一個(gè)遺傳性抗凝血酶缺陷癥家系的表型與基因突變分析

周星星，謝耀盛，謝海嘯，王明山

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 浙江省檢驗(yàn)診斷及轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325015

抗凝血酶（antithrombin, AT）是由肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的天然抗凝物，為小分子單鏈糖蛋白，由432個(gè)氨基酸組成。AT可以與凝血酶以及多種凝血因子的絲氨酸蛋白酶活性中心特異性結(jié)合，抑制其活性，達(dá)到抗凝作用[1]。合成AT蛋白的基因（SERPINC1）位于1q23-25，由6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子組成[2]。遺傳性AT缺陷癥是由于SERPINC1基因突變外周血中AT異常的先天性凝血系統(tǒng)異常疾病，呈常染色體顯性遺傳，實(shí)驗(yàn)室檢查表現(xiàn)為外周血中AT蛋白功能或者濃度的異常。遺傳性AT缺陷癥可以分為兩型：I型，因AT合成障礙導(dǎo)致，表現(xiàn)為AT活性和抗原同步降低；II型，因AT結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致，表現(xiàn)為AT活性降低，而抗原含量正常[3]。筆者報(bào)道1例遺傳性AT缺陷癥家系，分析各成員臨床表型和基因型，結(jié)合生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)果，探討其可能的分子致病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 先證者，男，25歲，江西省吉安市人。自述3個(gè)月前有右下肢腫脹病史，4 d前無明顯誘因下出現(xiàn)左下肢腫脹，行走后出現(xiàn)顯著酸脹，持續(xù)時(shí)間較長，經(jīng)臥床休息后癥狀可得到緩解，無胸悶氣促，遂至溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院進(jìn)一步治療。入院后行肺動(dòng)脈造影示：左肺部可見多處動(dòng)脈末端栓塞，主要分布于下肺動(dòng)脈主干和上部肺葉；行雙側(cè)下肢動(dòng)（靜）脈彩超示:雙側(cè)髂外靜脈及雙下肢全程深靜脈血栓形成，部分血管見再通，予“那屈肝素鈣注射液”抗凝治療后疼痛稍緩解。為了明確血栓形成的原因，對(duì)先證者進(jìn)行了易栓癥遺傳性危險(xiǎn)因素的篩查，結(jié)果顯示先證者蛋白S活性（PS:A）和蛋白C活性（PC:A）無明顯異常，而抗凝血酶活性 （AT:A）降低為29%，抗凝血酶抗原（AT:Ag）降低至59 mg/L。將先證者及家系其他成員共3代7人納入本調(diào)查范圍，除先證者外，其余家系成員目前均無相關(guān)臨床癥狀，家系圖譜見圖1。為建立實(shí)驗(yàn)室參考范圍，篩選100名健康獻(xiàn)血者作為正常對(duì)照，男50名，女50名，年齡16～52歲，平均28歲，均無心血管及肝腎疾病，無糖尿病及血栓性疾病史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)：倫審2012-17），研究對(duì)象均知情同意。

圖1 遺傳性AT缺陷癥家系圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：采集各家系成員外周靜脈血2管，一管采集2.7 mL于0.3 mL枸櫞酸鈉（濃度： 109 mmol/L）抗凝管中，4 ℃ 1 500×g離心10 min， 收集上層血漿用于凝血指標(biāo)檢測；另一管采集2 mL于EDTA抗凝管中用于基因組DNA提取。

1.2.2 血漿凝血指標(biāo)檢測：活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time,APTT）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time, PT）、纖維蛋白原（fibrinogen, FIB）、凝血酶時(shí)間（thrombin time, TT）及PS:A采用一期凝固法，D-二聚體（Ddimer, D-D）含量采用免疫比濁法，AT:A和PC:A采用發(fā)色底物法，AT:Ag采用酶聯(lián)免疫法，檢測儀器為Stago血凝儀（法國斯塔高公司），采用配套試劑盒并嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 PCR擴(kuò)增基因組DNA：采用酚-氯仿法提取家系各成員外周血細(xì)胞基因組DNA。參考文獻(xiàn)[4]中提供的引物序列，通過NCBI Primer軟件設(shè)計(jì)引物，使其能涵蓋SERPINC1基因所有外顯子及其側(cè)翼序列（見表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后在Illumina NextSeq 500平臺(tái)進(jìn)行高通量測序（由上海派森諾生物科技股份有限公司完成檢測），在Chromas2.01軟件中導(dǎo)入回報(bào)的測序結(jié)果與SERPINC1標(biāo)準(zhǔn)序列（GenBank ID：NG_012462.1）進(jìn)行比對(duì)分析，尋找突變基因位點(diǎn)，并對(duì)可疑位點(diǎn)重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，予以正、反向測序驗(yàn)證；確定基因突變的存在和類型后，再對(duì)家系成員相應(yīng)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序。

