裸鼠肺腺癌移植瘤組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1α蛋白、血清蛋白和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體1蛋白表達(dá)及意義

孔凡龍，吳 寶，信洪武(美國(guó))，白玉勤

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；2.赤峰學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；3.長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)部分子醫(yī)學(xué)中心腫瘤學(xué)研究室，湖北 荊州 434023；4.赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；5.赤峰市腫瘤醫(yī)院 赤峰學(xué)院第二附屬醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

在動(dòng)物切除組織的標(biāo)本制作過(guò)程中，傳統(tǒng)方法制備標(biāo)本時(shí)容易產(chǎn)生人工假象[1]。活體冷凍技術(shù)(In vivo cryotechnique，IVCT)是日本山梨大學(xué)野伸一教授所研究開(kāi)發(fā)的技術(shù)，反映的是活體狀態(tài)下細(xì)胞和組織的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能，克服了傳統(tǒng)標(biāo)本制作方法中缺血、缺氧所造成的缺陷[2]。我們第一次清晰地觀測(cè)到血清蛋白表達(dá)的分布情況，是應(yīng)用IVCT技術(shù)在異種移植人非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)模型上，提出了不同分子量的血清蛋白在細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)不同，闡明了功能性血管與血清蛋白、血管生成因子的密切關(guān)系[3-4]。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)蛋白表達(dá)與NSCLC患者血管生成及預(yù)后不良密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)與腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性有關(guān)[6]。但是我們的前期研究證明，在大細(xì)胞肺癌移植瘤組織中HIF-1α蛋白表達(dá)與功能性和非功能性血管數(shù)目無(wú)關(guān)，而與腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性有關(guān)。為了進(jìn)一步研究肺腺癌移植瘤組織中HIF-1α蛋白與血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系，開(kāi)展了本研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自日本SLC株式會(huì)社的7～8周裸鼠(BALB/c-nu/nu)20只。動(dòng)物模型建立和飼養(yǎng)在日本山梨大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的SPF條件下進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)由日本山梨大學(xué)動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 肺癌細(xì)胞系 A549細(xì)胞株由日本東北大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所提供[7]。在日本山梨大學(xué)醫(yī)學(xué)部解剖組胚室的細(xì)胞培養(yǎng)室，以含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)[3-4]。

1.3 主要試劑 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的羊抗鼠血清蛋白(批號(hào)：ZA16388和20062916)、兔抗人HIF-1α(批號(hào)：20101991)、顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(批號(hào)：221020513)；英國(guó)Abcam公司生產(chǎn)的兔抗鼠淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體1(Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor-1，LYVE-1)單克隆抗體(批號(hào)：615-478-250)；美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)的細(xì)胞核TOPRO-3染色試劑(批號(hào)：815-361-120)；與第一抗體種屬匹配的第二抗體是Alexa 488和Alexa 546標(biāo)記的兔抗羊IgG(批號(hào)：645-320-111和981-456-715)，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)的羊抗兔IgG(批號(hào)：220324S409b)。

1.4 腫瘤移植 收集傳代培養(yǎng)后的A549細(xì)胞約5×106個(gè)，接種到裸鼠背部皮下。接種后每周2次使用電子天平稱量裸鼠體重，觀察裸鼠進(jìn)食、飲水以及腫瘤的生長(zhǎng)情況，應(yīng)用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑和短徑并記錄。腫瘤體積為1000 mm3時(shí)準(zhǔn)備制備標(biāo)本[4]。

1.5 標(biāo)本制備 IVCT制備標(biāo)本順序[4]：乙醚麻醉裸鼠→背部皮膚剪開(kāi)→呈現(xiàn)移植瘤→移植瘤被液氮里制冷的異戊烷-丙烷冷凍液(-193 ℃)瞬間冷凍固定→移植瘤在液氮里用牙科電鉆取下→干冰(-80 ℃)預(yù)冷的2%多聚甲醛-丙酮液冷凍置換[2]。冷凍置換逐漸升溫順序：2%多聚甲醛-丙酮液的冷凍標(biāo)本-193 ℃→-80 ℃→-20 ℃→-10 ℃→-4 ℃→室溫。聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物和石蠟包埋移植瘤組織，用冰凍切片機(jī)和石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，染色后在光學(xué)和熒光顯微鏡下觀察。

