基于光頻雙曲超材料的無標(biāo)記遠場超分辨顯微成像

陳雪松，杜文娟*，樓志浪，湯東亮

1 湘潭大學(xué)物理與光電工程學(xué)院，湖南 湘潭 411105；

2 湖南大學(xué)物理與微電子科學(xué)學(xué)院微納光電器件及應(yīng)用教育部重點實驗室，低維結(jié)構(gòu)物理與器件湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410082

1 引 言

傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的空間分辨率受限于衍射極限λ/(2NA)(λ為波長，NA為光學(xué)顯微系統(tǒng)物鏡數(shù)值孔徑)，可見光范圍內(nèi)橫向分辨率約為200 nm～300 nm，難以實現(xiàn)對百納米甚至十納米量級的微納結(jié)構(gòu)或細胞樣本的清晰成像。如何提高空間分辨率至100 nm 以下甚至分子尺度、實現(xiàn)高對比度的超分辨顯微成像成為了光學(xué)顯微成像技術(shù)的主要研究方向之一[1-4]。超分辨成像方法分為近場成像方法和遠場成像方法。其中近場成像方法以近場掃描光學(xué)顯微 鏡(near-field scanning optical microscope，NSOM)[5]最為典型，其利用亞波長尺寸孔徑在近場照明樣品實現(xiàn)高頻倏逝波的激發(fā)和探測，從而突破衍射極限實現(xiàn)超衍射成像，橫向空間分辨率約為50 nm～100 nm。然而近場激發(fā)照明的弊端在于探針位于樣品表面百納米范圍內(nèi)，可探測的樣品深度范圍極為有限，探針尖端易受損影響成像質(zhì)量，且掃描成像方式無法實現(xiàn)實時寬場成像[6]。遠場超分辨成像方法以熒光顯微成像技術(shù)最為典型。近年來，研究人員已經(jīng)提出了一系列突破衍射極限分辨率限制的超分辨熒光顯微成像技術(shù)。例如，全內(nèi)反射熒光顯微成 像(total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM)[7-8]、共聚焦掃描顯微成像(confocal laser scanning microscope，CLSM)[9-10]、受激輻射損耗顯微 鏡 (stimulated emission depletion microscopy，STED)[3,11-12]、單分子定位顯微鏡(singlemolecule localization microscopy，SMLM)[2,13]、光敏定位顯微術(shù)(photoactivated localization microscopy，PALM)[2,14]、隨機光學(xué)重建顯微術(shù)(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)[13]、結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)(structured illumination microscopy，SIM)[15-16]，以及等離激元結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(plasmonic structured illumination microscopy，PSIM)[17-18]等，上述技術(shù)可將熒光顯微技術(shù)的空間分辨率提高至納米量級[6]。然而超分辨熒光顯微技術(shù)過分依賴于熒光染劑，且熒光標(biāo)記樣本過程中存在耗時、滅活、染色不均、光漂白、短波長高強度激發(fā)光易損傷樣本等多個問題，制約了熒光顯微技術(shù)的應(yīng)用場合。更重要的是，當(dāng)樣本為無法染色的微納結(jié)構(gòu)材料、集成芯片等非生物樣品或排異的活體生物樣品時，超分辨熒光顯微技術(shù)不再適用[6]。CLSM 雖可以應(yīng)用于以上樣本，但其掃描機制使得探測范圍受限于聚焦區(qū)域，不利于實時寬場成像[6]。因此急需開展普適性更強、無需熒光標(biāo)記、寬場型遠場超分辨顯微成像手段研究。

