卵巢癌移植瘤裸鼠不同時(shí)期靶向超聲造影參數(shù)與癌細(xì)胞生長關(guān)系研究

王 音，楊文娟

(1.西安大興醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科,陜西 西安 710016；2.西安秦皇醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 712000)

臨床上多通過腫瘤標(biāo)志物、婦科檢查、超聲檢查聯(lián)合篩查卵巢腫瘤，其中超聲造影技術(shù)會(huì)因內(nèi)部血管、腫瘤周圍血管較敏感，同時(shí)可用于病理包塊性質(zhì)的診斷，超聲造影可在外周靜脈將造影微泡攝入，讓造影微泡在血液和血管中出現(xiàn)化學(xué)、物理效應(yīng)，出現(xiàn)散射現(xiàn)象，從而增強(qiáng)血管顯影程度[1-2]。超聲造影劑對(duì)腫塊良惡性鑒別要點(diǎn)是判斷良惡性病變的血供能力，惡性病變多有較豐富的血供來支持腫瘤的浸潤生長，而惡性腫瘤并不是均具有該鑒別點(diǎn)，使得造影劑特異度低于敏感度[3]。目前國內(nèi)應(yīng)用較廣泛的是聲諾維第三代含氟碳類氣體微泡造影劑，其可精準(zhǔn)顯示組織血流情況，用定量軟件評(píng)估造影參數(shù)。近年來，隨著超聲造影技術(shù)的不斷創(chuàng)新，靶向超聲造影提高了惡性腫瘤的診斷特異性，已應(yīng)用于臨床中，也給卵巢癌早期診斷提供了新的診斷依據(jù)及方向[4]。CXC趨化因子配體12(CXC chemokine ligand 12，CXCL12)是卵巢癌微環(huán)境中的一個(gè)重要靶點(diǎn)[5]，因此本研究制備攜帶CXCL12抗體的一種靶向超聲微泡，通過抗原-抗體反應(yīng)，結(jié)合卵巢癌腫瘤新生血管上皮中CXCL12高表達(dá)的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)卵巢癌微環(huán)境CXCL12的靶向識(shí)別，對(duì)不同時(shí)期卵巢癌移植瘤裸鼠超聲造影參數(shù)與癌細(xì)胞生長的關(guān)系進(jìn)行分析，以為卵巢癌早期診斷、靶向治療提供新的分子影像學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性裸鼠50只，18～22 g，品系為BALB/c-Nude，周齡6～8周，給予SPF級(jí)飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞(批號(hào)：CL-0215)購自武漢普諾賽生命科技有限公司；兔抗CXCL12(批號(hào)：109637)購自上海紐普生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；Sono Vue造影劑購自意大利Bracco公司；生物素化脂質(zhì)購自Life Technologies公司；鏈霉親和素購自Sigma公司；血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1)和細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)：ab270206、ab214571、ab207615、ab197751)購自英國Abcam公司；酪氨酸激酶受體2(Tie-2)和E74樣因子5(ELF5)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(批號(hào)：ml002942、ml163294)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。離心管(15、50 ml)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25 ml)、0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；微量加樣槍購自德國Ependorf公司，Mylab90彩色超聲儀購自意大利百勝公司；離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、普通顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)：采用全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、含DMEM高糖培養(yǎng)基、100 μg/ml鏈霉素、100 μg/ml青霉素)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后，將其置入含5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，隔天更換培養(yǎng)液，之后在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞生長情況進(jìn)行觀察。細(xì)胞完全融合成片或80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，每3～4 d傳代1次。

1.3.2 裸鼠皮下卵巢癌移植瘤模型制備：選取SKOV-3卵巢癌細(xì)胞傳代3代后的對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將舊培養(yǎng)基吸出后用PBS吹洗細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶液消化細(xì)胞，之后將細(xì)胞懸液吸入至離心管中離心5 min，離心速度為1000 r/min。待上清液吸出后，注入完全培養(yǎng)液，之后細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×107個(gè)/ml。乙醇消毒50只裸鼠右臀背部，之后皮下接種0.2 ml卵巢癌細(xì)胞懸液，約含有細(xì)胞1×107個(gè)/ml，隔天對(duì)瘤體生長情況進(jìn)行觀察。之后分別在造模后第10、20、30、40、50天時(shí)分別選取10只裸鼠行超聲造影檢查。

1.3.3 超聲造影劑制備：向含有聲諾維干粉末的瓶中混入磷酸緩沖液5 ml，制成微泡混懸液，觀察微泡狀態(tài)，在4 ℃冰箱中保存待用。向聲諾維中加入3 ml磷酸緩沖液和生物素化脂質(zhì)450 μg，0 ℃下孵育30 min。靜置分層后丟棄下清液，加入100 μg鏈霉親和素，0 ℃下孵育30 min。靜置分層后取上層乳白色微泡，將未結(jié)合鏈霉親和素棄去，在4 ℃條件下保存。之后在上述生物素-親和素脂質(zhì)微泡中加入1.5 μg兔抗CXCL12抗體，冰上孵育30 min。靜置分層后棄去未結(jié)合抗體，在4 ℃條件下密封保存。