1.6 HE與免疫組織化學(xué)(IHC)染色 含MAS的黏附載玻片上黏附3 μm厚度的連續(xù)石蠟切片。一部分切片進(jìn)行HE染色，一部分切片用于IHC染色。IHC染色采用ABC法。IHC染色順序：脫蠟(二甲苯)→水化(梯度乙醇)→PBS清洗→1%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性→2%魚(yú)明膠溶液封閉→PBS漂洗3次→分別滴加一抗羊抗鼠血清白蛋白(Albumin)、免疫球蛋白M(IgM)、HIF-1α和LYVE-1單克隆抗體→4 ℃冰箱孵育(過(guò)夜)→PBS液3次沖洗→羊抗兔IgG或者Alexa 488、546二抗→滴加細(xì)胞核染色用的TOPRO-3試劑→室溫孵育1 h。用蘇木精和甲基綠染色DAB顯色的細(xì)胞核，水化(梯度乙醇)后二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。每次染色均采用空白對(duì)照(PBS)和自身陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照是在同一切片上與試驗(yàn)對(duì)象比較，血管腔和間質(zhì)中的Albumin應(yīng)為陽(yáng)性，免疫細(xì)胞質(zhì)或血管腔中的IgM應(yīng)為陽(yáng)性，HIF-1α在腫瘤細(xì)胞膜漿、核內(nèi)應(yīng)為陽(yáng)性，LYVE-1在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞漿應(yīng)為陽(yáng)性。判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)IHC染色程度，分為強(qiáng)陽(yáng)性()、中等陽(yáng)性()和弱陽(yáng)性(+)，無(wú)染色為陰性(-)。在同一切片中統(tǒng)計(jì)分析A549肺腺癌細(xì)胞異種移植瘤組織(包括血管、腫瘤基質(zhì)和腫瘤細(xì)胞外基質(zhì))中的Albumin和IgM蛋白表達(dá)水平。癌細(xì)胞細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中的HIF-1α蛋白呈棕色顆粒狀染色為陽(yáng)性，無(wú)染色為陰性。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿或細(xì)胞膜中LYVE-1蛋白呈棕色為陽(yáng)性，未染色為陰性。血管腔內(nèi)Albumin和IgM蛋白呈中-強(qiáng)度陽(yáng)性，此血管周圍細(xì)胞外基質(zhì)IgM蛋白呈陰性，判定為功能性血管。LYVE-1蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性則判定為淋巴管。計(jì)數(shù)功能性血管和淋巴管時(shí)，用低倍數(shù)物鏡觀察，再用高倍數(shù)物鏡隨機(jī)數(shù)10個(gè)視野，計(jì)算平均值，計(jì)算功能血管和淋巴管密度(個(gè)/HPF，HPF為高倍視野)。

2 結(jié) 果

2.1 A549移植瘤組織HE染色和HIF-1α蛋白IHC染色結(jié)果 見(jiàn)圖1。在HE切片上，腺癌浸潤(rùn)組織中可見(jiàn)擴(kuò)張的血管和血管內(nèi)的紅細(xì)胞。在IHC切片上，HIF-1α蛋白陽(yáng)性細(xì)胞在腫瘤周圍和間質(zhì)某細(xì)胞漿呈棕黃色著色，而腫瘤細(xì)胞無(wú)著色，即HIF-1α蛋白在侵襲部位和非侵襲部位腫瘤細(xì)胞中均呈陰性表達(dá)。

圖1 A549移植瘤組織HE染色(A)和HIF-1α蛋白IHC染色(B)結(jié)果(×200)

