麥冬多糖對衰老大鼠皮膚形態(tài)及5-羥色胺表達變化影響的實驗研究

楊 陽，施艷茹，伋 琳，劉 維

(西安大興醫(yī)院，陜西 西安 710016)

衰老是一個自然的生物學過程，在此過程中細胞和組織由于發(fā)生各種變化，會限制生物體的適應(yīng)能力，縮短壽命，可能誘發(fā)疾病和死亡[1-3]。衰老可以改變整個大腦活動，影響大腦功能的維持，包括其電和化學活動，這取決于興奮和抑制過程之間動態(tài)平衡的維持[4-6]。與衰老相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)是5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，其可在海馬和紋狀體等大腦區(qū)域的神經(jīng)末梢合成和釋放，這些區(qū)域參與各種認知過程，包括學習和記憶。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，在衰老過程中，不同的大腦區(qū)域5-HT會出現(xiàn)不同程度的降低。皮膚是人體中體積最大且與外界環(huán)境接觸面積最大的器官，皮膚老化是一個不可避免的生理過程。隨著科學技術(shù)的發(fā)展和人們生活水平的提高，許多人，尤其是女性，將日常開支的很大一部分花在了治療和預(yù)防皮膚老化的化妝品和藥品上[9]。因此，迫切需要探索與預(yù)防皮膚老化相關(guān)的分子機制。麥冬廣泛分布于東南亞，是一種著名的中藥。麥冬多糖是從麥冬提取的一種多糖，已被證明可發(fā)揮降血糖作用，且在各種實驗中也被證實為具有抗氧化活性、抗衰老、抗炎和抗腫瘤作用[10]。然而，麥冬多糖對衰老引起的皮膚老化和5-HT水平變化的影響尚未得到很好的研究。因此，本研究通過動物實驗探索麥冬多糖對衰老大鼠皮膚形態(tài)及5-HT表達變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只30周齡成年雄性SD大鼠(320～350 g)購自省陜西省疾病預(yù)防控制中心，許可證號：XYXK(陜)2018-009。將動物養(yǎng)在塑料籠中，在溫度(22±3)℃和濕度50%～55%條件下飼養(yǎng)，光/暗循環(huán)為12 h，喂食標準顆粒飼料，允許自由飲水。

1.2 實驗分組與模型建立 將大鼠分為對照組、模型組和麥冬多糖組，每組10只。于大鼠腹腔注射500 mg/(kg·d) D-半乳糖0.9%氯化鈉溶液制備衰老模型。監(jiān)測大鼠行為，當大鼠出現(xiàn)進食減少、精神萎靡、行動遲緩和毛色無光澤，說明建模成功。對照組為常規(guī)飼養(yǎng)大鼠，給予0.9%氯化鈉溶液。在麥冬多糖組，給予模型大鼠150 mg/(kg·d)麥冬多糖灌胃，連續(xù)40 d。

1.3 腦組織中5-HT水平檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(批號：YB-20435，北京伊萊瑞生物科技有限公司)測定大鼠腦中5-HT的水平。麻醉處死大鼠后，將腦組織在2 ml 0.1 mol/L高氯酸中勻漿，以5000 g 離心20 min，取上清。將分配的抗原標準品和樣品添加到預(yù)涂有一抗的96孔板中，每孔加入生物素偶聯(lián)試劑和酶偶聯(lián)試劑后，37 ℃孵育30 min，蒸餾水洗滌5次。在顯色反應(yīng)的30 min內(nèi)，使用酶標儀在450 nm處讀取吸光度。

1.4 皮膚抗氧化活性物質(zhì)檢測 將皮膚組織在冰上勻漿并以3500 r/min 離心，收集樣品上清液用于超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的檢測，試劑盒(批號：mlsh0698、ml037079-1和mlsh0370)均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.5 皮膚勻漿組織中細胞因子水平檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒測定大鼠皮膚勻漿組織中白細胞介素-6(IL-6)、IL-8、核因子-κB(NF-κB)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平。其中，IL-6、IL-8和GM-CSF檢測試劑盒(批號：RAB0311、RAB1149和RAB0102)均購自美國默克公司；NF-κB檢測試劑盒(批號：BLL101028E)購自上海佰利萊生物科技有限公司；MMP-1檢測試劑盒(批號：BJ-R63436)購自上海邦景實業(yè)有限公司。