近年來，頻譜平移原理成像研究的興起，使得無熒光標(biāo)記的遠場超分辨顯微成像成為可能。傳統(tǒng)離軸照明顯微成像方法如SIM 成像[15-16]、傅里葉疊層顯微成像(Fourier ptychography microscopy，F(xiàn)PM)[19]、暗場顯微成像等，是利用傳輸波離軸照明方法使得成像光的高頻分量進入成像系統(tǒng)收集范圍內(nèi)，其空間分辨率受限于最大入射角度的取值，無法將衍射極限以外的高頻空間信息移動到遠場成像系統(tǒng)的通帶范圍內(nèi)，造成結(jié)構(gòu)的細節(jié)信息丟失?；陬l譜平移原理實現(xiàn)超分辨成像的思路是利用高頻倏逝波代替?zhèn)鬏敳ㄕ彰鳂颖荆捎谫渴挪ǖ臋M向空間波矢kx遠大于傳輸波的最大橫向波矢k0，因此當(dāng)其照明樣品時，成像系統(tǒng)截止頻率以外更多的高頻信息被搬移至成像系統(tǒng)通帶內(nèi)參與成像，等效地拓展了成像系統(tǒng)通帶從而顯著提升顯微成像分辨率，實現(xiàn)對物體高頻信息的收集?；陬l移超分辨原理，研究人員相繼提出一系列倏逝波激發(fā)方法用于無熒光標(biāo)記的遠場超分辨顯微成像技術(shù)中。2013 年，劉旭教授團隊利用通入激光的緊貼樣品表層的一維納米光纖激發(fā)倏逝波照明雙狹縫樣本，實現(xiàn)中心間距為225 nm 的雙縫無標(biāo)記超分辨成像[20]。同年浙江大學(xué)劉旭教授團隊再次提出利用棱鏡的全內(nèi)反射在棱鏡表面激發(fā)倏逝波照明雙狹縫樣本[21]，橫向分辨率達到λ/2.5。該種照明方式能夠?qū)崿F(xiàn)寬場顯微成像要求，但分辨率受限于棱鏡介質(zhì)材料限制，較難實現(xiàn)橫向分辨率進一步提升。2017 年，浙江大學(xué)楊青教授團隊提出一種緊貼在TiO2等高折射率波導(dǎo)表面的環(huán)形半導(dǎo)體納米線作為照明光源，通過激光照射環(huán)形納米線實驗實現(xiàn)了對中心距為140 nm (～λ/3.7，λ=520 nm)的雙縫樣本的超分辨放大成像，橫向分辨率約為傳統(tǒng)顯微鏡橫向分辨率極限的1.9 倍[22]。2021 年，西安電子科技大學(xué)王曉蕊教授團隊提出了一種以微球折射、反射、散射出的倏逝波作為照明光源的超分辨遠場成像系統(tǒng)，實現(xiàn)了對線寬180 nm、周期300 nm 藍光光盤線條的成像，橫向分辨率達到λ/1.68[23]。現(xiàn)有的以上三種方法都屬于局域照明方式，雖然提高了橫向分辨率，但是其產(chǎn)生的倏逝波激發(fā)效率有限，空間頻譜不夠純凈，受限于基底介質(zhì)材料的折射率，其橫向分辨率提高能力有限。另外，近些年隨著光學(xué)超構(gòu)表面的發(fā)展，為亞波長尺度對光場的振幅、相位及偏振調(diào)控提供了有效的手段[24-29]。利用超構(gòu)透鏡組實現(xiàn)超振蕩聚焦為遠場超分辨提供了一條嶄新的途徑?；诔袷幍娘@微器件設(shè)計被提出，其能在遠場實現(xiàn)任意小的焦斑分布，但隨著焦斑尺寸的減小，焦斑能量明顯降低，同時伴隨著高強度旁瓣的出現(xiàn)，從而使視場角大幅減小[28]，雖然可通過共聚焦顯微鏡利用點光源照明，點探測器收集的方法進行補償，但這將導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、工作效率低等缺點。

