CXC趨化因子配體10在癲癇大鼠和細胞炎癥反應(yīng)中的作用及機制研究

楊 謙，曹冰清，韓 征，薛延莉，康 濤

(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安 710068)

癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，表現(xiàn)為自發(fā)性反復(fù)發(fā)作。持續(xù)的癲癇發(fā)作能產(chǎn)生腦部持久性改變，并出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)生物學、認知、心理學以及社會等方面的后果，嚴重威脅著人類的健康[1-2]。雖然大多數(shù)癲癇患者可以通過目前的抗癲癇策略完全控制癲癇發(fā)作，但大約30%患者對可用的抗癲癇治療沒有反應(yīng)，從而發(fā)展為難治性癲癇[3]。癲癇的發(fā)生給社會帶來了巨大的負擔，因此迫切需要提高對癲癇發(fā)生的分子機制的理解，從而制定有效的癲癇治療策略。

神經(jīng)炎癥在癲癇發(fā)生中至關(guān)重要，臨床患者分析證明了炎癥關(guān)鍵介質(zhì)的基因表達與癲癇患者的癲癇發(fā)作頻率間存在顯著相關(guān)性[4]。不同免疫介導(dǎo)的炎癥細胞因子被認為是神經(jīng)可塑性變化、癲癇發(fā)作閾值降低和神經(jīng)元間異常神經(jīng)元放電延長的誘導(dǎo)劑[5]。因此，調(diào)節(jié)炎癥因子的表達可能為治療癲癇開辟新的思路。CXC趨化因子配體10(CXC chemokine ligand-10，CXCL10)作為一種趨化因子，參與多種炎癥和免疫反應(yīng)。在以癲癇為常見表現(xiàn)的遺傳性疾病結(jié)節(jié)性硬化癥中，施用CXCL10抑制劑可降低癲癇發(fā)作頻率[6]。對兒童癲癇患者進行RNA-seq分析后發(fā)現(xiàn)，CXCL10 RNA表達上調(diào)[7]。然而，CXCL10在癲癇中的作用及機制尚不明確。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)作為介導(dǎo)免疫與炎癥的重要分子，被認為能夠促進癲癇的發(fā)生[8]。一項臨床調(diào)查[9]顯示，癲癇患者中TLR4高表達，且其高表達水平與癲癇發(fā)作的持續(xù)時間延長和發(fā)作頻率增加有關(guān)。因此，TLR4也被認為是癲癇的新型標志物[10]。TLR4/核因子(Nuclear factor，NF)-κB是經(jīng)典的炎癥信號傳導(dǎo)途徑，參與多種疾病的調(diào)節(jié)。研究[11]表明，抑制TLR4/NF-κB通路可預(yù)防鋰-毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇的發(fā)生。本研究旨在利用體內(nèi)和體外癲癇模型探究CXCL10在癲癇中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年10周齡雄性Sprague-Dawley大鼠20只，體重210～260 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。每籠2～3只，在室溫、自然光環(huán)境下給予充足的食物及水。

1.2 主要試劑 人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y購自上海中橋新舟生物科技有限公司；DMEMF12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；氯化鋰、匹羅卡品、視黃酸、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國Sigma公司；SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ購自大連寶生物工程有限公司； TRIzol試劑(批號：15596018)購自美國invitrogen公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；山羊抗小鼠IgG(批號：ab150113)和辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(批號：ab150077)購自美國Abcam公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、顯色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠分組與癲癇模型制備：將20只大鼠隨機分為對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，每30 min重復(fù)給予匹羅卡品10 mg/kg，直到大鼠癲癇發(fā)作。對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液。在癲癇持續(xù)狀態(tài)開始后約60 min，注射安定10 mg/kg以終止癲癇持續(xù)發(fā)作。隨后對大鼠進行安樂死，剖取顳葉組織凍存。