2.2 A549移植瘤組織Albumin和IgM蛋白染色結(jié)果 見(jiàn)圖2、3。Albumin在血管、癌周纖維結(jié)締組織和細(xì)胞外基質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性至中度陽(yáng)性。在侵襲部位，腫瘤周圍血管和結(jié)締組織中的IgM蛋白呈中度陽(yáng)性，而癌細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)中為陰性；在非侵襲性組織部位，血管和腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中IgM蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性至中陽(yáng)性。此外，在雙免疫熒光染色中，Albumin在血管、癌周圍纖維結(jié)締組織和細(xì)胞外基質(zhì)中呈中強(qiáng)陽(yáng)性(綠色)，IgM蛋白在血管和癌周圍纖維結(jié)締組織中呈中陽(yáng)性(紅色)，在癌周圍細(xì)胞外基質(zhì)中呈陰性。在A549移植瘤侵襲組織內(nèi)部，IgM蛋白除了在免疫細(xì)胞漿呈強(qiáng)陽(yáng)性外，在血管腔內(nèi)與Albumin蛋白共同陽(yáng)性表達(dá)(功能性血管)。半定量分析顯示，每標(biāo)本同一部位連續(xù)10張切片的A549移植瘤侵襲組織Albumin和IgM蛋白呈陽(yáng)性的功能性血管密度高于非侵襲組織[(14.80±1.03)個(gè)/HPF與(3.50±0.53)個(gè)/HPF，P<0.01]。

2.3 A549移植瘤組織LYVE-1蛋白染色結(jié)果 見(jiàn)圖4。LYVE-1蛋白在肺腺癌侵襲組織和非侵襲組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞漿呈深棕黃色顆粒狀著色，為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。LYVE-1蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性的淋巴管呈不規(guī)則形狀，管壁薄，內(nèi)含淋巴液和淋巴細(xì)胞。LYVE-1蛋白還在某梭形細(xì)胞漿呈淺棕黃色顆粒狀著色，為弱陽(yáng)性表達(dá)。半定量分析結(jié)果顯示，每標(biāo)本同一部位連續(xù)10張切片的A549移植瘤侵襲組織LYVE-1蛋白呈陽(yáng)性的淋巴管密度高于非侵襲組織[(25.90±4.43)個(gè)/HPF與(3.60±0.52)個(gè)/HPF，P<0.01]。

3 討 論

局部侵襲是影響惡性腫瘤如甲狀腺乳頭狀癌[8]、肺腺癌[9]、結(jié)直腸癌[10]、膀胱尿路上皮癌[11]等患者預(yù)后的主要病理基礎(chǔ)。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)切除的組織制備石蠟或冷凍切片標(biāo)本過(guò)程中，由于血流中斷或標(biāo)本的化學(xué)固定和乙醇脫水等步驟會(huì)導(dǎo)致組織收縮、分子易位和抗原封蔽等人工假象的產(chǎn)生[12]。IVCT技術(shù)能瞬間冷凍固定器官、組織、細(xì)胞，防止傳統(tǒng)方法制備標(biāo)本的人工假象[1-4]。我們首次通過(guò)異種移植A549細(xì)胞模型，明確IVCT制備的NSCLC標(biāo)本HE染色侵襲性組織的組織學(xué)特征，并結(jié)合Albumin、IgG1和IgM免疫組化染色分析[13]，得出Albumin、IgG1和IgM蛋白在非小細(xì)胞肺癌侵襲性組織中的表達(dá)及分布差異明顯的結(jié)論，進(jìn)一步說(shuō)明在腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的Albumin(分子量約67 kDa)、IgG1(分子量約170 kDa)和IgM(分子量約9700 kDa)蛋白表達(dá)可能與其分子量密切相關(guān)，反映了非小細(xì)胞肺癌侵襲組織中腫瘤細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用引起的局部微環(huán)境的變化。該研究[13]還表明，A549異種移植瘤組織中細(xì)胞外基質(zhì)Albumin、IgG1和IgM的免疫組化染色分布與VEGF和表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的表達(dá)無(wú)關(guān)。另外，還報(bào)道了EphA7蛋白表達(dá)與肺腺癌侵襲進(jìn)展無(wú)明顯關(guān)系，Ki67蛋白表達(dá)可能會(huì)影響肺腺癌侵襲[9]。本研究進(jìn)一步證明了A549細(xì)胞株移植瘤非侵襲組織血管、腫瘤間質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)Albumin和IgM蛋白均陽(yáng)性表達(dá)，與Albumin和IgM蛋白分子量無(wú)關(guān)。