表面等離激元(Surface plasmon，SP)是指電磁波與金屬自由電子耦合振蕩，從而形成束縛在金屬表面的一種特殊的表面電磁波模式，具有倏逝波的縱向指數(shù)衰減特性。在光頻段，SP 能激發(fā)比自由空間光子更大的高頻波矢共振，其作為照明光時為無標(biāo)記遠場超衍射成像提供一種新思路。2004 年，中國科學(xué)院光電技術(shù)研究所羅先剛團隊發(fā)現(xiàn)了納米金屬狹縫膜層中的“異常楊氏雙縫干涉效應(yīng)(extraordinary Young’s interferences，EYI)”，即金屬薄膜上干涉條紋的周期可以縮短到小于真空波長的四分之一，首次從實驗上證明了SP 的短波長效應(yīng)[30-33]，并利用其實現(xiàn)超衍射成像光刻[30-31,34-36]?；谠撛?，2015 年，該團隊實現(xiàn)了在365 nm 波長下，單次曝光成像光刻分辨力突破22 nm 節(jié)點，為傳統(tǒng)衍射極限的1/8[37]。相比SP 光場僅局域在金屬/介質(zhì)界面的問題，一種由交替堆疊的金屬/介質(zhì)薄膜組成的特殊結(jié)構(gòu)材料展現(xiàn)出其獨特優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，這種金屬/介質(zhì)多層膜結(jié)構(gòu)不僅具有雙曲色散特性[38]，還具有特殊的光學(xué)性能，其支持交替堆疊的金屬/介質(zhì)膜層之間的SP 模式相互耦合成在自由空間中表現(xiàn)為高頻倏逝波的BPP 模式，在HMM 中實現(xiàn)超衍射傳輸，同時抑制在自由空間中為低頻傳輸波模式電磁波成分[39-42]，該特性廣泛應(yīng)用于光刻[43-44]和顯微[45-46]成像中。

本文提出利用雙曲色散超材 料(hyperbolic metamaterials，HMM)的“低頻阻斷，高頻導(dǎo)通”的空間頻率帶通濾波特性[39-40,47]，加載亞波長光柵，激發(fā)高頻體等離激元(bulk plasmon polariton，BPP)照明場。其橫向波矢為2.66k0，大于基底及波導(dǎo)材料所能提供的倏逝波波矢。當(dāng)該BPP 場照明雙縫樣本時，橫向分辨率達到λ/5.32。通過進一步改進雙曲色散超材料及激發(fā)光柵，能夠?qū)崿F(xiàn)3.86k0的BPP 場激發(fā)，分辨率可提高至λ/7.82。該方法將在生物醫(yī)學(xué)、芯片工業(yè)、材料科學(xué)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用。

2 激發(fā)高頻BPP 模式的光頻雙曲超材料結(jié)構(gòu)設(shè)計

在顯微成像的過程中，照明物體激發(fā)出散射光，其中攜帶有樣本的高頻空間結(jié)構(gòu)信息。遠場收集到的參與成像的散射光和物體空間結(jié)構(gòu)信息之間的關(guān)系可利用埃德瓦爾反射球模型[48]近似解釋，其表達為物體散射勢在照明波矢下的傅里葉空間頻譜與一個低通函數(shù)的乘積，其中低通函數(shù)為1 的取值范圍為|ks|

圖1 BPP 照明移頻超分辨成像示意圖。(a) 傳統(tǒng)照明下傅里葉分量探測范圍示意圖，其中kc 與分別為傳統(tǒng)顯微成像中照明光與散射光的橫向波矢；(b) BPP 照明下傅里葉分量探測范圍示意圖，其中keva 與 分別為BPP 照明下照明光與散射光的橫向波矢；(c) 最高可探測傅里葉分量的擴展(從紅色實線到綠色實線)，頻譜平移原理示意圖；(d) BPP 照明顯微成像示意圖Fig.1 Schematic diagram of frequency shift super-resolution imaging under BPP illumination.(a) Schematic diagram of fourier component detection range under conventional illumination，kc and are transverse wave vectors of illuminating and scattered light,respectively,under conventional illumination;(b) Schematic diagram of fourier component detection range under BPP illumination,keva and are transverse wave vectors of illuminating and scattered light,respectively,under BPP illumination;(c) Extension of the highest detectable fourier component (from red solid line to green solid line),schematic diagram of frequency shift effect;(d) Schematic of BPP illumination

