淺談背向彈性散射光譜測量中獲取光譜的不同實(shí)驗(yàn)方法與優(yōu)點(diǎn)

黃崇崇

（長江大學(xué)物理與光電工程學(xué)院 湖北荊州 434020）

摘要：在生物細(xì)胞檢測領(lǐng)域，光學(xué)手段正發(fā)揮愈來愈重要的作用，其中，基于彈性散射光的光學(xué)檢測方法可以在不引入外源介質(zhì)的情況下，測量分析處于自然狀態(tài)下的活細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)分布及變化。和光強(qiáng)度角度分布探測方法相比，基于彈性散射光的測量方法具有光學(xué)系統(tǒng)簡單，獲取信號精度高等優(yōu)勢。其檢測原理在于細(xì)胞內(nèi)部的多種亞細(xì)胞器不僅呈顆粒狀，而且具有與細(xì)胞質(zhì)不同的折射率，因此能夠使入射光產(chǎn)生彈性散射；通過測量入射激光在不同角度上的強(qiáng)度分布或某個(gè)固定角度上的光譜，即可完成細(xì)胞形態(tài)的檢測。

關(guān)鍵詞：散射光；光譜；實(shí)驗(yàn)；

一、光譜獲取及分析的基本原理

（一）微米顆粒的背向彈性散射光譜特性

在不考慮光吸收的情況下，微米球形顆粒的背向散射光譜呈現(xiàn)規(guī)則的周期起伏。對于折射率與周圍介質(zhì)相近的顆粒，這種特征可以由Ray-leigh-Gans近似公式來理解：

其中：L為測量距離，k=2π/λ，V為顆粒體積，m為顆粒的相對折射率（接近于1），I0為入射光強(qiáng)度，θ為散射角，G（u）=3（sin u-ucos u）/u3，x=ka定義為尺度參數(shù)，a為顆粒半徑。當(dāng)θ≈180°時(shí)，光譜的周期性主要來自于G（2x）。一般顆粒的周期性需要通過Mie散射數(shù)值計(jì)算結(jié)果進(jìn)行解讀。這種特征性周期光譜結(jié)構(gòu)使得利用彈性散射光譜獲得超衍射極限分辨的顆粒尺度信息成為可能。

然而，在實(shí)際的光譜獲取及分析中，θ實(shí)際上仍然存在一個(gè)小范圍Δθ的波動，而且平均散射角θ并不一定嚴(yán)格等于180°，它們會對光譜分析產(chǎn)生一定的影響。

對于較小的顆粒即亞微米量級的顆粒，這種影響可以忽略；但對于較大的顆粒即微米量級的顆粒，這種影響比較明顯。由式（1）可以推斷：函數(shù)G取決于x與sinθ2的乘積，當(dāng)x較大時(shí)，因θ變化產(chǎn)生的影響會比較大；另外，這也可以從Mie散射數(shù)值計(jì)算來加以理解。

比較了兩種尺度不同的聚苯乙烯微球顆粒在水溶液中其微分散射系數(shù)隨角度變化的Mie散射計(jì)算結(jié)果（即散射強(qiáng)度隨角度的變化）。這里入射波長為600nm，而聚苯乙烯和水的折射率按照各自的色散關(guān)系取值。從圖中可以看到，在θ=180°附近，直徑d=0.5μm顆粒的光強(qiáng)度變化較為平緩，而d=5μm顆粒的光強(qiáng)度變化較為明顯。圖中縱軸取對數(shù)坐標(biāo)。因?yàn)椴煌ㄩL的光散射強(qiáng)度會不同，所以顆粒越大，在θ=180°附近處的光譜變化會越明顯。

（二）基于光纖探頭的光譜獲取及分析

基于光纖探頭的顆粒背向彈性散射光譜獲取會因是否將光纖探頭插入顆粒溶液中以及光纖探頭的具體設(shè)計(jì)而有所不同。其基本原理，測量系統(tǒng)由一根傳輸光纖和一根收集光纖構(gòu)成。光纖探頭在顆粒溶液之外，距離溶液面測量高度為h1，為了避免收集到來自溶液面的鏡面反射光，兩根光纖都沿垂直方向旋轉(zhuǎn)了一個(gè)角度β（一般取～25°）。

只有在兩個(gè)光纖數(shù)值孔徑（NA）重疊區(qū)域內(nèi)的顆粒才能夠被探測到。而顆粒的位置不同，其平均散射角（π-θ）（定義為兩個(gè)光纖中心的張角）以及散射角范圍Δθ（定義為每個(gè)光纖的張角）實(shí)際上也不同。但是，當(dāng)：h2<>（ρ+η）， （2）（其中：h2代表溶液厚度，ρ和η分別代表光纖的直徑以及光纖的間距）時(shí)，可近似認(rèn)為所有顆粒的θ和Δθ相同，分別為：

由于實(shí)際測量中收集到的光強(qiáng)度反比于（h1+h3）的平方（h3代表顆粒所處的深度），h1不能過大，否則會導(dǎo)致信噪比過低，因此難以達(dá)到式（2）的條件。此時(shí)，θ和Δθ的取值分布較為復(fù)雜，給光譜的計(jì)算分析帶來了難度。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析討論

