紅曲橙色素與紅曲黃色素定量分析方法改進(jìn)

楊曼紅，郭佳，楊露，朱效珍，王晶，陳勉華

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

紅曲是由紅曲菌在大米等基質(zhì)上經(jīng)過固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵形成的，因富含色澤深紅的紅曲色素成分而得名[1]。將固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵的紅曲進(jìn)行色素的提取和噴霧干燥之后得到的紅曲色素稱之為紅曲紅，將在大米基質(zhì)上經(jīng)過固態(tài)發(fā)酵得到的紅曲產(chǎn)品稱之為紅曲米。紅曲色素在中國有上千年的食用歷史，被廣泛應(yīng)用于以火腿為代表的肉制品著色和以紅腐乳為代表的發(fā)酵豆制品著色[2-3]。食品著色用紅曲中的色素成分復(fù)雜，文獻(xiàn)報(bào)道已完成結(jié)構(gòu)解析的紅曲色素超過60種，其中較為常見的紅曲色素主要為橙色的紅斑紅曲素（rubropunctatin，O1） 和紅曲玉紅素（monascorubrin，O2）；黃色的紅曲素（monascin，Y1）和安卡紅曲黃素（ankaflavin，Y2）；紅色的紅斑紅曲胺（rubropunctamine，R1）和紅曲玉紅胺（monascorubramine，R2）[4]。

紅曲色素種類多樣，根據(jù)顏色可大致分為紅、橙、黃三大類[5]。紅曲橙色素O1和O2是紅曲色素中最常見且含量很高的兩種橙色素，紅曲橙色素可通過還原反應(yīng)生成紅曲黃色素，也可與氨基酸或其他含氮化合物發(fā)生胺化反應(yīng)生成紅色素[6-7]。研究表明Y1和Y2兩種紅曲黃色素具有明確的抗炎活性[8-9]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Y1和Y2具有減肥、降血脂、降血糖和改善動(dòng)脈粥樣硬化病變的功效[10-11]。雖然紅曲色素包含多種色素成分，但目前紅色調(diào)在食品著色方面應(yīng)用最廣。GB 1886.19—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲米》和GB 1886.181—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲紅》關(guān)于紅曲米和紅曲紅的標(biāo)準(zhǔn)均傾向于將紅曲紅色素作為主要測定指標(biāo)：采用70%乙醇作為提取溶劑最適合紅曲紅色素的提取，紅曲米和紅曲紅的檢測波長分別為505 nm和（495±10）nm，接近于多種紅曲紅色素的最大吸收波長。GB 1886.66—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲黃色素》中有關(guān)紅曲黃色素的描述是以紅曲米為原料，經(jīng)堿液洗脫，分離制得紅曲紅（或直接以紅曲紅為原料），經(jīng)硫化物磺化、干燥制成的紅曲黃色素。這種紅曲黃色素為化學(xué)改性色素，易溶于水，最大吸收波長（476±10）nm。

紅曲米中的色素成分復(fù)雜，目前對于紅曲米中紅曲色素的提取方面應(yīng)用比較廣泛的是有機(jī)溶劑浸提法，常用的有機(jī)溶劑為乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇等。提取溶劑的選擇和提取方法的優(yōu)化是準(zhǔn)確定量分析的重要前提[12]。超聲波、微波等輔助提取方式，既可節(jié)約溶劑，又可同時(shí)避免溫度升高影響目標(biāo)提取物的穩(wěn)定性[13]。目前對于紅曲色素的定量分析普遍采用分光光度法，通過測定400 nm～410 nm、460 nm～470 nm和500 nm～510 nm波長范圍的色價(jià)，分別代表黃、橙、紅三大類色素的含量[14]。其他分析方法還包括薄層色譜法、高效液相色譜法以及液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等[15-16]。