BPP 激發(fā)結(jié)構(gòu)設(shè)計如圖2(a)所示，其中HMM由10 層20 nm 厚的Ag 膜和9 層50 nm 厚的SiO2膜交替堆疊而成，亞波長光柵選取周期為170 nm，厚度為40 nm，占空比為1:1 的Ag 光柵。在532 nm 波長下，Ag 和SiO2的介電常數(shù)分別為-10.18+0.83i、2.13[49]。本節(jié)內(nèi)容將利用嚴格耦合波分析方法(rigorous coupled wave analysis，RCWA)詳細分析BPP 激發(fā)結(jié)構(gòu)的濾波特性。當(dāng)一個TM 偏振光照射金屬-介質(zhì)多層膜時，如圖2(b)黑線所示，此時OTF 呈現(xiàn)一個窗口為[-3.12k0，-1.46k0]、[1.46k0，3.12k0]的空間頻譜帶通濾波通帶，意味著滿足該范圍的高頻波矢能夠在HMM 中傳播，而TE 偏振光入射時如圖2(b)紅線所示，此時整體透過率近似為0。當(dāng)加載亞波長納米激發(fā)光柵后，在TM 波照射下將激發(fā)多個級次衍射子波，其橫向波矢可由光柵公式?jīng)Q定，表達為

圖2 BPP 激發(fā)結(jié)構(gòu)。(a) BPP 激發(fā)結(jié)構(gòu)示意圖；(b) TM 與TE 偏振下Ag/SiO2 多層膜OTF；(c) -1、0 與+1 級次的OTF；(d)不同衍射級次的OTF 比值Fig.2 BPP structure.(a) Schematic of the BPP structure;(b) OTF of Ag/SiO2 multilayers in TM and TE polarization;(c) OTF for -1、0 and +1 orders;(d) The ratio of OTF for different diffraction orders

其中：m為衍射子波級次，且

正入射時，-1、0、+1 級次橫向波矢分別為-3.12k0、0k0、3.12k0，位于通帶外，無法傳播至出射界面；當(dāng)增大入射角度時提供一個更大的橫向波矢量kinc，使得-1 級次移入通帶內(nèi)，同時0 級次和+1 級次仍在通帶外，從而濾出純凈的-1 級次。圖2(c)展示了在不同角度入射下-1、0、+1 級次的OTF，可以看出在0°至90°范圍內(nèi)，-1 級次能夠被選用耦合進HMM，而其他級次相對受到抑制。49°時其他級次也被耦合進HMM 中，如圖2(d)，這是源于0 級次波矢約為1.1k0，在HMM 的OTF 中該波矢位置存在一個局域的SP 模式，因此為保證-1 級次波矢濾出純凈，選擇可用入射角度為3°到90°。

針對已定的HMM 結(jié)構(gòu)，能夠激發(fā)特定波矢BPP 光場的光柵周期及入射角度選取不唯一，其設(shè)計規(guī)律通過對OTF 的計算來發(fā)現(xiàn)。根據(jù)光柵公式，角度改變將影響kinc的取值，而光柵周期直接決定kg的大小。通過選取不同入射角度、光柵周期，共同實現(xiàn)特定波矢BPP 的激發(fā)，其中圖3(a)中黑色虛線區(qū)域為光頻濾波通帶，而在圖3(b)、3(c)相同區(qū)域OTF 大多取值接近0。為保證濾出的BPP 場的均勻，將在黑色虛線區(qū)域中選取同時滿足-1 級次的OTF 較高和0、+1 級次較低的位置。以2.66k0的BPP 為例，如圖3(a)～(c)中紅點所示，選取kinc=0.46，對應(yīng)入射角度為18°，kg=3.12，對應(yīng)光柵周期為170 nm，此時-1級次分別是0 級次與+1級次的102和105倍(圖3(d))，從而可得HMM 實現(xiàn)了濾出-1 級次的衍射子波。

圖3 (a)～(c) 分別為針對不同激發(fā)光柵波矢kg 和照明光橫向波矢kinc，-1 級次、0 級次以及+1 級次的OTF；(d) 光柵周期為170 nm，入射角度為18°，-1、0 與+1 級次的OTFFig.3 (a)～(c) The OTF of -1,0,and +1 orders for for different kinc and kg,respectively;(d) The OTF of-1,0,and +1 orders with 170 nm pitch grating at the incident angle of 18 degree