表1 SERPINC1基因PCR引物序列和片段長度

1.2.4 生物信息學(xué)分析：采用Mutation Taster、Poly-Phen-2和LRT生物信息學(xué)軟件預(yù)測基因突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響；通過ClustalX-2.1-win多重序列比對(duì)軟件分析突變氨基酸在其余9個(gè)同源物種間的保守性；從現(xiàn)有蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索出AT蛋白模型范本（PDB ID：P01008），在Swiss-Pdb Viewer軟件中建模突變前后AT蛋白的結(jié)構(gòu)圖，比對(duì)分析突變對(duì)AT蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和分子間作用力的影響。

2 結(jié)果

2.1 表型檢測結(jié)果 先證者及其外祖母、父親、母親和弟弟的AT:A和AT:Ag均降低，分別為29%、 59 mg/L，86%、200 mg/L，65%、99 mg/L，90%、 206 mg/L，83%、180 mg/L；各家系成員PC:A和PS:A的檢測結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。見表2。

2.2 基因型檢測結(jié)果 先證者和其父親的SERPINC1基因第1號(hào)外顯子存在c.1A＞G雜合錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸第2位的酪氨酸突變?yōu)榻K止密碼子（p.Tyr2Stop），查閱基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD，https://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/all.php）和相關(guān)文獻(xiàn)，未見c.1A＞G雜合錯(cuò)義突變的相關(guān)報(bào)道。此 外，先證者的SERPINC1基因第5號(hào)外顯子存在c.1005G＞A雜合同義突變，其外祖母、母親和弟弟也攜帶該突變，家系其余人員該位點(diǎn)均為野生型（見表2和圖2）。

圖2 先證者SERPINC1基因測序圖

表2 遺傳性AT缺陷癥家系表型和基因檢測結(jié)果

2.3 生物信息學(xué)軟件分析結(jié)果 p.Tyr2stop突變?cè)贛utationTaster、PolyPhen-2、LRT三個(gè)軟件中分析得分分別為1.000、1.000、0.000，提示該突變的預(yù)測結(jié)果為“致病的、有害的”。保守性分析顯示Tyr2在10種同源物種中高度保守（見圖3）。利用Swiss-Pdb Viewer軟件構(gòu)建突變蛋白模型，與野生型對(duì)比分析顯示，p.Tyr2stop突變導(dǎo)致第2位產(chǎn)生終止密碼子，后續(xù)蛋白翻譯無法正常進(jìn)行，形成截短型蛋白質(zhì)（見圖4）。

圖3 Tyr2位點(diǎn)同源物種保守性分析

圖4 p.Tyr2stop突變模型分析

3 討論

在人體抗凝系統(tǒng)中，AT的作用非常重要，當(dāng)AT基因發(fā)生突變時(shí)，血液中的AT蛋白出現(xiàn)濃度下降或者功能缺失，最終引起遺傳性AT缺陷癥[5]。該病臨床表現(xiàn)為血栓的反復(fù)形成，其中以肺栓塞、下肢深靜脈血栓最為常見，還可見于髂靜脈和腸系膜靜脈，臨床發(fā)病率為5/105～5/104。而在靜脈血栓栓塞癥患者中，AT缺陷癥的發(fā)病率高達(dá)1/200～1/20。有研究表明AT缺陷能夠使血栓形成的危險(xiǎn)性增加20倍[6]，中國人在靜脈血栓栓塞癥中的發(fā)病率為5.75%～7.14%，是靜脈血栓栓塞的主要遺傳性危險(xiǎn)因素之一。截至2022年7月，人類基因突變數(shù)據(jù)庫收集的數(shù)據(jù)中包含420多種AT基因突變位點(diǎn)，58.1%為錯(cuò)義突變，移碼突變占35.4%，其他類型突變占6.5%。

