達(dá)格列凈對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能及PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路的影響*

史麗，胡婷婷，李紅，張三明，劉智慧，左惠玲，胡利梅，任衛(wèi)東

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 國際醫(yī)療部，河北 張家口 075000；3.張家口市衛(wèi)生健康項(xiàng)目管理中心，河北張家口 075000；4.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000）

糖尿病是一種常見的代謝紊亂性疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，糖尿病大血管病變是其常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是患者死亡的主要原因，目前尚無有效措施預(yù)防及控制糖尿病大血管病變[1]。有研究顯示，微血管病變導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病大血管病變發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)[2]。因此探尋有效防治糖尿病血管內(nèi)皮損傷的藥物對(duì)于防治糖尿病大血管病變有重要臨床意義。達(dá)格列凈是一種新型降糖藥物，屬于鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑，能夠降低血糖、血脂，延緩糖尿病進(jìn)展[3]。陳姣等[4]研究顯示，達(dá)格列凈能夠改善糖尿病合并心力衰竭患者的心功能和血管內(nèi)皮功能，從而降低再入院率。武衛(wèi)黨等[5]研究顯示，達(dá)格列凈能夠改善糖尿病心肌缺血大鼠心肌及血管功能。然而達(dá)格列凈對(duì)糖尿病患者血管內(nèi)皮功能的作用機(jī)制尚未明確。既往研究顯示，上調(diào)人張力蛋白同源物基因（phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN）表達(dá)，可抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信號(hào)通路活化，減輕2 型糖尿病大鼠血管病變，抑制主動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷[6]。目前有關(guān)達(dá)格列凈對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮功能的影響是否與調(diào)控PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)，少見報(bào)道。因此，本研究探究達(dá)格列凈對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能的影響，并分析其可能機(jī)制，以期為有效防治糖尿病大血管病變提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，6 周齡，體重180～210 g，平均（195±15）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2021-0029。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑達(dá)格列凈片（國藥準(zhǔn)字J20170040，瑞典Astra Zeneca AB 公司），蛋白提取試劑盒、鏈脲佐菌霉素（Streptozotocin,STZ）（上海吉至生化科技有限公司），高脂飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），內(nèi)皮素1（Endothelin-1,ET-1）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（江西艾博因生物科技有限公司），兔抗鼠人張力蛋白同源物基因（phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin 抗體、山羊抗兔HRP 二抗（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）。

1.2.2 主要儀器Optima?XPN 超速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司），BD-SW50 光學(xué)顯微鏡（深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型的復(fù)制及分組30 只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、達(dá)格列凈組，各10 只。模型組、達(dá)格列凈組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)。12 周后大鼠禁食不禁水12 h，模型組和達(dá)格列凈組一次性尾靜脈注射30 mg/kg STZ溶液（以pH 4.5 的0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）；對(duì)照組一次性尾靜脈注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。72 h 后經(jīng)尾靜脈測(cè)大鼠空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 為2 型糖尿病模型復(fù)制成功[7]。

1.3.2 給藥方式達(dá)格列凈組大鼠模型復(fù)制成功后予以1 mg/（kg·d）[8]達(dá)格列凈灌胃，連續(xù)4 周。模型組、對(duì)照組大鼠分別于同時(shí)間灌胃等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.3.3 標(biāo)本采集3 組大鼠均在末次給藥結(jié)束后，用4%多聚甲醛麻醉。于腹主動(dòng)脈取血2 mL，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

取血結(jié)束后立即處死大鼠，打開胸腔剝離胸主動(dòng)脈及腹主動(dòng)脈血管，取血管外膜組織，分為兩部分。一部分乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片（6 μm 厚），用于HE 染色；另一部分保存于液氮中，用于Western blotting 檢測(cè)。

1.3.4 ELISA 檢測(cè)血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平

取各組大鼠腹主動(dòng)脈取血的血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用ELISA 檢測(cè)血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平[9]。

1.3.5 HE 染色觀察大鼠主動(dòng)脈血管組織病理變化取各組大鼠主動(dòng)脈血管組織切片，脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，按照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，中性樹膠封片。采用光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件觀察主動(dòng)脈血管組織病理變化。