BPP 照明橫向波矢與其縱向穿透深度(Lp)一一對應(yīng)，其對應(yīng)關(guān)系可由穿透深度公式所得，如下所示:

因此，激發(fā)BPP 照明場后可通過測量穿透深度驗證其波矢純凈度。在前文提到的結(jié)構(gòu)設(shè)計下，圖4(a)中展示了入射角為18°、46°和60°時截面光強分布，根據(jù)光柵公式得到濾出的-1 級次BPP 橫向波矢分別為2.66k0、2.08k0和1.86k0。取出射界面之后的歸一化光強截圖如圖4(b)，可知BPP 場強在HMM出射界面沿著z軸方向呈指數(shù)衰減。由于BPP 的穿透深度定義為光強衰減到初始強度的1/e時的縱向距離，測量圖4(b)中三個角度的穿透深度分別為17.2 nm、23.5 nm 和26.9 nm，這與三個角度對應(yīng)橫向波矢的穿透深度恰好一致，因此也說明上述三個角度，BPP 場中的空間頻率純凈。

圖4 (a) 入射角為18°、46°和60°時截面光強分布，其中虛線為出射界面；(b) 在18°、46°和60°入射角度下BPP 照明光強衰減曲線及穿透深度Fig.4 (a) The optical intensity distributions in the x-z plane when incidence angles are 18°,46° and 60°,respectively;(b) The corresponding intensity decay curves away from the illumination surface in (a)

3 照明成像結(jié)果與分析

以雙縫物體為例，借助時域有限差分方法(finitedifference time-domain，F(xiàn)DTD)，圖5 顯示了一個Cr膜上的雙縫結(jié)構(gòu)在BPP 照明下遠場成像的建模過程與結(jié)果。雙縫結(jié)構(gòu)中心距為100 nm，單縫寬為50 nm，物鏡NA=0.85，照明波長為532 nm，根據(jù)衍射極限可知在傳統(tǒng)照明下物體無法被分辨。當(dāng)采用如圖2(a)的橫向波矢為2.66k0的BPP 照明時，圖5(a)展示了采用FDTD 方法建立模型的截面場強分布，BPP 模式在雙縫結(jié)構(gòu)處受到調(diào)制，向遠場散射。導(dǎo)出FDTD 方法模型中的遠場散射光的場分布，采用角譜衍射理論逆向計算遠場成像如圖5(b)，可知此時在BPP 照明下該雙縫能夠被分辨。本文還對遠場散射光場的頻譜分布進行分析。如圖5(c)和5(d)所示，對于雙縫結(jié)構(gòu)的頻譜，傳統(tǒng)照明下遠場可探測的散射光頻譜范圍在以原點為中心，NA/λ為半徑的區(qū)域，圖5(c)中虛線圈所示。BPP 照明下遠場散射光場分布頻譜如圖5(d)，與雙峰結(jié)構(gòu)在中心為(kBPP/2π，0)、半徑為NA/λ范圍內(nèi)的頻譜分布一致。該結(jié)果證實了頻譜向BPP 波矢方向平移了一個kBPP的距離，產(chǎn)生了移頻效應(yīng)。

圖5 中心距100 nm 雙縫結(jié)構(gòu)在2.66k0 BPP 照明下的遠場成像仿真過程與結(jié)果。(a) 采用FDTD 方法截面處監(jiān)視器記錄的BPP 結(jié)構(gòu)表面倏逝波被散射到遠場的x-z 截面光強分布；(b) 中心距100 nm 雙縫結(jié)構(gòu)的遠場成像光強分布；(c) 雙縫結(jié)構(gòu)的頻譜；(d) 遠場探測到的雙縫結(jié)構(gòu)散射光頻譜Fig.5 Far-field imaging simulation processes and results for double-slit structure with center-to center distance of 100 nm under BPP illumination with 2.66k0.(a) The intensity distribution in the x-z plane in FDTD method;(b) Far-field imaging intensity for double-slit structure;(c) Spatial spectrum of double-slit structures;(d) Spatial spectrum of scattered light for double-slit structures in the far field

