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    牡蠣酶解液對2型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)的作用及其機制研究*

    2022-12-17 08:07:56王小艷王慶苗周懷霞
    關(guān)鍵詞:解液牡蠣創(chuàng)面

    王小艷,王慶苗,周懷霞

    (1.慶陽市中醫(yī)醫(yī)院 內(nèi)分泌科,甘肅 慶陽 745000;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)內(nèi)科教研室,甘肅 蘭州 730000)

    2 型糖尿病是臨床常見內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,90%糖尿病為該類型。隨著我國人口老齡化進程加劇,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。糖尿病創(chuàng)傷愈合障礙是2 型糖尿病患者嚴重并發(fā)癥之一,通常由微小組織創(chuàng)傷引發(fā)炎癥所導(dǎo)致。有數(shù)據(jù)顯示,約20% 2 型糖尿病患者會出現(xiàn)非治愈性糖尿病足潰瘍,嚴重情況下誘發(fā)感染、壞疽甚至截肢,給患者心理及生理健康帶來嚴重影響[2]。目前,臨床仍缺乏安全、有效、能促進2 型糖尿病患者組織損傷修復(fù)的治療方法。因此探究安全有效的藥物促進2 型糖尿病患者組織損傷修復(fù)是臨床亟待解決的問題之一[3]。

    皮膚創(chuàng)傷主要采用自體皮膚移植、縫合及使用抗生素治療,但易造成增生性瘢痕。采用酶水解方式從蛋白質(zhì)中獲得的部分活性肽在皮膚組織創(chuàng)傷愈合方面具有較高應(yīng)用價值。牡蠣是一種營養(yǎng)豐富、含有多種蛋白質(zhì)的海洋生物資源之一,具有抗氧化、抑菌等功能[4]。既往研究顯示,牡蠣酶解產(chǎn)物對皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合具有促進作用,但具體機制尚未明確[5]。劉好[6]研究顯示,基質(zhì)細胞衍生因子1(stromal cell derived factor 1,SDF-1)/趨化因子受體4(chemokine receptor 4,CXCR-4)通路活化對糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)具有一定的促進作用。目前有關(guān)牡蠣酶解產(chǎn)物對2 型糖尿病皮膚組織創(chuàng)傷愈合的作用及其機制研究少見報道,因此本研究探究其對2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)的作用,并分析其對SDF-1/CXCR-4 通路的影響,以期為臨床開發(fā)促進2 型糖尿病組織損傷修復(fù)的藥物提供一定理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 動物來源

    50 只無特定病原體級4 周齡雄性小鼠,體重20~30 g,平均(25±5)g,購自北京唯尚立德生物科技有限公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0009,實驗動物使用許可證號:SYXK(京)2021-0257。

    1.2 主要試劑與儀器

    1.2.1 主要試劑牡蠣肉(蘭州沃特萊斯生物科技有限公司),初元Ⅰ型產(chǎn)品(主要含小麥低聚肽、海洋魚皮膠原低聚肽),規(guī)格:100 mL/瓶,購自江西省江中藥業(yè)股份有限公司,動物蛋白酶(規(guī)格:3 萬u/g,河北省定州百克賽斯生物科技有限公司),鏈脲菌素(Streptozocin,STZ)(上海雅吉生物科技有限公司),蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(上海信帆生物科技有限公司),白細胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司),兔抗鼠SDF-1、CXCR4 及β-actin 多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)。

    1.2.2 主要儀器Optima?XPN 超速離心機(蘇州貝克曼庫爾特生物科技有限公司),M1324R 型高速冷凍離心機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),JXDG型冷凍干燥機(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 牡蠣酶解物制備將牡蠣肉清洗、瀝干,打漿,調(diào)至pH 7.0,加1 000 u/g 動物蛋白酶,酶解5 h,沸水浴滅活10 min,冷卻,8 000 r/min 離心20 min,取上清液濃縮,濃縮后冷凍干燥備用。

    1.3.2 模型復(fù)制及分組50 只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,禁食、不禁水12 h,用pH 4.8 檸檬酸緩沖液稀釋STZ 并配制成濃度為1%的溶液(避光、現(xiàn)用現(xiàn)配),將小鼠稱重后按30 mg/kg 劑量一次性腹腔注射STZ,注射結(jié)束后禁食24 h 但給予飲用5%蔗糖水溶液,隨后給予自由飲食、飲水。注射后3~7 d 抽取小鼠尾靜脈血檢測血糖,隨機血糖≥16.7 mmol/L,即符合2型糖尿病診斷標準,可用于后續(xù)實驗。將2 型糖尿病模型小鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后背部剃毛、消毒,使用皮膚活檢針在小鼠背部剪去大小約1 cm×1 cm 的方形切口,充分分離皮膚、皮下組織及肌纖維膜組織,復(fù)制2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷模型,術(shù)后注射青鏈霉素合劑,預(yù)防傷口感染。將模型小鼠隨機分為5組,模型對照組,以及牡蠣酶解液低、中、高劑量組、陽性對照組,每組10 只。其中牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠于模型復(fù)制成功次日分別給予0.25 g/(10 g·d)、0.5 g/(10 g·d)、1.0 g/(10 g·d)牡蠣酶解液灌胃處理[5],1 次/d,連續(xù)14 d,模型對照組同時間給予等量生理鹽水灌胃處理;陽性對照組同時間給予初元Ⅰ型產(chǎn)品0.1 mL/(10 g·d)灌胃處理。