HIF-1α是第一個(gè)被證實(shí)參與調(diào)控VEGF轉(zhuǎn)錄的因子。HIF-1α是HIF-1的活性亞基，是一種異源二聚體(bHLH-PAS)，包含堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)和PAS(Per/Amt/Sim)結(jié)構(gòu)，與炎癥和腫瘤血管生成等相關(guān)[14-15]。HIF-1α蛋白表達(dá)與肺鱗狀細(xì)胞癌和腺癌(非小細(xì)胞肺癌)組織的血管形成和VEGF蛋白表達(dá)相關(guān)[5]。但我們研究發(fā)現(xiàn)在大細(xì)胞肺癌移植瘤組織中HIF-1α蛋白與血清蛋白、VEGF、Ki67蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)，且與功能性血管數(shù)量多少無(wú)關(guān)[6]。為了進(jìn)一步研究分析HIF-1α蛋白在移植瘤肺腺癌組織的功能性血管和淋巴管生成及侵襲的關(guān)系，我們開(kāi)展了本次研究。

在本研究中，通過(guò)HIF-1α蛋白免疫組化分析發(fā)現(xiàn)A549移植瘤侵襲和非侵襲組織癌細(xì)胞均陰性表達(dá)，腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)，這與文獻(xiàn)[16]報(bào)道結(jié)果相同。我們推斷，HIF-1α蛋白陰性表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性有關(guān)，但是與A549移植瘤組織血清蛋白相關(guān)的功能性血管分布無(wú)關(guān)。移植瘤侵襲組織的功能性血管分布可能與血管結(jié)構(gòu)、血清蛋白分子量和電荷、腫瘤微環(huán)境等有關(guān)[1，3-4]。

注：圖A為A549移植瘤組織HE染色結(jié)果(×100)；圖B為L(zhǎng)YVE-1蛋白在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和某梭形細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒狀著色(×100)；圖C為L(zhǎng)YVE-1蛋白在侵襲組織組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和某梭形細(xì)胞漿活細(xì)胞膜呈棕黃色顆粒狀著色(×600)；圖D為L(zhǎng)YVE-1蛋白在非侵襲組織淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和某梭形細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色強(qiáng)著色(×600)

研究[4，17]表明，肺腺癌侵襲組織的功能性血管密度高于非侵襲組織，這可能與NSCLC VEGF蛋白表達(dá)相關(guān)，VEGF蛋白表達(dá)促進(jìn)了腫瘤周邊部位功能性血管生成，并為腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移奠定基礎(chǔ)。

除了功能性血管生成外，淋巴管生成也是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移所必需的。Skobe等[18]和沈小玥等[19]利用淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物L(fēng)YVE-1在乳腺癌、肺腺癌淋巴管增生和淋巴管不同分布進(jìn)行了研究。我們利用IVCT技術(shù)對(duì)小鼠腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞LYVE-1蛋白進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析，首次發(fā)現(xiàn)了淋巴結(jié)邊緣竇內(nèi)側(cè)和髓竇內(nèi)皮細(xì)胞LYVE-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)，但是邊緣竇外側(cè)內(nèi)皮細(xì)胞LYVE-1蛋白呈陰性表達(dá)[20]。本研究利用IVCT技術(shù)結(jié)合LYVE-1蛋白免疫組織化學(xué)染色技術(shù)研究了肺腺癌移植瘤侵襲和非侵襲組織中LYVE-1蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌侵襲組織LYVE-1蛋白陽(yáng)性的淋巴管密度高于非侵襲組織，該結(jié)果與沈小玥等[19]研究結(jié)果一致。并且，我們推斷該結(jié)果可能與VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)[4]。

綜上所述，HIF-1α蛋白表達(dá)與肺腺癌侵襲和功能性血管、淋巴管密度無(wú)關(guān)，但是功能性血管和淋巴管密度與肺腺癌的侵襲、發(fā)展密切相關(guān)。