沙利度胺對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α和血管內(nèi)皮生長因子的影響及機(jī)制研究

楊 婧，何家銳，孫紅兵，劉劍平

(1.南充市中心醫(yī)院 川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院風(fēng)濕免疫科，四川 南充 637000；2.南江縣人民醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)分泌科，四川 南江 635600；3.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，四川 南充 637000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性自身免疫性疾病，以對(duì)稱性多關(guān)節(jié)腫痛為主要表現(xiàn)，基本病理變化為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、血管翳形成，可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的破壞，最終引起關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，使患者喪失勞動(dòng)力，給家庭和社會(huì)造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。RA的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，越來越多的研究[1-2]證明多種炎癥細(xì)胞因子參與其中并貫穿RA始終。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，在RA病變關(guān)節(jié)中有大量炎癥細(xì)胞浸潤，可釋放血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1、IL-6、IL-17、IL-37和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)等多種細(xì)胞因子，促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖、滑膜血管增生及關(guān)節(jié)破壞。目前，已研制出了多種靶向細(xì)胞因子類的生物制劑用于治療RA，靶向藥物可通過抑制RA的核心致炎因子或關(guān)鍵免疫細(xì)胞功能達(dá)到緩解RA病情的作用。其中，TNF-α抑制劑是現(xiàn)有證據(jù)較為充分、應(yīng)用最早且最常用的治療RA的生物制劑，包括依那西普/注射用重組人Ⅱ型TNF受體抗體融合蛋白、英夫利西單抗、阿達(dá)木單抗、戈利木單抗等[6]。生物制劑的使用是RA治療史上的一個(gè)里程碑，但這類藥物價(jià)格昂貴，絕大多數(shù)患者不能堅(jiān)持使用。沙利度胺(Thalidomide，THD)是一種常用的抗血管生成劑和免疫調(diào)節(jié)劑，可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)抑制TNF-α、VEGF等的釋放，發(fā)揮其抗炎作用[7]。大量臨床研究[8-9]表明，THD治療RA療效確切，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究通過觀察THD對(duì)RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)增殖的影響以及對(duì)FLS和外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)分泌TNF-α和VEGF的影響，探討其治療RA的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞標(biāo)本 FLS標(biāo)本取自本院明確診斷的7例RA患者的膝關(guān)節(jié)腔積液。PBMCs標(biāo)本取自本院明確診斷的20例RA患者。所有患者診斷均符合2010年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)制定的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。本研究標(biāo)本采集經(jīng)患者同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 0.01 mol/L PBS磷酸鹽緩沖液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰?；胰蛋白酶、脂多?LPS)、二甲基亞砜(DMSO)及臺(tái)盼藍(lán)購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國R&D公司；RPMI1640培養(yǎng)基及DMEM-LG培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；THD原料藥由江蘇常州制藥廠惠贈(zèng)；四季青無支原體胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號(hào)：EHC103a.48)及人VEGF ELISA試劑盒(貨號(hào)：EHC108.48)購自欣博盛生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 THD藥液配制：將THD原料藥充分溶解于DMSO配成濃度為50 mg/ml的儲(chǔ)存液，微孔濾器過濾除菌后分裝，-20 ℃保存。臨用時(shí)加入DMEM-LG培養(yǎng)液及RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，終濃度為10、50、100、200、500 μg/ml。