1.6 組織病理學染色 將皮膚組織在10%福爾馬林中固定24 h，并分別進行HE染色和Masson染色，使用數(shù)碼三目相機顯微鏡(麥克奧迪DM-BA400-B)和圖像分析軟件 Image-Pro Plus 6.0分析染色切片。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠腦組織中5-HT水平比較 見表1。模型組5-HT水平較對照組降低，麥冬多糖組5-HT的水平較模型組升高(均P<0.05)。

表1 三組大鼠腦組織中5-HT水平比較(ng/ml)

2.2 三組大鼠皮膚組織抗氧化活性物質(zhì)水平比較 見表2。模型組皮膚勻漿組織抗氧化活性物質(zhì)SOD、CAT和GSH-Px水平較對照組降低，麥冬多糖組SOD、CAT和GSH-Px水平較模型組升高(均P<0.05)，提示麥冬多糖能提高模型大鼠體內(nèi)抗氧化物質(zhì)活性。

表2 三組大鼠皮膚組織抗氧化活性物質(zhì)水平比較

2.3 三組大鼠皮膚勻漿組織中細胞因子水平比較 見表3。模型組IL-6、IL-8和NF-κB水平較對照組升高，麥冬多糖組IL-6、IL-8和NF-κB水平較模型組降低(均P<0.05)，提示麥冬多糖能抑制模型大鼠體內(nèi)炎癥因子表達。模型組MMP-1和GM-CSF水平較對照組升高，麥冬多糖組MMP-1和GM-CSF水平較模型組降低(均P<0.05)，提示麥冬多糖可增加大鼠衰老皮膚的抗皺和抗老化活性。

表3 三組大鼠皮膚勻漿組織中細胞因子水平比較

2.4 三組大鼠染色結(jié)果比較 見表4。使用HE染色觀察皮膚上皮細胞的病理損傷，通過Masson染色確定皮膚膠原蛋白的分布。結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組可觀察到表皮結(jié)構(gòu)不完整、真皮膠原纖維少而變細、真皮膠原纖維排列紊亂、真皮炎癥細胞浸潤等病理變化，而麥冬多糖組可顯著緩解模型組的病理變化。模型組皮膚纖維組織表達面積百分比和Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值較對照組降低，麥冬多糖組皮膚纖維組織表達面積百分比和Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值較模型組升高(均P<0.05)。

表4 三組大鼠纖維組織表達面積百分比和Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白比值比較

3 討 論

麥冬是一種廣泛使用的傳統(tǒng)中草藥，多年來一直被用來緩解糖尿病和心血管疾病的癥狀。多糖是麥冬的主要成分，提取率高達35%。麥冬富含多糖，這可能與其生物活性有關(guān)，如抗糖尿病活性、心血管保護、免疫調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、抗肥胖活性、對干燥綜合征的治療作用等[11-13]。作為實驗室常用的動物衰老模型，D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型可以模擬大腦、肝臟、腎臟、皮膚、骨骼等多個器官的衰老[14-15]。D-半乳糖誘導(dǎo)可導(dǎo)致嚴重的皮膚損傷、細胞變化以及DNA損傷。在本研究中，我們選擇了D-半乳糖來建立皮膚老化模型。結(jié)果表明，D-半乳糖建立的模型組皮膚組織出現(xiàn)明顯的病理變化，膠原分布下調(diào)，Ⅰ型膠原減少，Ⅲ型膠原增加，抗氧化能力下降，表明成功構(gòu)建了D-半乳糖誘導(dǎo)的皮膚老化模型。此外，使用麥冬多糖可以緩解上述衰老模型的病理變化，可見麥冬多糖能有效延緩皮膚衰老。