先證者在早期即發(fā)現(xiàn)了多處靜脈血栓并伴有顯著癥狀，而家系攜帶單雜合突變成員均無相關(guān)臨床癥狀。家系各成員的基因分析結(jié)果顯示，先證者攜帶復(fù)合雜合突變（c.1A＞G和c.1005G＞A），AT:A水平降至29%；其父親攜帶c.1A＞G突變，AT:A水平降至65%且伴有下肢靜脈血栓病史；其外祖母、母親和弟弟攜帶c.1005G＞A突變，AT:A水平略微下降而不伴有靜脈血栓病史。前期收集的臨床資料和遺傳家系圖顯示，其家系成員均無基礎(chǔ)疾病，且各凝血指標(biāo)均正常，AT:Ag與AT:A同步降低，而且均攜帶相同突變位點(diǎn)，可推斷先證者攜帶的兩個(gè)基因突變遺傳自其父親和母親，并導(dǎo)致了其早期的臨床癥狀，其中c.1A＞G是導(dǎo)致疾病的主要突變。三個(gè)生物信息學(xué)軟件分析顯示p.Tyr2stop突變?yōu)椤爸虏〉?、有害的”，可能?huì)導(dǎo)致AT缺陷。為了進(jìn)一步驗(yàn)證p.Tyr2stop突變對(duì)AT蛋白結(jié)構(gòu)的影響，本研究進(jìn)行了蛋白模型分析，結(jié)果顯示：第1位堿基發(fā)生突變后，破壞了Tyr2下游的正常閱讀框，形成一組終止密碼子，核糖體識(shí)別到后停止蛋白質(zhì)的翻譯合成，造成肽鏈合成提前終止或者穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生截短蛋白，高度不穩(wěn)定且易降解。

外周血中成熟的具有功能性的AT蛋白需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)歷二次翻譯和修飾產(chǎn)生4個(gè)天冬酰胺的N-糖基化和3個(gè)半胱氨酸二硫鍵[7]，而引導(dǎo)AT新生蛋白進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一段編碼信號(hào)肽則至關(guān)重要，由AT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中1至32位的氨基酸構(gòu)成，p.Tyr2stop突變會(huì)引起該功能區(qū)域缺失，體內(nèi)產(chǎn)生的截短蛋白呈高度不穩(wěn)定性，易被捕獲降解或者分泌障礙，最終導(dǎo)致血清中AT蛋白水平下降，同時(shí)會(huì)降低那屈肝素鈣的治療效果。蛋白質(zhì)同源性分析顯示：Tyr2在同源物種（哺乳動(dòng)物、爬行類動(dòng)物、鳥類、魚類等）之間高度保守，表明它對(duì)AT正常結(jié)構(gòu)的維持和蛋白功能的發(fā)揮有重要作用。同時(shí)先證者還攜帶有c.1005G＞A雜合同義突變，第1005位G堿基位于SERPINC1基因外顯子第5區(qū)，翻譯后的功能蛋白并非AT的主要功能區(qū)或者肝素結(jié)合區(qū)，該突變?cè)谖恼轮性袌?bào)道[8-9]，氨基酸序列未發(fā)生改變，但是它改變了核苷酸序列，可通過miRNA影響基因的表達(dá)，影響翻譯過程中蛋白質(zhì)同步折疊，最終影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[10]。觀察家系成員的臨床表現(xiàn)和凝血指標(biāo)，推測兩個(gè)突變之間可能存在協(xié)同作用。其他僅存在單一c.1005G＞A突變的家系成員，沒有相關(guān)臨床表現(xiàn)，但是當(dāng)存在其他獲得性易栓因素，如高齡、長期制動(dòng)、妊娠、肝臟疾病等，血栓形成的概率將大幅度增加[11]。

綜上所述，筆者對(duì)一個(gè)遺傳性AT缺陷癥家系進(jìn)行表型和基因突變分析，證明先證者出現(xiàn)深靜脈血栓形成可能與c.1A＞G和c.1005G＞A復(fù)合雜合突變有關(guān)，其中c.1A＞G雜合錯(cuò)義突變國內(nèi)外尚未見報(bào)道；采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測突變危害性和建立突變蛋白模型，初步探討了其致病機(jī)制，但兩種突變導(dǎo)致外周血中AT水平降低的具體機(jī)制，需要通過體外實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步的探討。