在2.66k0BPP 照明下，還分析了對不同中心距雙縫的成像效果。圖6 顯示了中心距在80 nm 至120 nm時雙縫結(jié)構(gòu)的成像對比度，圖6(b)顯示了90 nm 至110 nm 中心距的雙縫成像結(jié)果，根據(jù)瑞利準(zhǔn)則，在95 至110 nm 范圍內(nèi)BPP 都能分辨雙縫結(jié)構(gòu)，說明針對BPP 照明，每個橫向波矢對應(yīng)了一個能最佳分辨的中心距分辨區(qū)間。

圖6 (a) BPP 照明下不同雙縫中心距遠場成像對比度；(b) 中心距90 nm～110 nm 的雙縫結(jié)構(gòu)遠場成像場強歸一化Fig.6 (a) The contrast of far-field imaging for double-slit structure with different center-to-center distances illuminated by BPP;(b) The normalized optical intensity for double-slit structure with different center-to-center distances in far-field imaging

更高波矢的BPP 可通過進一步改變HMM 結(jié)構(gòu)及激發(fā)光柵結(jié)構(gòu)參數(shù)。圖7 給出3.86k0的BPP 照明雙縫的結(jié)果。其中HMM 結(jié)構(gòu)為8 對Ag/SiO2多層膜，厚度為27 nm/15 nm，外加一層27 nm Ag 膜。其OTF 如圖7(a)，532 nm TM 波入射下濾波通帶為[-4.65k0，-2.15k0]和[2.15k0，4.65k0]。當(dāng)加載周期為187 nm 的激發(fā)光柵時，-1、0、+1 級次OTF 如圖7(b)所示，可知在該光柵周期下改變照明角度濾出+1 級次波矢。選取44°為入射角度時，+1 級次波矢為3.86k0。當(dāng)照明中心距為68 nm 雙縫結(jié)構(gòu)時，成像場強如圖7(c)，證明該更高橫向波矢的BPP 照明能夠顯著提高遠場成像分辨力。相比其它基于移頻原理無標(biāo)記顯微成像技術(shù)，如表1 所示，證明由BPP 提供的更大的橫向波矢kBPP照明，能夠顯著提高遠場橫向成像分辨力。

圖7 橫向波矢3.86k0 的BPP 照明超分辨成像。(a) TM 偏振入射HMM 的OTF；(b) -1、0 與+1 級次的OTF；(c) 中心距68 nm 雙縫結(jié)構(gòu)的遠場成像光強分布Fig.7 Super-resolution imaging under BPP illumination with transverse wave vector 3.86k0.(a) OTF of Ag/SiO2 multilayers in TM polarization;(b) OTF for -1、0 and +1 orders;(c) Far-field imaging intensity for double-slit structure

表1 已被報道基于移頻原理的遠場無標(biāo)記超分辨顯微成像技術(shù)主要參數(shù)Table 1 Main parameters reported based on frequency shift principle label-free far-field subdiffraction imaging techniques

4 結(jié) 論

本文首次提出利用基于HMM 的BPP 照明源的無標(biāo)記遠場超分辨顯微成像方法。利用亞波長光柵激發(fā)衍射子波，結(jié)合HMM 的空間頻譜帶通濾波特性，設(shè)計結(jié)構(gòu)濾出-1 級次衍射子波，能夠?qū)崿F(xiàn)2.66k0的BPP 模式照明場，照明雙縫結(jié)構(gòu)物體，橫向分辨力提升至λ/5.32，當(dāng)改變結(jié)構(gòu)濾出+1 級次實現(xiàn)橫向波矢為3.86k0的BPP 照明場激發(fā)，可使橫向分辨力進一步提升至λ/7.82。通過采用特殊設(shè)計的納米激發(fā)結(jié)構(gòu)結(jié)合HMM，可激發(fā)多個方向的BPP 照明場應(yīng)用于二維超分辨顯微成像。該方法具有無需標(biāo)記、實時成像且便于與傳統(tǒng)顯微鏡集成的優(yōu)勢，其將在生物醫(yī)學(xué)、芯片工業(yè)、材料科學(xué)等領(lǐng)域中具有潛在的應(yīng)用。