在本研究中，通過估計非酶促抗氧化劑GSH-Px以及抗氧化酶SOD和CAT的水平來測量暴露于D-半乳糖的皮膚樣品的抗氧化活性。與對照組相比，模型組大鼠皮膚組織CAT、GSH-Px和SOD活性顯著降低。CAT是一種血紅素酶，負責將H2O2還原為H2O和O2[16]。CAT水平因氧化應(yīng)激而降低，這表明自由基生成和抗氧化系統(tǒng)之間的不平衡。然而，在麥冬多糖治療情況下，與模型組相比，這種酶的平均活性顯著增加。SOD通過增加其歧化來清除超氧陰離子，與對照組相比，在D-半乳糖誘導(dǎo)后顯著降低，使皮膚易受氧化損傷，然而在麥冬多糖治療的情況下，SOD的平均濃度顯著升高，表明麥冬多糖可清除D-半乳糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧。GSH-Px被認為是細胞產(chǎn)生的主要內(nèi)源性抗氧化劑之一[17]，研究發(fā)現(xiàn)麥冬多糖治療能顯著提高模型大鼠體內(nèi)的GSH-Px水平，證明麥冬多糖有較好的抗氧化性[18]。在本研究中，D-半乳糖暴露導(dǎo)致炎癥標志物(IL-6、IL-8和NF-κB)顯著增加，經(jīng)過麥冬多糖治療后在模型組和麥冬多糖組之間檢測到炎癥標志物水平的差異具有統(tǒng)計學意義。炎癥介質(zhì)通過促進真皮成纖維細胞凋亡、增強MMP-1的表達和阻止前膠原蛋白的表達來誘導(dǎo)膠原蛋白降解。D-半乳糖刺激ROS和自由基的產(chǎn)生，從而上調(diào)MMPs的產(chǎn)生。MMP-1負責降解膠原蛋白和彈性蛋白，導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)細紋和皺紋。為了研究麥冬多糖對衰老老化的保護作用，本研究分析了MMP-1的水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組中MMP-1的平均濃度升高，而麥冬多糖可顯著抑制MMP-1水平，這證實了麥冬多糖具有優(yōu)越的抗皺活性。皮膚衰老會導(dǎo)致角質(zhì)形成細胞分泌IL-1，從而觸發(fā)GM-CSF分泌，而分泌的IL-1和GM-CSF滲入真皮并觸發(fā)成纖維細胞刺激其表達神經(jīng)內(nèi)肽酶，從而導(dǎo)致成纖維細胞周圍的彈性纖維斷裂，造成彈性纖維的惡化，這種級聯(lián)反應(yīng)會導(dǎo)致皮膚失去彈性并形成皺紋。研究[19]表明，動物皮膚衰老會顯著降低其彈性，從而導(dǎo)致皺紋的形成。D-半乳糖誘導(dǎo)后，GM-CSF水平顯著高于對照組，麥冬多糖治療后則抑制了GM-CSF水平的升高。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在衰老行為和其他一些功能變化中起主導(dǎo)作用。有研究闡明了膽堿能、血清素能和多巴胺能系統(tǒng)的功能，這些系統(tǒng)與記憶和注意力的調(diào)節(jié)有關(guān)[20]。大腦中的去甲腎上腺素缺乏會導(dǎo)致抑郁樣癥狀的發(fā)展，5-HT神經(jīng)元大量投射到與學習和記憶有關(guān)的幾個大腦區(qū)域，如海馬、中隔和前額葉皮層，增加5-HT水平通常會增強突觸可塑性并促進學習和記憶。相反，消耗中樞5-HT可能導(dǎo)致學習和記憶的嚴重缺陷。本研究中發(fā)現(xiàn)，衰老大鼠腦組織中5-HT水平降低，而麥冬多糖能顯著改善D-半乳糖誘導(dǎo)的5-HT缺陷。相關(guān)研究表明，使用麥冬提取物可以改善D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠的學習和記憶障礙，究其原因，麥冬多糖可能增強大腦的抗氧化能力、降低誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和一氧化氮水平以及增加大腦中的5-HT水平來，提示麥冬多糖可促進衰老大鼠大腦5-HT分泌并改善衰老引起的學習和記憶障礙。

綜上所述，麥冬多糖通過發(fā)揮抗氧化活性改善因衰老引起的5-HT表達下降，抑制細胞凋亡，延緩皮膚衰老。