機(jī)制存在影響,需要進(jìn)行下一步研究。

綜上所述,兩和輔心飲可以上調(diào)NRG1-ErbB2 代謝通路,并推斷其修復(fù)心肌細(xì)胞損傷作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)該通路實(shí)現(xiàn)的。