1.3.4 超聲造影劑鑒定及檢測(cè)：①分別抽取制備好的兩種超聲微泡懸浮液2 ml，添加羅丹明標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG，冰上0 ℃孵育30 min，靜置分層后丟棄下清液及未結(jié)合的二抗，分別取10 μl普通、靶向微泡造影劑，觀察其微泡熒光情況。②取1 ml靶向超聲造影劑，充分混合后各抽取10 μl，再加入1 ml磷酸緩沖液，用計(jì)數(shù)儀檢測(cè)兩種微泡的平均濃度、直徑。在普通顯微鏡下觀察微泡形態(tài)，同時(shí)在熒光顯微鏡下觀察微泡結(jié)合情況，記錄熒光強(qiáng)度，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)超聲微泡攜帶CXCL12單克隆抗體的穩(wěn)定性及攜帶率。

1.4 觀察指標(biāo) ①分析超聲微泡物理性狀及熒光鑒定結(jié)果；②統(tǒng)計(jì)人卵巢癌移植造模結(jié)果；③對(duì)比造模第10、20、30、40、50天時(shí)普通與靶向超聲造影參數(shù)(峰值強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間及平均渡越時(shí)間)；④在不同時(shí)間點(diǎn)超聲造影完成后處死裸鼠，剝離腫瘤，使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒檢測(cè)血管新生分子蛋白血管內(nèi)皮生長因子受體1(VEGFR1)、酪氨酸激酶受體2(Tie-2)、細(xì)胞增殖蛋白[細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、E74樣因子5(ELF5)]、細(xì)胞侵襲蛋白[胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)、E-上皮鈣黏附素(E-cadherin)]水平；⑤分析靶向超聲造影參數(shù)與癌細(xì)胞生長的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 超聲微泡物理性狀及熒光鑒定結(jié)果 微泡肉眼觀察呈乳白色，普通顯微鏡下微泡細(xì)密、透亮、分布均勻，靜置過夜后出現(xiàn)分層。靶向與普通微泡對(duì)比，形態(tài)、大小均無差異。加入羅丹明標(biāo)記后的山羊抗IgG抗體孵育后，經(jīng)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)靶向造影微泡出現(xiàn)明亮紅色熒光，普通造影微泡無熒光。

2.2 人卵巢癌移植造模結(jié)果 本研究50只裸鼠均造模成功，造模10 d后裸鼠背部出現(xiàn)米粒樣凸起，20～30 d時(shí)腫瘤瘤體達(dá)到1 cm，40～50 d時(shí)瘤體均超過1 cm，部分瘤體出現(xiàn)壞死，40 d時(shí)部分瘤體表面出現(xiàn)紅色結(jié)痂，50 d時(shí)瘤體表面出現(xiàn)黑色結(jié)痂。

2.3 普通與靶向超聲造影造模后不同時(shí)間點(diǎn)峰值強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間、平均渡越時(shí)間比較 見表1～3。造模后不同時(shí)間點(diǎn)，普通超聲造影的峰值強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間、平均渡越時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.188、0.045、0.017，均P>0.05)；而靶向超聲造影的峰值強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間、平均渡越時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.2460、25.818、16.571，均P<0.05)。同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，靶向超聲造影的峰值強(qiáng)度和平均渡越時(shí)間高于普通超聲造影，達(dá)峰時(shí)間低于普通超聲造影(均P<0.05)。

蔡振華和足球的淵源要從2010年說起。那是中國足壇的“至暗時(shí)刻”，當(dāng)時(shí)中國足壇的三位重量級(jí)高官——謝亞龍、南勇、楊一民被捕，前兩人是中國足協(xié)原專職副主席，楊一民則是中國足協(xié)副主席。與此同時(shí)，申思、江津、祁宏、李明四名前國腳也被公安機(jī)關(guān)帶走。

表1 普通與靶向超聲造影造模后不同時(shí)間點(diǎn)峰值強(qiáng)度比較(%)

表2 普通與靶向超聲造影造模后不同時(shí)間點(diǎn)達(dá)峰時(shí)間比較(s)

表3 普通與靶向超聲造影造模后不同時(shí)間點(diǎn)平均渡越時(shí)間比較(s)

