番石榴葉提取物對抵抗素誘導的人膝關節(jié)軟骨細胞炎癥的緩解作用及機制研究

王海斌，王 穎，田 昕，時 亮，姬 樂

(1.陜西省人民醫(yī)院骨科，陜西 西安 710068；2.陜西省中西醫(yī)結合醫(yī)院 西安市第五醫(yī)院中醫(yī)風濕科，陜西 西安 710082)

膝骨關節(jié)炎(Knee osteoarthritis，KOA)的發(fā)病率逐漸升高。研究[1]表明，軟骨細胞死亡與細胞外基質的丟失是關節(jié)軟骨退變和KOA病情發(fā)展的關鍵。其特征包括關節(jié)軟骨進行性退變和關節(jié)炎癥[2]。治療KOA的方法有限，只能緩解疼痛或進行關節(jié)置換[3]。減輕軟骨細胞凋亡和炎性反應是有效的KOA治療手段[4]。微小RNA(microRNA，miR)-181a-5p對高糖誘導的腎小球系炎癥反應具有明顯的調控作用，提示其在細胞層面的炎癥調控中的具有一定的作用[5]。抵抗素被認為是一種與炎癥疾病相關的因子[6]，具有獨特的表達模式和生物學功能。 番石榴葉為番石榴屬植物，研究[7]表明番石榴葉提取物(Guava leaf extract，GLE)具有抗水腫、抗炎、鎮(zhèn)痛作用。本研究探討GLE對抵抗素誘導的人膝關節(jié)軟骨細胞炎癥的緩解作用，并分析其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 人膝關節(jié)軟骨細胞，20%胎牛血清加入10% DMSO混合均勻，置于4 ℃冰箱保存于本實驗室。

1.2 主要試劑 胎牛血清(貨號：11091，美國Gibco公司)；0.25%胰酶(貨號：15050065，美國Gibco公司)；青鏈霉素(貨號：V900929-100ML，上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司)；DEME培養(yǎng)基(貨號：L110KJ，美國Gibco公司)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：BMS2279，美國賽默飛公司)；CCK-8試劑盒(貨號：C0037，上海碧云天公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記IgG二抗(貨號：31460，美國賽默飛公司)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號：ab181602，英國Abcam公司)；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒(貨號：ZY90408，上海澤葉生物科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：P0011，上海碧云天公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組：將本實驗室保存的人膝關節(jié)軟骨細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8]。當細胞長至80%左右時，用0.25%胰酶進行消化傳代。將軟骨細胞分為對照組、抵抗素組(使用500 ng/ml誘導分離的軟骨細胞)及不同濃度(30、60、120 μg/ml)GLE組。

1.3.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞miR-181a-5p表達[9]：使用RNA提取試劑盒提取RNA，反轉錄后用生物系統(tǒng)Quant Studio 6 RT-PCR進行qRT-PCR，使用TBGreen?預處理ExTaqTMⅡ。擴增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，40個循環(huán)；60 ℃ 34 s。試驗重復3次。以2-ΔΔCt法測定靶基因mRNA相對表達水平。

1.3.3 CCK-8檢測細胞增殖[10]：將軟骨細胞接種于96孔板，貼壁后加入番石榴葉乙醇提取物進行處理。將細胞分為對照組、抵抗素組及30、60、120 μg/ml GLE組。培養(yǎng)24、48、72 h后在每孔中加入10 μl CCK-8試劑，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后使用酶標儀檢測490 nm波長處光密度(OD)值。

1.3.4 流式細胞術檢測細胞凋亡[11]：將軟骨細胞接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后收集細胞，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot檢測各組細胞凋亡蛋白[12]：取對數生長期軟骨細胞，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將細胞分為對照組、抵抗素組及GLE(30、60、120 μg/ml)組。培養(yǎng)48 h后RIPA裂解緩沖液分離總蛋白。通過SDS-PAGE將蛋白裂解液分離，轉移到PDVF膜上。室溫下用脫脂牛奶封閉1 h，之后加入抗白細胞介素(IL)-6(1∶2000)、抗腫瘤壞死因子(TNF)-α(1∶2000)及抗TNF-β1(1∶2000)一抗。4 ℃下孵育過夜，用1×TBST沖洗膜，然后與HRP標記的IgG(1∶3000)二抗室溫下孵育1 h。以GAPDH(1∶3000)作為內參。最后ECL曝光，掃膜儀成像。目的蛋白包括裂解形式的半胱氨酸蛋白酶蛋白-3(Cl-caspase-3)以及B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2關聯X蛋白(Bax)蛋白。

