達(dá)格列凈對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能及PTEN/PI3K/Akt信號通路的影響*

史麗，胡婷婷，李紅，張三明，劉智慧，左惠玲，胡利梅，任衛(wèi)東

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 國際醫(yī)療部，河北 張家口 075000；3.張家口市衛(wèi)生健康項(xiàng)目管理中心，河北張家口 075000；4.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000）

糖尿病是一種常見的代謝紊亂性疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，糖尿病大血管病變是其常見的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是患者死亡的主要原因，目前尚無有效措施預(yù)防及控制糖尿病大血管病變[1]。有研究顯示，微血管病變導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙是糖尿病大血管病變發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)[2]。因此探尋有效防治糖尿病血管內(nèi)皮損傷的藥物對于防治糖尿病大血管病變有重要臨床意義。達(dá)格列凈是一種新型降糖藥物，屬于鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2 抑制劑，能夠降低血糖、血脂，延緩糖尿病進(jìn)展[3]。陳姣等[4]研究顯示，達(dá)格列凈能夠改善糖尿病合并心力衰竭患者的心功能和血管內(nèi)皮功能，從而降低再入院率。武衛(wèi)黨等[5]研究顯示，達(dá)格列凈能夠改善糖尿病心肌缺血大鼠心肌及血管功能。然而達(dá)格列凈對糖尿病患者血管內(nèi)皮功能的作用機(jī)制尚未明確。既往研究顯示，上調(diào)人張力蛋白同源物基因（phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN）表達(dá)，可抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信號通路活化，減輕2 型糖尿病大鼠血管病變，抑制主動脈血管內(nèi)皮損傷[6]。目前有關(guān)達(dá)格列凈對糖尿病血管內(nèi)皮功能的影響是否與調(diào)控PTEN/PI3K/Akt 信號通路有關(guān)，少見報道。因此，本研究探究達(dá)格列凈對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能的影響，并分析其可能機(jī)制，以期為有效防治糖尿病大血管病變提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

30 只SPF 級SD 雄性大鼠，6 周齡，體重180～210 g，平均（195±15）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（京）2021-0029。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑達(dá)格列凈片（國藥準(zhǔn)字J20170040，瑞典Astra Zeneca AB 公司），蛋白提取試劑盒、鏈脲佐菌霉素（Streptozotocin,STZ）（上海吉至生化科技有限公司），高脂飼料（江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司），內(nèi)皮素1（Endothelin-1,ET-1）、缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（江西艾博因生物科技有限公司），兔抗鼠人張力蛋白同源物基因（phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase,PI3K）、p-PI3K、Akt、p-Akt、β-actin 抗體、山羊抗兔HRP 二抗（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）。

1.2.2 主要儀器Optima?XPN 超速離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司），BD-SW50 光學(xué)顯微鏡（深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的復(fù)制及分組30 只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、達(dá)格列凈組，各10 只。模型組、達(dá)格列凈組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。12 周后大鼠禁食不禁水12 h，模型組和達(dá)格列凈組一次性尾靜脈注射30 mg/kg STZ溶液（以pH 4.5 的0.1 mol/L 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液現(xiàn)用現(xiàn)配）；對照組一次性尾靜脈注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。72 h 后經(jīng)尾靜脈測大鼠空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L 為2 型糖尿病模型復(fù)制成功[7]。

1.3.2 給藥方式達(dá)格列凈組大鼠模型復(fù)制成功后予以1 mg/（kg·d）[8]達(dá)格列凈灌胃，連續(xù)4 周。模型組、對照組大鼠分別于同時間灌胃等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.3.3 標(biāo)本采集3 組大鼠均在末次給藥結(jié)束后，用4%多聚甲醛麻醉。于腹主動脈取血2 mL，3 000 r/min 離心10 min，離心半徑8 cm，取上清液置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

取血結(jié)束后立即處死大鼠，打開胸腔剝離胸主動脈及腹主動脈血管，取血管外膜組織，分為兩部分。一部分乙醇脫水、透明、石蠟包埋過夜，連續(xù)切片（6 μm 厚），用于HE 染色；另一部分保存于液氮中，用于Western blotting 檢測。

1.3.4 ELISA 檢測血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平

取各組大鼠腹主動脈取血的血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用ELISA 檢測血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平[9]。

1.3.5 HE 染色觀察大鼠主動脈血管組織病理變化取各組大鼠主動脈血管組織切片，脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，按照HE 染色試劑盒說明書進(jìn)行染色，中性樹膠封片。采用光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件觀察主動脈血管組織病理變化。

1.3.6 Western blotting 檢測大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN/PI3K/Akt 信號通路蛋白的表達(dá)分別取3 組剩余主動脈血管組織標(biāo)本制備組織勻漿，提取總蛋白并檢測濃度及純度，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入一抗（PTEN、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt）及內(nèi)參β-actin，按1∶500 稀釋，次日加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，顯色、顯影定影，以各蛋白條帶灰度值的比值計算蛋白相對表達(dá)量[10]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