本研究以紅曲紅色素色價(jià)定量分析普遍采用的70%乙醇提取溶劑為參比，通過分光光度法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和硅膠柱層析法，綜合比較不同提取溶劑對紅曲米中紅曲橙色素和紅曲黃色素的提取率，在此基礎(chǔ)上，建立了紅曲橙色素和紅曲黃色素快速準(zhǔn)確的高效液相色譜定量分析方法，可為富含天然紅曲橙色素和紅曲黃色素新產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

古田紅曲米：市售；6種色素標(biāo)準(zhǔn)品（R1、R2、Y1、Y2、O1、O2）：天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)實(shí)驗(yàn)室分離制備；甲醇、乙醇、石油醚（petroleum ether，PE）、乙酸乙酯（ethyl acetate，EA）、二氯甲烷（dichloromethane，DCM）（均為分析純）：天津市江天化工技術(shù)股份有限公司；乙腈、甲酸（色譜級）：天津市康科德科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（Agilent 1260）、紫外可見分光光度計(jì)（Agilent 8453）：安捷倫科技有限公司；離心機(jī)（TDZ5-WS）：湘儀離心機(jī)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（DGG-107-2BS）：天津天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲色素的提取

將紅曲米打磨成粉末狀，準(zhǔn)確稱取5 g紅曲米粉，按照料液比1∶20（g/mL）分別加入100 mL的70%乙醇、無水乙醇、70%甲醇、無水甲醇、石油醚∶乙酸乙酯（體積比 2∶1）、石油醚∶二氯甲烷（體積比 2∶1）、二氯甲烷 7種溶劑，超聲輔助提取1 h，3 500 r/min離心10 min，隨后吸取上清液200 μL用于檢測色價(jià)及紅曲色素含量，并將剩余上清液于60℃烘干至恒重得到紅曲色素粗提物。

1.3.2 色價(jià)的檢測

用移液器準(zhǔn)確吸取上清提取液，加入對應(yīng)的70%乙醇、無水乙醇、70%甲醇、無水甲醇、石油醚∶乙酸乙酯（體積比 2∶1）、石油醚∶二氯甲烷（體積比 2∶1）、二氯甲烷7種提取溶劑進(jìn)行適當(dāng)稀釋，用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度使其OD值控制在0.2～0.8之間，并以對應(yīng)的提取溶劑做空白對照，設(shè)定385 nm（代表黃色素）、470 nm（代表橙色素）、505 nm（代表紅色素）作為色價(jià)檢測波長。色價(jià)計(jì)算公式如下。

式中：S為色價(jià)，U/g；A為稀釋后的吸光度；V為樣品提取液的體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；n為提取液的稀釋倍數(shù)。

1.3.3 高效液相色譜法定量分析紅曲色素成分

用移液槍準(zhǔn)確吸取100 μL待檢提取液，揮干溶劑，加入乙腈復(fù)溶后進(jìn)行適當(dāng)稀釋。用0.22 μm有機(jī)濾膜將復(fù)溶后的提取液過濾，收集于進(jìn)樣瓶中待檢。

色譜柱：COSMOSIL Cholester（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A（0.1%甲酸水）和B（乙腈）。二極管陣列檢測器；檢測波長：410 nm；柱溫：（25.0±0.8）℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。采用梯度洗脫，洗脫程序如表1所示。

表1 紅曲色素高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution of HPLC for separation of Monascus pigments

色素混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取6種色素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC檢測純度>95%）各5 mg于樣品瓶中，加入1 mL乙腈充分溶解，從6個(gè)樣品瓶中各吸取100 μL加入一個(gè)新樣品瓶中，再加入400μL乙腈即得500μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL，依次稀釋得到6種色素混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為 100 、50 、25 、10 μg/mL。經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)樣20 μL檢測。以標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到6種色素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)及其線性范圍。R1：y=42.96x-302，R2=0.999；R2：y=14.99x-138，R2=0.999；Y1：y=35.59x+68.10，R2=0.998；Y2：y=27.92x+64.74，R2=0.999；O1：y=43.15x+47.86，R2=0.997；O2：y=44.77x+17.32，R2=0.999。6 種紅曲色素在 10 μg/mL～500 μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.3.4 硅膠柱層析分離富集不同色素組分