1.3.2 癲癇細胞模型制備：用DMEMF12培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細胞(空白組)，視黃酸(RA)處理7 d誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞分化，無鎂細胞液處理3 h誘導(dǎo)細胞發(fā)電，建立癲癇細胞模型(SH-5Y5Y組)。

1.3.3 癲癇模型細胞轉(zhuǎn)染及干預(yù)：按照LipofectamineTM3000說明書將過表達空白載體(pcDNA3.1)、CXCL10過表達載體(pcDNA3.1-CXCL10)、干擾陰性對照(si-RNA)和CXCL10干擾RNA (si-CXCL10)分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞中。在TLR4抑制劑TAK-242和激動劑脂多糖(LPS)處理實驗中，按照LipofectamineTM3000說明書將si-RNA和si-CXCL10轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細胞中，24 h以后使用TAK-242(si-CXCL10+TAK-242組)和LPS(si-CXCL10+LPS組)處理12 h，然后各組細胞置于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)，進行后續(xù)試驗。

1.3.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測CXCL10基因表達：利用TRIzol試劑提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫公布的基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計PCR引物。CXCL10正向引物序列為5’-TGAGAGCGAACATCCCAACAA-3’,反向引物序列為5’-TGTCCCCACGATCTTCATCTT-3’，GAPDH為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA模板2 μl，上正反向引物各0.5 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μl，無菌去離子水7 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性 30 s，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸40 s，共 30 個循環(huán)。同一實驗重復(fù)3次，通過2-△△Ct計算相對表達量。

1.3.5 免疫印跡法檢測TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白表達：用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取顳葉組織或細胞蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度并進行歸一化處理。將樣品上樣到加樣孔內(nèi)進行SDS-PAGE電泳，被分離的蛋白繼續(xù)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進行轉(zhuǎn)膜。使用5%脫脂奶粉封閉蛋白，加入一抗孵育過夜。用TBST清洗后，加入二抗孵育1.5 h。使用化學發(fā)光底物可視化條帶，利用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶。

1.3.6 ELISA法檢測炎癥因子水平：將收集的細胞培養(yǎng)液置于4 ℃離心機中，以1000 r/min離心20 min，取上清液為待測樣品備用。按照ELISA 試劑盒說明書進行檢測，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，顯色后用酶標儀在450 nm波長處測量各孔光密度(OD)值，繪制標準曲線，計算各組樣品中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-8水平。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠及兩組細胞CXCL10 mRNA表達水平比較 見圖1。模型組大鼠CXCL10 mRNA表達水平高于對照組(P<0.05)。SH-5Y5Y組細胞CXCL10 mRNA水平高于空白組(P<0.05)。

注：左圖中，與對照組比較，*P<0.05；右圖中，與空白組比較，#P<0.05

2.2 癲癇細胞模型轉(zhuǎn)染后CXCL10 mRNA及炎癥因子表達水平比較 見圖2。過表達CXCL10升高SH-SY5Y細胞CXCL10 mRNA表達水平，而抑制CXCL10降低了SH-SY5Y細胞CXCL10 mRNA表達水平(均P<0.05)。此外，過表達CXCL10使SH-SY5Y細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6和IL-8水平顯著上升，si-CXCL10使SH-SY5Y細胞TNF-α、IL-6和IL-8水平顯著下降(均P<0.05)。

注：與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；與si-RNA組比較，#P<0.05

2.3 癲癇細胞模型轉(zhuǎn)染后TLR4和NF-κB蛋白表達水平比較 見圖3。過表達CXCL10促進了TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白表達，而敲低CXCL10可抑制TLR4和NF-κB p-p65/p65蛋白水平(均P<0.05)。