對照組小鼠每日飲水，尿量均正常，皮毛光滑、柔順有光澤，精神狀態(tài)良好，活動量大，反應(yīng)敏捷；模型組小鼠精神萎靡，皮毛暗黃無光澤，活動量減少，出現(xiàn)典型的多飲、多食、多尿及體形消瘦現(xiàn)象；與模型組比較，達(dá)格列凈組大鼠上述一般情況有所改善。

2.2 各組大鼠主動脈血管組織病理變化

對照組大鼠血管內(nèi)皮完整，中層可見梭形平滑肌細(xì)胞，彈力纖維清晰、完整，呈環(huán)形排列；模型組大鼠主動脈內(nèi)膜增厚，血管內(nèi)皮中層平滑肌細(xì)胞增生，彈力纖維排列紊亂；與模型組比較，達(dá)格列凈組大鼠主動脈上述病理變化有所改善。見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈血管組織病理學(xué)變化（HE×200）

2.3 各組大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較

3組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平升高（P＜0.05），但達(dá)格列凈組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF水平低于模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較（n=10，）

表1 各組大鼠ET-1、HIF-1α、VEGF水平比較（n=10，）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

2.4 各組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN/PI3K/Akt 信號通路蛋白相對表達(dá)量比較

3 組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；但達(dá)格列凈組較模型組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05），p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠PTEN/PI3K/Akt信號通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=10，）

表2 各組大鼠PTEN/PI3K/Akt信號通路蛋白相對表達(dá)量比較（n=10，）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05。

圖2 各組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN/PI3K/Akt信號通路蛋白的表達(dá)

3 討論

糖尿病大血管病變是糖尿病長期慢性并發(fā)癥，已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及生命健康，目前仍缺乏理想的防治手段。糖尿病大血管病變發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究證實(shí)，血管內(nèi)皮功能損傷是其主要病理基礎(chǔ)之一[11]。達(dá)格列凈是新型口服降糖藥，廣泛應(yīng)用于2 型糖尿病的治療，對糖尿病血管病變有一定治療作用。孫娟等[12]研究顯示，達(dá)格列凈能夠改善胰島功能并緩解糖尿病患者血管病變。史曉荻等[13]研究顯示，達(dá)格列凈對糖尿病患者血管內(nèi)皮功能有一定改善作用，對防止并發(fā)癥有積極作用。

ET-1、HIF-1α、VEGF 是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)。有研究顯示，在持續(xù)高血糖狀態(tài)下，微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，發(fā)生血管內(nèi)皮功能障礙，促使ET-1、HIF-1α、VEGF 分泌增加，3 者可一定程度反映血管內(nèi)皮功能損傷程度[14]。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組大鼠主動脈內(nèi)膜增厚，血管內(nèi)皮中層平滑肌細(xì)胞增生，彈力纖維排列紊亂，而經(jīng)達(dá)格列凈處理后，大鼠主動脈上述病理變化有所改善；且與對照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平升高，但經(jīng)達(dá)格列凈藥物處理后，大鼠血清ET-1、HIF-1α、VEGF 水平降低，說明達(dá)格列凈可對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能發(fā)揮保護(hù)作用。

PI3K/Akt 信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、代謝的重要信號通路。有研究顯示，持續(xù)高血糖能夠刺激PI3K/Akt 信號通路活化，使PIP2 轉(zhuǎn)化為第二信使PIP3，從而促進(jìn)Akt 磷酸化和下游效應(yīng)基因HIF-1α表達(dá)，引起VEGF 的表達(dá)，而血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖、遷移，促進(jìn)糖尿病血管病變的發(fā)生[15]。PTEN是一種具有雙重脂質(zhì)磷酸酶活性的抑癌基因，有研究顯示其能負(fù)向調(diào)控PI3K/Akt 信號通路[16]。韓利平等[17]研究顯示，上調(diào)PTEN 表達(dá)可抑制PI3K/Akt信號通路活化，改善糖尿病大鼠血管病變損傷程度。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組、達(dá)格列凈組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN 蛋白相對表達(dá)量降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達(dá)量升高；但達(dá)格列凈組大鼠血管內(nèi)皮組織PTEN 蛋白相對表達(dá)量升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相對表達(dá)量降低，與既往研究結(jié)果相似，說明達(dá)格列凈可能通過上調(diào)PTEN 表達(dá)，抑制PI3K/Akt 信號通路活化，從而改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能損傷，為防治糖尿病大血管病變提供一定理論依據(jù)。

綜上所述，達(dá)格列凈對糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能損傷發(fā)揮保護(hù)作用，可能是通過促進(jìn)PTEN/PI3K/Akt 信號通路活化來實(shí)現(xiàn)的。然而本研究并未能明確達(dá)格列凈對PTEN/PI3K/Akt 信號通路的具體調(diào)控作用，后期將進(jìn)行深入闡述。