1.3.2 FLS分離培養(yǎng)及THD刺激實(shí)驗(yàn)：FLS分離自RA患者的關(guān)節(jié)腔積液，使用四季青無支原體胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)獲得，用生長狀態(tài)良好的第3～5代FLS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的FLS，按細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml、1 ml/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后洗掉懸浮細(xì)胞，加入含有不同濃度THD(0、50、100、200 μg/ml)的DMEM-LG培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和LPS 5 μg/ml)，分別干預(yù)24、48 h后收集細(xì)胞液，在4 ℃條件下經(jīng)低溫離心機(jī)以5000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PBMCs提取培養(yǎng)及THD刺激實(shí)驗(yàn)：取肝素抗凝的RA患者外周靜脈血10 ml，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法獲取PBMCs。用移液管吸取該層細(xì)胞置于15 ml離心管中，用0.01 mol/L PBS洗滌細(xì)胞2次。用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%后調(diào)整細(xì)胞密度，按1×106個(gè)/ml、1 ml/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)標(biāo)本設(shè)置8個(gè)孔，加入含有不同濃度THD(0、50、100、200 μg/ml)的DRPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和LPS 5 μg/ml)，置37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48 h后收集細(xì)胞懸液。經(jīng)4 ℃低溫離心機(jī)以5000 r/min離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 MTT法檢測(cè)FLS增殖水平：取處于對(duì)數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的FLS，用0.25%胰蛋白酶消化后制成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl。待細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入濃度為10、50、100、200、500 μg/ml的THD溶液，同時(shí)設(shè)置LPS組(含LPS 5 μg/ml的DMEM-LG培養(yǎng)液)和對(duì)照組(不含LPS及THD)，每組設(shè)6次重復(fù)，分別于培養(yǎng)24、48 h后，每孔分別加入5 mg/ml的MTT液20 μl，置37 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后棄培養(yǎng)液，每孔分別加入150 μl DMSO，室溫下低速震蕩溶解，利用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)定各孔光密度(OD)值。

1.3.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：分別于加藥前及加入不同濃度藥物處理后的不同時(shí)間將細(xì)胞培養(yǎng)皿放置于倒置顯微鏡下觀察PBMCs和FLS的形態(tài)、大小、密度及生長情況變化。

1.3.6 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、VEGF水平：收集不同濃度不同作用時(shí)間的THD刺激后FLS及PBMCs培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書，采用 ELISA法檢測(cè)TNF-α及VEGF水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 FLS形態(tài)學(xué)變化 見圖1。鏡下觀察，分離的FLS培養(yǎng)24 h后開始貼壁，培養(yǎng)2～3 d后伸出生長突，呈梭形、多角形、極向排列。在含10%胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)液中培養(yǎng)的FLS分裂增殖迅速，傳至第3代時(shí)獲得純化的呈梭狀FLS。不同濃度不同作用時(shí)間的THD對(duì)FLS進(jìn)行干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生明顯改變，F(xiàn)LS貼壁能力減弱，開始出現(xiàn)突觸回縮，體積變小，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，由梭形變成圓形或不規(guī)則形，部分由貼壁變?yōu)閼腋　舛葹?00 μg/ml的THD作用48 h時(shí)變化最明顯，細(xì)胞大量脫離，出現(xiàn)大量核固縮。

圖1 FLS傳至第3代(A)及THD 500 μg/ml干預(yù)48 h后(B)形態(tài)學(xué)變化(×200)

2.2 THD對(duì)FLS增殖的影響(MTT法) 見表1。LPS 5 μg/ml對(duì)FLS增殖無影響，10 μg/ml THD對(duì)FLS有增殖抑制趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。濃度范圍在50～500 μg/ml的THD干預(yù)FLS 24、48 h后，OD值低于對(duì)照組(均P<0.05)，表明FLS增殖受到抑制。

表1 THD對(duì)FLS增殖的影響

2.3 THD對(duì)FLS分泌TNF-α及VEGF的影響 見表2。THD 50、100、200 μg/ml 干預(yù)FLS 24、48 h后，TNF-α和VEGF濃度低于對(duì)照組(均P<0.05)，表明FLS分泌TNF-α及VEGF受到抑制。

表2 THD對(duì)FLS分泌TNF-α及VEGF的影響(pg/ml)

2.4 THD對(duì)PBMCs形態(tài)學(xué)及分泌TNF-α和VEGF的影響 見表3(圖2)。不同濃度THD(50、100、200 μg/ml)分別干預(yù)PBMCs 24、48 h后，PBMCs貼壁能力減弱，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮，部分由貼壁變?yōu)閼腋?。THD 50、100、200 μg/ml 干預(yù)PBMCs 24、48 h后TNF-α和VEGF濃度低于對(duì)照組(均P<0.05)，表明PBMCs分泌TNF-α及VEGF受到抑制。

表3 THD對(duì)PBMCs分泌TNF-α及VEGF的影響(pg/ml)

圖2 PBMCs干預(yù)前(A)及THD 200 μg/ml干預(yù)48 h后(B)形態(tài)學(xué)變化(×200)