樣品預(yù)處理：將5 g原料紅曲米提取得到的全部或部分紅曲色素粗提物加入二氯甲烷進(jìn)行溶解，隨后加入相同質(zhì)量的硅膠，55℃烘干至粉末狀備用。

裝柱：預(yù)處理樣品與柱層析硅膠按照1∶50（g/g）的比例，采用干法裝柱，加入少許石油醚使硅膠完全被浸沒，平衡30 min后用氣囊加壓壓平硅膠表面。打開層析柱下方端口將內(nèi)部溶液排出，隨后裝入預(yù)處理樣品。依次使用二氯甲烷、甲醇洗脫色素樣品，樣品各組分在洗脫液的作用下被依次洗脫，分別收集目標(biāo)色層的色素洗脫液，旋蒸烘干后得到目標(biāo)色素提取物，并測定其質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲色素色價(jià)檢測結(jié)果

利用紫外可見分光光度法評價(jià)不同提取溶劑對紅曲色素色價(jià)的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取溶劑對紅曲色素色價(jià)的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on color value of Monascus pigments

由圖1可知，70%乙醇提取液總色價(jià)為11 393 U/g（其中黃色素5 124 U/g，橙色素2 526 U/g，紅色素3 743 U/g），是無水乙醇提取液總色價(jià)的55%；70%甲醇提取液總色價(jià)為9 026 U/g（其中黃色素3 440 U/g，橙色素2 881 U/g，紅色素2 705 U/g），是無水甲醇提取液總色價(jià)的51%。以70%乙醇提取溶劑為參比，極性降低的無水乙醇大幅提高紅曲色素的總色價(jià)，但更低極性的石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合溶劑或單一溶劑提取物的紅曲色素的紅曲色素總色價(jià)均明顯低于無水乙醇溶劑提取物的紅曲色素的總色價(jià)。由于紅曲色素粗提物組分復(fù)雜，紅、橙、黃三類色素在較寬的波長范圍內(nèi)均存在很強(qiáng)的吸收。采用分光光度法，用特定波長下的吸光度分別代表不同色素含量的分析方法，必然會干擾三類色素的準(zhǔn)確定量。因此，準(zhǔn)確評價(jià)不同提取溶劑對紅曲橙色素與紅曲黃色素的提取量的影響，需要進(jìn)一步的HPLC定量分析。

2.2 高效液相色譜法定量檢測結(jié)果

6種常見天然紅曲色素分子信息和對應(yīng)的HPLC保留時(shí)間如表2所示。采用HPLC法定量分析比較不同提取溶劑得到的紅、橙、黃三類紅曲色素的峰面積，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同提取溶劑紅曲色素峰面積的比較Fig.2 Comparison of peak area of Monascus pigments extracted with different solvents

表2 6種紅曲色素的分子信息和高效液相色譜保留時(shí)間Table 2 Molecular information and retention time of six Monascus pigments by HPLC

比較分光光度法（圖1）和HPLC法（圖2）評價(jià)不同溶劑對紅曲米中的紅曲色素提取量影響的結(jié)果差異明顯：分光光度法測得無水乙醇提取液的紅曲橙色素的色價(jià)最高；而HPLC法測得使用PE∶EA（體積比2∶1）、PE∶DCM（體積比 2∶1）和 DCM 進(jìn)行提取，得到的紅曲橙色素O1和O2的峰面積約為無水乙醇提取液的 2 倍，同時(shí) PE∶EA（體積比 2∶1）和 PE∶DCM（體積比2∶1）這兩組提取溶劑提取得到的紅曲紅色素R1和R2的峰面積大幅度下降，且各種提取溶劑對紅曲黃色素提取量的影響不明顯。