    1.3.3 創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率測定分別于術(shù)后第3 天、7 天、14 天觀察小鼠創(chuàng)面愈合情況,拍照并計算創(chuàng)面面積、創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-當(dāng)日創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。

    1.3.4 創(chuàng)面組織標本采集各組小鼠分別于術(shù)后第14 天后,以10%水合氯醛腹腔麻醉并處死,迅速提取背部創(chuàng)面組織標本,取材大小為1.5 cm×1.5 cm,厚度<0.5 cm。

    1.3.5 HE 染色觀察創(chuàng)面組織病理變化分別取各組5 只小鼠創(chuàng)面組織標本以4%多聚甲醛固定,乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜,連續(xù)切片厚約6 μm,脫蠟、水化,進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,以中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化,并拍照。

    1.3.6 ELISA法檢測創(chuàng)面組織炎癥因子分別取各組5 只小鼠創(chuàng)面組織標本,制備組織勻漿,3 000 r/min離心10 min,取上清液,嚴格按照各ELISA 試劑盒說明書進行操作,檢測創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α水平。

    1.3.7 Western blotting 檢測創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白的表達分別取各組小鼠創(chuàng)面組織標本,制備組織勻漿并提取總蛋白并檢測濃度及純度,電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,分別加入一抗SDF-1(1∶500)、CXCR-4(1∶1 500)、內(nèi)參βactin(1∶500),次日加入HRP 標記山羊抗兔二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,顯色、顯影、定影,根據(jù)各蛋白條帶灰度值計算目的蛋白相對表達量。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組小鼠創(chuàng)面形態(tài)變化

    各組小鼠均未出現(xiàn)感染及死亡。模型復(fù)制成功后第3天,各組小鼠創(chuàng)面均已結(jié)痂,傷口周圍出現(xiàn)紅腫,無液體滲出,傷口收縮均不明顯。模型復(fù)制成功后第7天,各組創(chuàng)面結(jié)痂變硬,創(chuàng)傷周圍表面不平整,創(chuàng)緣皮膚收縮明顯;其中,牡蠣酶解液高劑量組及陽性對照組結(jié)痂厚度優(yōu)于牡蠣酶解液低劑量組、模型對照組,局部創(chuàng)面呈暗紅色。模型復(fù)制成功后第14天,模型對照組傷口結(jié)痂有少量脫落,但瘢痕面積變化小,各給藥組傷口明顯縮小,部分明顯縮痂、脫痂;其中,牡蠣酶解液高劑量組及陽性對照組呈現(xiàn)肉紅色新生表皮,瘢痕暗紅。見圖1。

    圖1 各組小鼠創(chuàng)面形態(tài)變化

    2.2 各組小鼠創(chuàng)面愈合率的變化

    牡蠣酶解液低、中、高劑量組、陽性對照組和模型對照組小鼠術(shù)后3 d、7 d、14 d 的創(chuàng)面愈合率比較,采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析,結(jié)果:①不同時間點小鼠創(chuàng)面愈合率有差異(F=12.978,P=0.000);②5 組小鼠創(chuàng)面愈合率有差異(F=16.836,P=0.000);③5 組小鼠創(chuàng)面愈合率變化趨勢有差異(F=22.128,P=0.000)。見表1。

    表1 各組小鼠不同時間點的創(chuàng)面愈合率比較(n=10,%,)

    表1 各組小鼠不同時間點的創(chuàng)面愈合率比較(n=10,%,)

    注:①與模型對照組比較,P <0.05;②與牡蠣酶解液低劑量組比較,P <0.05;③與牡蠣酶解液中劑量組比較,P <0.05。

    2.3 各組小鼠創(chuàng)面組織病理變化

    HE 染色結(jié)果顯示,模型對照組小鼠創(chuàng)面組織中汗腺細胞、新生血管及導(dǎo)管較少;牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織中有肉芽組織形成,毛囊、汗腺細胞和導(dǎo)管增生較多,且排列整齊。見圖2。

    圖2 各組小鼠創(chuàng)面組織病理變化(HE染色×200)

    2.4 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較

    模型對照組、牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α 水平比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=29.518和10.827,均P=0.000)。進一步兩兩比較結(jié)果:與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織IL-6、TNF-α 降低(P<0.05);牡蠣酶解液低劑量組IL-6、TNF-α 高于中、高劑量組(P<0.05),且牡蠣酶解液中劑量組IL-6、TNF-α 高于高劑量組(P<0.05),呈劑量依賴性;牡蠣酶解液高劑量組與陽性對照組IL-6、TNF-α 水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