3 討 論

THD是一種人工合成的谷氨酸衍生物，1956年以非處方藥的形式作為鎮(zhèn)靜劑首先在德國上市，隨后被廣泛用于治療孕婦的妊娠反應(yīng)性嘔吐，之后因?yàn)閲?yán)重致畸性于1961年撤出市場(chǎng)。但是學(xué)者們對(duì)THD的研究并未停止，近年來人們對(duì)THD又有了新的認(rèn)識(shí)，研究發(fā)現(xiàn)該藥具有良好的抗炎、抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)的作用，在臨床上被廣泛用于治療多種免疫相關(guān)性疾病及惡性腫瘤并取得良好療效，但其具體作用機(jī)制尚不明確。大量研究證實(shí)THD可抑制TNF-α、IL-6、VEGF等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。眾所周知，腫瘤的生、長轉(zhuǎn)移與新生血管的生成密切相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF在血管生成中發(fā)揮重要的作用。文獻(xiàn)[10-14]報(bào)道，THD在淋巴瘤、小細(xì)胞肺癌、食管癌、宮頸癌等疾病中均有抑制VEGF的作用，而且THD對(duì)VEGF分泌的抑制作用呈時(shí)間劑量依賴性。因此推測(cè)，THD主要通過抑制VEGF來達(dá)到抗腫瘤新生血管生成的目的，從而起到抗腫瘤的作用。THD還可抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α[13，15]。THD聯(lián)合化療可進(jìn)一步降低多發(fā)性骨髓瘤患者的VEGF、TNF-α和IL-6水平，從而證實(shí)了THD對(duì)多發(fā)性骨髓瘤有抑制VEGF、TNF-α和IL-6生成的作用[16]。在潰瘍性結(jié)腸炎、肺間質(zhì)纖維化等疾病中，THD同樣可減低TNF-α的產(chǎn)生[17-18]。因此THD在臨床上常作為一種TNF-α抑制劑使用。

隨著對(duì)THD研究的不斷深入，其在治療風(fēng)濕性疾病方面表現(xiàn)出巨大潛力，如RA、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、白塞病、強(qiáng)直性脊柱炎和皮肌炎等[19]。THD治療銀屑病關(guān)節(jié)炎效果良好并可有效降低其血清VEGF水平，而其用于治療強(qiáng)直性脊柱炎也有十多年歷史并取得良好效果，可能得益于其對(duì)TNF-α的抑制作用及患者血清炎癥因子水平[20]。臨床研究證明，沙利度胺治療RA療效確切，但其治療RA的機(jī)制仍未明確。RA的發(fā)病機(jī)制與炎癥因子關(guān)系密切，VEGF和TNF-α是RA發(fā)病過程中最重要的兩種炎癥細(xì)胞因子，與RA滑膜血管增生和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。血管增生在RA發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，阻斷滑膜新生血管的形成可以有效緩解RA滑膜炎癥和血管翳的形成。在RA發(fā)病過程中慢性炎癥和血管增生是同時(shí)存在的，炎癥細(xì)胞因子(IL-6、IL-8、TNF-α、VEGF等)不僅可以直接誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，還可以間接促進(jìn)滑膜血管生成。THD不僅能夠減少VEGF的分泌，抑制血管生成，還可以有效阻礙 TNF-α等炎癥因子的釋放，進(jìn)而起到抗炎作用。因此推測(cè)，THD治療RA可能與其抑制TNF-α及VEGF等炎癥細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。

為了進(jìn)一步探討THD治療RA的可能機(jī)制，本研究對(duì)RA FLS及PBMCs給予不同濃度THD干預(yù)，觀察THD對(duì)RA FLS的抑制作用及對(duì)FLS、PBMCs分泌VEGF和TNF-α影響，結(jié)果顯示THD濃度范圍在50～500 μg/ml，干預(yù)24、48 h對(duì)FLS增殖均有抑制作用。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)THD濃度在50～200 μg/ml范圍均能夠明顯抑制PBMCs和FLS分泌TNF-α、VEGF。

綜上所述，THD可能通過抑制RA患者 FLS增殖，抑制FLS及PBMCs分泌VEGF、TNF-α，減少新生血管的形成，減輕炎癥反應(yīng)，從而起到治療RA的作用。但由于本研究所選取的標(biāo)本數(shù)較少，得到的研究結(jié)果可能存在一定的局限性，其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究，以期能為THD臨床治療RA提供科學(xué)的指導(dǎo)和理論依據(jù)。