紅曲橙色素 O1、O2及紅曲紅色素 R1、R2在470 nm和505 nm均有較大色譜吸收，如果僅以470 nm代表紅曲橙色素，以505 nm代表紅曲紅色素進(jìn)行色價(jià)測定，當(dāng)紅曲色素粗提液中包含豐富的紅曲橙色素和紅曲紅色素時(shí)，由于兩類紅曲色素具有重疊的吸收光譜區(qū)域，色價(jià)定量的方法誤差較大。經(jīng)HPLC定量分析可知，以乙醇為提取溶劑紅曲橙色素提取量遠(yuǎn)低于石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合或單一溶劑提取。這可能與乙醇能夠萃取得到更多種類紅曲紅色素有關(guān)。多數(shù)已知結(jié)構(gòu)的紅曲紅色素與R1、R2具有相似的特征吸收光譜，大量未被HPLC檢測到的多種紅曲紅色素在470 nm也有較強(qiáng)的色譜吸收，導(dǎo)致無水乙醇提取的紅曲橙色素色價(jià)雖然最高，但與HPLC定量分析測得的紅曲橙色素O1和O2峰面積不高的結(jié)果矛盾。相關(guān)研究[17-18]發(fā)現(xiàn)，O1和O2在甲醇溶液中不穩(wěn)定，可與甲醇反應(yīng)生成具有黃色熒光的兩種新的紅曲橙色素monasphilol-methoxy A和monasphilol-methoxy B，該研究使用HPLC分析了二氯甲烷、乙腈等6種有機(jī)溶劑對紅曲橙色素O1和O2提取率的影響，結(jié)果表明二氯甲烷對O1和O2的提取率較高，與本研究結(jié)果一致。

不同提取溶劑提取紅曲色素的HPLC色譜圖與光譜圖如圖3所示。

圖3 不同提取溶劑提取紅曲色素的HPLC色譜圖與光譜圖Fig.3 HPLC profiles and spectrograms of Monascus pigments extracted with different solvents

采用方法1.3.3的HPLC檢測方法使紅、橙、黃三類6種色素均獲得了很好的分離度。圖3所示的紅曲色素的光譜圖顯示：紅曲紅色素R1、R2的較大吸收波長分別為 302、415、525 nm；紅曲黃色素 Y1、Y2的較大吸收波長為230 nm和390 nm；紅曲橙色素O1、O2在472 nm處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道的紅曲色素的吸收波長一致[19-20]。SN/T 3843—2014《出口食品中紅曲色素的測定》采用高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用方法檢測R2、Y1、Y2以及O2共4種色素，檢測波長為230 nm，柱溫為30℃；GB 5009.150—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紅曲色素的測定》推薦無水乙醇或80%乙醇為提取溶劑，規(guī)定了食品中R2、Y1和O2 3種色素的高效液相色譜測定方法，R2的檢測波長為264 nm，Y1和O2的檢測波長為390 nm，柱溫40℃。本研究以石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷混合或單一溶劑優(yōu)化的提取溶劑可大幅度提高紅曲橙色素的得率。本研究采用優(yōu)化后的梯度洗脫方案，選取紅、橙、黃三類色素均有較強(qiáng)吸收的410 nm為檢測波長，柱溫25℃，實(shí)現(xiàn)了30 min內(nèi)同時(shí)完成6種紅曲色素的快速定量檢測。

圖3顯示，70%乙醇提取液色調(diào)偏紅，DCM提取液顏色為橙黃色，PE∶EA（體積比 2∶1）、PE∶DCM（體積比2∶1）提取液偏黃色，說明70%乙醇提取液紅色素組分高于其他3種提取溶劑。優(yōu)化提取溶劑一方面要考慮盡可能提高目標(biāo)紅曲色素的提取率，同時(shí)降低非目標(biāo)色素的提取率，降低樣品前處理難度，減輕復(fù)雜的生物雜質(zhì)對色譜柱的污染。DCM、PE∶EA（體積比 2∶1）、PE∶DCM（體積比2∶1）3組提取溶劑獲得的紅曲橙色素O1和O2峰面積相近，但DCM提取得到的紅曲紅色素R1和R2峰面積明顯高于另外2組提取溶劑。