    表2 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較(n=5,)

    表2 各組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子水平比較(n=5,)

    注:①與模型對照組比較,P <0.05;②與牡蠣酶解液低劑量組比較,P <0.05;③與牡蠣酶解液中劑量組比較,P <0.05。

    2.5 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4 通路蛋白相對表達量比較

    模型對照組、牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達量比較,經(jīng)方差分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.863 和78.137,均P=0.000)。進一步兩兩比較結(jié)果:與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組及陽性對照組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達量升高(P<0.05);牡蠣酶解液低劑量組SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達量低于中、高劑量組(P<0.05),且牡蠣酶解液中劑量組SDF-1、CXCR-4蛋白相對表達量低于高劑量組(P<0.05),呈劑量依賴性;高劑量組與陽性對照組SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3 和圖3。

    表3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白相對表達量比較(n=5,)

    表3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白相對表達量比較(n=5,)

    注:①與模型對照組比較,P <0.05;②與牡蠣酶解液低劑量組比較,P <0.05;③與牡蠣酶解液中劑量組比較,P <0.05。

    圖3 各組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1/CXCR-4通路蛋白的表達

    3 討論

    2 型糖尿病是一種內(nèi)分泌代謝失常引起的系統(tǒng)性慢性疾病,可引起全身多個系統(tǒng)損害,其中糖尿病足潰瘍及傷口愈合困難是糖尿病最常見的嚴重并發(fā)癥之一。有研究表明,由于機體微循環(huán)障礙、抗感染能力降低、組織修復(fù)能力減弱等常導(dǎo)致糖尿病患者傷口出現(xiàn)潰瘍、感染、壞疽等,嚴重情況下導(dǎo)致截肢甚至死亡[7-9]。因此探尋能有效促進糖尿病患者傷口愈合的治療手段具有重要臨床意義。創(chuàng)傷愈合是一個動態(tài)修復(fù)過程,包含急性炎癥期、細胞增殖期、組織重塑期3 個階段,而2 型糖尿病對上述各階段均可產(chǎn)生破壞效應(yīng),從而導(dǎo)致組織創(chuàng)傷修復(fù)能力受損及組織愈合障礙等[10-11]。傳統(tǒng)創(chuàng)傷愈合活性物質(zhì)如生長因子、細胞因子、免疫調(diào)節(jié)因子等都難以轉(zhuǎn)化于臨床促愈合治療中[12]。近年來,生物活性肽的研究引起研究人員的青睞。有研究表明,其具有活性高、特異性和穩(wěn)定性強的特點,部分活性肽如牡蠣酶解活性肽在皮膚組織創(chuàng)傷中具有較高的應(yīng)用潛能[13]。楊發(fā)明等[5]研究顯示,牡蠣酶解產(chǎn)物能夠促進小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合,但具體機制尚未明確。

    本研究復(fù)制2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷小鼠模型,結(jié)果顯示,與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面愈合率升高,呈劑量依賴性。說明牡蠣酶解液可能促進2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合。皮膚受傷后,組織中M2 型巨噬細胞會立即觸發(fā)局部炎癥反應(yīng),減慢組織愈合過程。本研究結(jié)果顯示,與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面組織炎癥因子IL-6、TNF-α 水平降低,呈劑量依賴性,說明牡蠣酶解液可能減輕2 型糖尿病皮膚軟組織創(chuàng)傷小鼠創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng),促進創(chuàng)傷愈合修復(fù)。

    SDF-1/CXCR-4 通路是一條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,SDF-1 與其受體CXCR-4 相互結(jié)合可促進細胞中炎癥因子如IL-6、TNF-α 等合成及分泌,促進炎癥反應(yīng)[14-15]。劉好[6]研究顯示,抑制CXCR-4 表達可促進糖尿病小鼠皮膚創(chuàng)傷修復(fù)。李東峻[16]研究顯示,抑制SDF-1/CXCR-4 軸活化對銀屑病皮損修復(fù)有一定促進作用。本研究結(jié)果顯示,與模型對照組比較,牡蠣酶解液低、中、高劑量組小鼠創(chuàng)面組織SDF-1、CXCR-4 蛋白相對表達量降低,呈劑量依賴性。說明牡蠣酶解液可能通過抑制SDF-1/CXCR-4 通路活化來抑制炎癥反應(yīng),進而促進2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù)。

    綜上所述,牡蠣酶解液可促進2 型糖尿病小鼠皮膚軟組織創(chuàng)傷愈合修復(fù),其可能是通過抑制SDF-1/CXCR-4 通路活化進而抑制炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)的。然而本研究并未能闡明牡蠣酶解液對SDF-1/CXCR-4 通路的具體調(diào)控作用,后期應(yīng)、將進行深入闡述。

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