1.3.6 Western blotting 檢測(cè)大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路蛋白的表達(dá)分別取3 組剩余主動(dòng)脈血管組織標(biāo)本制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測(cè)濃度及純度，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗（PTEN、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt）及內(nèi)參β-actin，按1∶500 稀釋，次日加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，顯色、顯影定影，以各蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

對(duì)照組小鼠每日飲水，尿量均正常，皮毛光滑、柔順有光澤，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)量大，反應(yīng)敏捷；模型組小鼠精神萎靡，皮毛暗黃無光澤，活動(dòng)量減少，出現(xiàn)典型的多飲、多食、多尿及體形消瘦現(xiàn)象；與模型組比較，達(dá)格列凈組大鼠上述一般情況有所改善。

2.2 各組大鼠主動(dòng)脈血管組織病理變化

對(duì)照組大鼠血管內(nèi)皮完整，中層可見梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維清晰、完整，呈環(huán)形排列；模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，血管內(nèi)皮中層平滑肌細(xì)胞增生，彈力纖維排列紊亂；與模型組比較，達(dá)格列凈組大鼠主動(dòng)脈上述病理變化有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠主動(dòng)脈血管組織病理學(xué)變化（HE×200）

2.3 各組大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較

3組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平升高（P＜0.05），但達(dá)格列凈組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較（n=10，）

表1 各組大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較（n=10，）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

2.4 各組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05）；但達(dá)格列凈組較模型組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

表2 各組大鼠PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=10，）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

圖2 各組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白的表達(dá)

3 討論

糖尿病大血管病變是糖尿病長期慢性并發(fā)癥，已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及生命健康，目前仍缺乏理想的防治手段。糖尿病大血管病變發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究證實(shí)，血管內(nèi)皮功能損傷是其主要病理基礎(chǔ)之一[11]。達(dá)格列凈是新型口服降糖藥，廣泛應(yīng)用于2 型糖尿病的治療，對(duì)糖尿病血管病變有一定治療作用。孫娟等[12]研究顯示，達(dá)格列凈能夠改善胰島功能并緩解糖尿病患者血管病變。史曉荻等[13]研究顯示，達(dá)格列凈對(duì)糖尿病患者血管內(nèi)皮功能有一定改善作用，對(duì)防止并發(fā)癥有積極作用。

ET-1、HIF-1α、VEGF 是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)。有研究顯示，在持續(xù)高血糖狀態(tài)下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，發(fā)生血管內(nèi)皮功能障礙，促使ET-1、HIF-1α、VEGF 分泌增加，3 者可一定程度反映血管內(nèi)皮功能損傷程度[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，血管內(nèi)皮中層平滑肌細(xì)胞增生，彈力纖維排列紊亂，而經(jīng)達(dá)格列凈處理后，大鼠主動(dòng)脈上述病理變化有所改善；且與對(duì)照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平升高，但經(jīng)達(dá)格列凈藥物處理后，大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平降低，說明達(dá)格列凈可對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能發(fā)揮保護(hù)作用。

PI3K/Akt 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝的重要信號(hào)通路。有研究顯示，持續(xù)高血糖能夠刺激PI3K/Akt 信號(hào)通路活化，使PIP2 轉(zhuǎn)化為第二信使PIP3，從而促進(jìn)Akt 磷酸化和下游效應(yīng)基因HIF-1α表達(dá)，引起VEGF 的表達(dá)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、遷移，促進(jìn)糖尿病血管病變的發(fā)生[15]。PTEN是一種具有雙重脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因，有研究顯示其能負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路[16]。韓利平等[17]研究顯示，上調(diào)PTEN 表達(dá)可抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活化，改善糖尿病大鼠血管病變損傷程度。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；但達(dá)格列凈組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN 蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，與既往研究結(jié)果相似，說明達(dá)格列凈可能通過上調(diào)PTEN 表達(dá)，抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路活化，從而改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能損傷，為防治糖尿病大血管病變提供一定理論依據(jù)。

綜上所述，達(dá)格列凈對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能損傷發(fā)揮保護(hù)作用，可能是通過促進(jìn)PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路活化來實(shí)現(xiàn)的。然而本研究并未能明確達(dá)格列凈對(duì)PTEN/PI3K/Akt 信號(hào)通路的具體調(diào)控作用，后期將進(jìn)行深入闡述。