2.4 造模后不同時(shí)間點(diǎn)裸鼠血管新生分子蛋白、細(xì)胞增殖蛋白及細(xì)胞侵襲蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表4。造模后不同時(shí)間點(diǎn)，裸鼠血管新生分子蛋白(VEGFR1、Tie-2)、細(xì)胞增殖蛋白(Cyclin D1、ELF5)、細(xì)胞侵襲蛋白(IGFBP2、E-cadherin)相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 造模后不同時(shí)間點(diǎn)裸鼠血管新生分子蛋白、細(xì)胞增殖蛋白及細(xì)胞侵襲蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.5 靶向超聲造影參數(shù)與癌細(xì)胞生長的相關(guān)性 見表5。Spearman相關(guān)性分析顯示，靶向超聲造影峰值強(qiáng)度與VEGFR1、Tie-2、Cyclin D1、IGFBP2、E-cadherin水平呈正相關(guān)，與ELF5呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)；達(dá)峰時(shí)間與VEGFR1、Tie-2、Cyclin D1、IGFBP2、E-cadherin水平呈負(fù)相關(guān)，與ELF5呈正相關(guān)(均P<0.05)；平均渡越時(shí)間與VEGFR1、Tie-2、Cyclin D1、IGFBP2、E-cadherin水平呈正相關(guān)，與ELF5呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。

表5 靶向超聲造影參數(shù)與癌細(xì)胞生長的相關(guān)性

3 討 論

卵巢癌是常見的婦科生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在育齡女性中發(fā)生率較高，主要是由于此階段卵巢胚胎發(fā)育、內(nèi)分泌功能會(huì)使得組織學(xué)分類多，在以上組織學(xué)分類中上皮性腫瘤占比較高。因卵巢解剖位置較深，因此常規(guī)檢查時(shí)不能觸及，此外在起病初始患者臨床癥狀不明顯，使得卵巢癌的疾病檢出率較低，許多患者確診時(shí)已是晚期，錯(cuò)失了救治機(jī)會(huì)[6-7]。臨床上對(duì)卵巢癌患者多采用手術(shù)聯(lián)合化療的方法治療，卵巢癌1期者生存率約90%，而隨著疾病進(jìn)展，患者的復(fù)發(fā)率、耐藥率增加，預(yù)后不佳，使得其生活質(zhì)量、生存率不高[8-9]?；颊叩募膊☆A(yù)后與進(jìn)展會(huì)受到分化程度、組織類型、臨床分期等情況的影響，不同患者的疾病發(fā)展不同，結(jié)局、預(yù)后也截然不同。因此，對(duì)于卵巢癌，早期發(fā)現(xiàn)、確診并給予患者合適的治療方法非常重要[10]。

對(duì)于卵巢癌，臨床上常用的檢測(cè)方法包括腫瘤標(biāo)志物、超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像等，其中卵巢標(biāo)志物因其敏感性不佳使得手術(shù)選擇不佳，而超聲、計(jì)算機(jī)斷層掃描、磁共振成像可具體顯示腫瘤形態(tài)學(xué)，還可分析腫瘤與周邊組織相關(guān)性，確定腫瘤分期[11]。其中，超聲是廉價(jià)、安全、無創(chuàng)的卵巢腫瘤檢查方法，既可克服二維超聲局限性，又可顯示腫瘤內(nèi)部的低速和細(xì)小血管的低速血流狀態(tài)，評(píng)價(jià)腫瘤內(nèi)部和分隔上的血流情況[12-14]。因此，臨床上多通過常規(guī)超聲定性判斷，但其存在一定不足。而超聲分子成像技術(shù)可對(duì)早期腫瘤血管成像，尤其是靶向超聲較CT、正電子發(fā)射斷層掃描等有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[15]。

本研究顯示，靶向超聲造影的峰值強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間、平均渡越時(shí)間在造模后不同時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在同一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，普通與靶向超聲造影的峰值強(qiáng)度、達(dá)峰時(shí)間、平均渡越時(shí)間比較差異也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，峰值強(qiáng)度能夠反映腫瘤血管中的微泡總量[16]；達(dá)峰時(shí)間可間接反映腫瘤血供系統(tǒng)在靜脈端的阻力[17]；平均渡越時(shí)間可反映造影劑的洗脫速度[18]。靶向超聲造影與普通超聲造影相比，其更持久，更清晰，顯影強(qiáng)度更高。此外，靶向超聲造影可對(duì)血管形態(tài)特征分布進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，也可從無創(chuàng)、準(zhǔn)確分子水平定量、定性評(píng)估參與生理或病理過程中的分子。

此外，本研究中靶向超聲造影的造影參數(shù)在不同時(shí)間點(diǎn)存在差異性，其可反映腫瘤不同時(shí)間點(diǎn)的血流情況，說明隨著移植瘤生長時(shí)間的增長，瘤體體積、細(xì)胞量不斷增大，因此在移植后第20、30天時(shí)新生血供較多。而隨著時(shí)間延長，晚期新生血供已不能滿足瘤體增長速度，從而出現(xiàn)了部分壞死，也使得移植后第40、50天時(shí)的造影參數(shù)出現(xiàn)降低，因此靶向超聲造影可量化腫瘤血管的變化規(guī)律及特性，為早期定性診斷卵巢癌提供可視化方法。

綜上所述，不同時(shí)期靶向超聲造影顯影優(yōu)于普通超聲造影，超聲造影參數(shù)與癌細(xì)胞生長有一定的相關(guān)性，有助于卵巢癌的早期診斷。