注：左圖為蛋白電泳圖。右圖中，與pcDNA3.1組比較，*P<0.05；與si-RNA組比較，#P<0.05

2.4 癲癇模型細胞經(jīng)TLR4抑制劑和激動劑處理后炎癥因子表達水平比較 見圖4。與si-CXCL10組比較，經(jīng)LPS處理的癲癇模型細胞TNF-α、IL-6、IL-8水平上升，而經(jīng)TAK-242處理的癲癇模型細胞TNF-α、IL-6、IL-8水平顯著下降,LPS處理顯著逆轉(zhuǎn)了由si-CXCL10導(dǎo)致的炎癥因子水平的降低(均P<0.05)。

注：與si-RNA組比較，*P<0.05；與si-CXCL10組比較，#P<0.05

3 討 論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，是一種大腦神經(jīng)元異常電活動的慢性疾病，特征為無端反復(fù)發(fā)作的痙攣[12-13]。癲癇的發(fā)病機制十分復(fù)雜，包括氧脅迫、谷氨酸興奮毒性、鈣超載等[14]。從病理變化開始到癲癇發(fā)展以及癲癇持續(xù)過程會伴隨著基因表達改變、炎癥、蛋白質(zhì)產(chǎn)生和連接變化，這些都可能是藥物抑制癲癇發(fā)生的目標[15]。越來越多的證據(jù)表明，炎癥在人類癲癇和癲癇實驗?zāi)Ｐ椭衅鹬陵P(guān)重要的作用[16]。炎癥基因網(wǎng)絡(luò)的某些成分可能成為治療癲癇一個新的靶點。

CXCL10是一種參與多種炎癥和免疫反應(yīng)的趨化因子。已有研究[17-18]表明，CXCL10廣泛參與各種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，如腦型瘧疾和阿爾茨海默病。降低CXCL10水平并服用阿托伐他汀可緩解腦瘧疾[19]。此外，在患創(chuàng)傷性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病的小鼠中CXCL10表達量較高[20]。然而，暫無確切的研究證明CXCL10在癲癇中的作用。最近的一項研究[21]發(fā)現(xiàn)，CXCL10在癲癇小鼠模型的側(cè)海馬膠質(zhì)細胞中上調(diào)，并可能作為癲癇發(fā)生的潛在上游靶點。這提示CXCL10可能參與癲癇的進展。在本研究中，我們證明了CXCL10在體內(nèi)和體外癲癇模型中表達水平均上調(diào)，而敲低CXCL10顯著抑制了癲癇細胞中炎癥細胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8)的表達，降低了神經(jīng)炎癥。

研究[22]表明，TLR4/NF-κB信號在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有重要作用并調(diào)節(jié)癲癇進展。抑制TLR4/NF-κB信號通路有助于促進BV-2小膠質(zhì)細胞向M2型極化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，抑制癲癇的發(fā)生[23]。此外，Kleen等[24]發(fā)現(xiàn)死亡細胞釋放的高遷移率族蛋白B1(HMGB1)可激活TLR4，導(dǎo)致大鼠模型和人類慢性癲癇發(fā)作，而抑制TLR4可以減輕癲癇發(fā)作。Iori等[25]也發(fā)現(xiàn)在動物模型中激活TLR4通路會增加癲癇發(fā)作的易感性。因此，靶向炎癥信號通路可能成為一種當前對癥療法中控制癲癇發(fā)作的補充方法，特別是在常規(guī)治療難以見效的癲癇形式中[26]。在本研究中，TLR4激活劑LPS顯著逆轉(zhuǎn)了由si-CXCL10導(dǎo)致的炎癥因子水平降低，而si-CXCL10和TAK-242的雙重抑制使炎癥因子水平達到最低。因此，我們認為CXCL10能夠通過TLR4/NF-κB信號通路影響炎癥細胞因子的表達。

綜上所述，CXCL10在體外和體內(nèi)癲癇模型中的表達水平均顯著上升，低表達CXCL10通過抑制TLR4/NF-κB信號通路降低了炎癥細胞因子水平，從而在癲癇炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究證明了CXCL10可能是一種治療癲癇的新靶點，為研究和治療癲癇提供了新的理論基礎(chǔ)。