（一）實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)尺寸聚苯乙烯微球顆粒懸浮制品（PSN1005，納微科技）稀釋而成的顆粒懸浮溶液。該制品標(biāo)明的顆粒直徑的平均值為4.955μm，標(biāo)準(zhǔn)方差為0.156μm，初始質(zhì)量濃度為1%。再將溶液稀釋50倍使質(zhì)量濃度為0.02%，在此濃度下用Mie散射數(shù)值計(jì)算可得入射光波長為550nm時(shí)，散射系數(shù)為μs=0.97cm-1。在光譜測量時(shí)，將這個(gè)稀釋顆粒溶液攪拌均勻后，倒入底面直徑為35mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿（CORNING 430165）中，當(dāng)?shù)谷?mL顆粒溶液時(shí)，溶液厚度h2=1mm。在實(shí)驗(yàn)中厚度最大為h2=3mm，這時(shí)對應(yīng)的光學(xué)厚度為τ=μsh2=0.291。在這種條件下，忽略顆粒多次散射對測量的影響，認(rèn)為背向散射光等于各個(gè)顆粒的單次散射光的非相干疊加。

（二）光纖探頭測量實(shí)驗(yàn)

在光纖探頭光譜測量實(shí)驗(yàn)中，光纖探頭（FCR-7UV200-2-ME，Avantes）由6根照明傳輸光纖緊密環(huán)繞1根收集光纖構(gòu)成，光纖直徑均為200μm，數(shù)值孔徑NA均為0.22。光源采用脈沖氙燈（AvaLight-XE，Avantes），它耦合到一根600μm光纖的最大功率為180μW。

光譜儀為單通道光纖光譜儀 （AvaSpec-2048，Avantes），其測量光譜為300～900nm。本文分別取顆粒懸浮溶液厚度h2=1，2mm以及測量高度h1=3，6，9mm，共進(jìn)行了6次實(shí)驗(yàn)，得到了在3種測量高度下漫反射白色參考瓦（WS-2，Avantes）的光譜，將其記為參考光譜信號Sref；還探測了相同h2條件下去離子水的光譜信號作為背景信號（記為Sbg）。最后，獲得的顆粒背向散射信號為：

（三）透鏡系統(tǒng)測量實(shí)驗(yàn)

基于透鏡的光譜測量系統(tǒng)如，實(shí)驗(yàn)選用的光源為強(qiáng)度可調(diào)的連續(xù)氙燈 （TunablePowerArcTM1000，OBB Corporation），兩根光纖的直徑均為ρ=400μm、數(shù)值孔徑NA=0.22，實(shí)驗(yàn)測得從傳輸光纖出射的光功率為230μW。兩個(gè)透鏡的直徑均為25.4mm、焦距f=35.0mm（AC254-035-A-ML，Thorlabs Inc.），立方體分束器為非偏振型，工作在可見光波段 （CMI-BS013，Thorlabs Inc.）。設(shè)收集光纖偏離位移Δx=800μm。同樣進(jìn)行了6次實(shí)驗(yàn)，所測的顆粒懸浮溶液厚度h2分別為2，3mm，測量高度距離h1分別為9，12，15mm。測量各個(gè)信號所用的積分時(shí)間，最后在用式（9）計(jì)算光譜時(shí)將所有的信號歸一到1ms。

（四）討論

由于無法完全避免來自立方體內(nèi)表面的反射光，因此透鏡測量時(shí)背景信號所占的比例較大，同時(shí)也限制了光譜測量的積分時(shí)間。這個(gè)問題可以通過采用片狀和楔狀分束器來解決，但表面平行的片狀分束器會帶來由兩表面的反射光相互干涉形成的光譜周期結(jié)構(gòu)，從而干擾光譜分析；而兩表面有小角度夾角的楔形片狀分束器會使得光學(xué)系統(tǒng)的同軸調(diào)整變得復(fù)雜。

從另外一個(gè)方面來看，光纖探頭測量不僅具有實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)簡單、易于操作的優(yōu)點(diǎn)；而且當(dāng)設(shè)置測量高度足夠遠(yuǎn)、溶液厚度足夠小的時(shí)候，背向散射角的定義也會變得更加明確，但這些設(shè)置也會導(dǎo)致信噪比的降低。光纖探頭光譜測量的局限性在測量微米量級的顆粒時(shí)存在，但對亞微米顆粒的測量可以忽略。

三、結(jié)論

本文通過理論分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，細(xì)致地比較了光纖探頭測量和透鏡系統(tǒng)測量這兩種背向散射光譜獲取方法的優(yōu)缺點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在提取微米球形顆粒尺寸時(shí)，前一種方法簡便易行，但所獲得的光譜形狀會受到測量高度以及顆粒溶液厚度的影響；后一種方法中不存在這些問題，但其光譜測量的信噪比較低。因此，在顆粒尺寸提取精度要求不高的情況下，可以選用光纖探頭測量方法；在精度要求高時(shí)，應(yīng)選用透鏡測量方法，同時(shí)采用濾波去噪聲信號處理的手段來提高顆粒尺寸的提取精度。下一步研究將集中于如何提高透鏡系統(tǒng)光譜測量的信噪比，一種可能的途徑是用反射凹面鏡來取代透鏡，這樣可以在系統(tǒng)中避免使用光分束器，在提高信噪比的同時(shí)保留透鏡系統(tǒng)測量的優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]用于亞微米顆粒測量的后向散射光譜法[J].楊依楓，楊暉，鄭剛，劉國斌，邢世通.光子學(xué)報(bào). 2011（11）