1.3.6 ELISA檢測各組細胞炎癥因子表達[13]：各組細胞相應孔中加入50 μl樣本分析緩沖液，室溫下孵育2 h，洗滌板5次。加入100 μl抗體工作液，室溫下孵育1 h。加入100 μl酶結合物，避光孵育20 min。加入顯色劑，避光孵育20 min。加入50 μl終止液，混勻后使用分光光度計測量450 nm處OD值，設置5個空白孔進行平行對照，根據標準曲線得到各指標濃度。 炎癥因子包括白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和TNF-β1。

2 結 果

2.1 各組細胞miR-181a-5p表達水平比較 見圖1。與對照組比較，抵抗素組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平升高(P<0.05)。與抵抗素組比較，60、120 μg/ml GLE組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平降低(均P<0.05)。后續(xù)實驗研究GLE濃度選擇為120 μg/ml。

注：與對照組比較，*P<0.05；與抵抗素組比較，#P<0.05

2.2 各組細胞增殖能力比較 見表1。與對照組比較，抵抗素組細胞OD值降低(P<0.05)。與抵抗素組比較，GLE組細胞OD值升高(P<0.05)。

表1 各組細胞增殖能力比較

2.3 各組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達比較 表2。與對照組比較，抵抗素組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低(均P<0.05)。與抵抗素組比較，GLE組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高(均P<0.05)。

表2 各組細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達比較

2.4 各組細胞炎癥因子水平比較 見表3。與對照組比較，抵抗素組IL-6、TNF-α及TNF-β1水平升高(均P<0.05)。與抵抗素組比較，GLE組IL-6、TNF-α及TNF-β1炎癥因子水平降低(均P<0.05)。

表3 各組細胞炎癥因子水平比較

3 討 論

KOA嚴重影響人們身體健康與生活質量，給人們甚至社會帶來負擔[14]。臨床上，多是緩解關節(jié)疼痛，維持或改善關節(jié)功能，保護關節(jié)結構，但效果不理想[15]?；颊叱３霈F關節(jié)疼痛、腫脹和其他癥狀[16]。

研究[17]發(fā)現，番石榴葉水提物能有效抑制急性炎癥。KOA也是炎癥相關疾病，因此本研究也嘗試使用番石榴葉乙醇提取物作用于人膝關節(jié)軟骨細胞，試圖發(fā)現一些KOA防治的新策略。研究表明，抵抗素水平與KOA嚴重程度、軟骨磨損程度及滑膜炎嚴重程度呈現正相關[18]。同時，通過抵抗素水平的高低也能判斷膝關節(jié)病變的嚴重程度，因此抵抗素在減緩膝關節(jié)炎癥狀方面具有一定作用。miRNA可以作為KOA有前景的生物標志物[19]。miR-181a-5p可以保護IL-β誘導的軟骨細胞損傷[20]。本研究中，與對照組比較，抵抗素組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平升高；與抵抗素組比較，60、120 μg/ml GLE組軟骨細胞miR-181a-5p表達水平降低，表明抵抗素可使人膝關節(jié)軟骨細胞miR-181a-5p表達水平升高，而GLE可降低降低抵抗素的這一作用。

KOA多發(fā)生于中老年人群中，疼痛、腫脹、限制性活動等是其主要的臨床癥狀[21]，其中的炎癥因子可以通過多種方式刺激級聯反應，觸發(fā)KOA[22]。TNF-β1可以參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展[23]。宮鳳艷[24]研究發(fā)現，TNF-β1發(fā)揮其調節(jié)細胞外基質成分沉積的作用，其表達水平升高時可加重腎臟損害。IL-6和TNF-α也是促進炎癥發(fā)展的主要因子。本研究結果表明，抵抗素組IL-6、TNF-α及TNF-β1炎癥因子水平較對照組升高，GLE組IL-6、TNF-α及TNF-β1炎癥因子水平較抵抗素組降低，表明GLE與抵抗素可能通過調節(jié)炎癥因子水平調控人膝關節(jié)軟骨細胞免疫應答。

Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行因子[25]。Bc1-2是抗凋亡蛋白，細胞凋亡信號會引起B(yǎng)c1-2表達量變化。Bc1-2可進一步調節(jié)激活Caspase-3，誘導細胞凋亡[26]。本研究證實，與對照組比較，抵抗素組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低；與抵抗素組比較，GLE組細胞凋亡率、Cl-caspase-3及Bax蛋白表達水平降低，Bcl-2蛋白表達水平升高。這些結果提示GLE與抵抗素對細胞的調控是通過對應的關鍵蛋白來完成的。但是細胞凋亡與增殖相關的靶點與通路有許多，本研究只是著眼于幾個標志性蛋白，具有一定的局限性，因此后續(xù)會從高通量入手，更廣泛地篩選GLE的作用通路與對應靶點，以進行更深入的研究。

綜上所述，GLE可緩解抵抗素誘導的人膝關節(jié)軟骨細胞炎癥，其機制可能與降低miR-181a-5p表達有關。但本研究不足之處在于，對治療機制的驗證不夠充分，后續(xù)加強完善，做更深層次的研究。