2.3 硅膠柱層析法分離富集不同紅曲色素組分

紅曲色素粗提物裝入硅膠柱后，二氯甲烷洗脫液首先洗脫出紅曲橙色素與紅曲黃色素組分，然后使用甲醇洗脫液將紅曲紅色素組分洗脫出來。分別收集二氯甲烷與甲醇洗脫液，旋干洗脫液后分別稱重，結(jié)果如表3所示。

表3 柱層析分離紅曲色素粗提物組分Table 3 Separation of crude extract of Monascus pigments by column chromatography

5 g紅曲米樣品使用70%乙醇提取獲得的紅曲色素粗提物質(zhì)量為1 156 mg，取其中731 mg的紅曲色素粗提物進(jìn)行硅膠柱層析分離，由表3可知，70%乙醇所提紅曲粗提物中紅曲橙色素與紅曲黃色素組分質(zhì)量是最低的，紅曲紅色素組分最高。說明70%乙醇對紅曲米進(jìn)行提取時(shí)，對種類復(fù)雜的醇溶性紅曲紅色素的提取率最高，對紅曲橙色素與紅曲黃色素的提取率最低，該方法不適合對紅曲橙色素與紅曲黃色素進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。DCM、PE∶DCM（體積比 2∶1）、PE∶EA（體積比2∶1）提取的紅曲色素粗提物經(jīng)硅膠柱層析分離得到的紅曲橙色素與紅曲黃色素組分占比是用70%乙醇提取時(shí)的3倍左右，而紅曲紅色素組分明顯下降。DCM、PE∶EA（體積比 2∶1）與 PE∶DCM（體積比 2∶1）提取溶劑均可明顯提高紅曲橙色素與紅曲黃色素提取率，且后兩種提取溶劑得到的紅曲紅色素組分質(zhì)量更低，與圖 3 中 DCM、PE∶DCM=2∶1（體積比 2∶1）與 PE∶EA=2∶1（體積比2∶1）提取溶劑所提樣品色調(diào)分別呈現(xiàn)偏紅和偏黃的現(xiàn)象吻合，且 PE∶DCM（體積比 2∶1）與 PE∶EA（體積比2∶1）所提紅曲色素粗提物質(zhì)量較低，而紅曲色素粗提物中紅曲橙色素與紅曲黃色素組分占比較高說明非目標(biāo)色素雜質(zhì)的提取量較低。因此，選擇PE∶DCM（體積比 2∶1）與 PE∶EA（體積比 2∶1）進(jìn)行紅曲橙色素和紅曲黃色素的定量分析，不僅可以明顯提高紅曲橙色素、紅曲黃色素的提取率，還可大幅度減少以紅曲紅色素為代表的非目標(biāo)檢測物質(zhì)的提取率，更有益于準(zhǔn)確和快速地定量分析紅曲橙色素與紅曲黃色素的含量。

3 結(jié)論

本研究以70%乙醇提取溶劑為參比，探究不同提取溶劑對紅曲橙色素和紅曲黃色素提取效果的影響，通過分光光度法、高效液相色譜和柱層析分析，優(yōu)化了提高紅曲橙色素和紅曲黃色素得率的提取溶劑。結(jié)果表明 PE∶EA=2∶1（體積比 2∶1）、PE∶DCM（體積比 2∶1）和DCM這3種提取溶劑顯著提高了紅曲橙色素的提取得率。PE∶EA（體積比 2∶1）與 PE∶DCM（體積比 2∶1）兩組溶劑的提取可大幅度減少紅曲紅色素組分等非目標(biāo)檢測物的提取率。建立了30 min內(nèi)快速定量分析紅曲橙色素和紅曲黃色素的HPLC檢測方法，且6種紅曲色素在10 μg/mL～500 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。這可為開發(fā)富含天然紅曲橙色素和紅曲黃色素的新產(chǎn)品提供可靠的技術(shù)平臺，為紅曲橙色素與紅曲黃色素的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。