基于單抗的免疫分析方法及其在獸藥殘留檢測中的應用

張小雨，李木子，秦立得，王曉茵，孫曉亮，曹旭敏，宋翠平，古少鵬，趙思俊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學，山西晉中 030801；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

食品安全問題一直以來備受關(guān)注，尤其是肉、蛋、奶中的獸藥殘留問題。造成動物源性食品中獸藥殘留超標的主要是抗生素、合成抗菌藥以及激素類和鎮(zhèn)靜劑類藥物。動物源性食品中的獸藥殘留不僅會對人類健康造成威脅，還會誘導藥物產(chǎn)生耐藥性，繼而引發(fā)公共衛(wèi)生問題，此外排入環(huán)境水體中的含有藥物殘留的動物糞便也會對生態(tài)環(huán)境安全造成影響[1-2]。因此，開展科學、有效的獸藥殘留檢測是監(jiān)督控制藥物濫用的手段之一。免疫學技術(shù)基于抗原、抗體的特異性反應，具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單、快捷等優(yōu)點，已被廣泛應用于獸藥殘留檢測[3]。使用免疫分析方法的關(guān)鍵是要獲得高質(zhì)量的特異性抗體，而單克隆抗體（簡稱單抗）是由單一B 細胞克隆產(chǎn)生的，僅針對某一特定抗原表位的抗體[4]，其理化性狀高度均一，生物活性單一，還具有純度高、制備成本低等特點，因此單抗技術(shù)的應用與發(fā)展，對免疫分析方法的普及起了巨大推動作用。為此，本文主要對單抗的制備及基于單抗的免疫分析方法在獸藥殘留檢測領(lǐng)域的應用進行簡要綜述。

1 單抗制備

1.1 人工抗原制備

獸藥的相對分子質(zhì)量一般都小于1 000，通常被認為是小分子，只有反應原性，缺乏免疫原性，屬于半抗原，因而常以牛血清白蛋白（BSA）[5]、卵清蛋白（OVA）[6]、血藍蛋白（KLH）[7]等蛋白質(zhì)作為載體，與其偶聯(lián)構(gòu)成完全抗原，以此作為免疫原免疫動物使其產(chǎn)生免疫反應。

1.1.1 完全抗原合成 人工抗原的制備主要取決于目標小分子的分子結(jié)構(gòu)，尤其是其活性基團的組成和化學結(jié)構(gòu)[5-6]。一般而言，若小分子包含一個活性基團，活性基團就可以直接與載體蛋白偶聯(lián)成一個完全抗原。如果小分子不具有可與載體蛋白直接偶連的基團，則需要通過氧化、水解或還原等反應，獲得活性基團后再與載體蛋白進行偶聯(lián)[8]，而衍生物的產(chǎn)生使原有化學結(jié)構(gòu)特征發(fā)生變化，進而會對免疫學特性造成一定影響，因此在化學改造過程中需引起注意。小分子的中間體也可用于合成含有代謝物或降解產(chǎn)物的半抗原。小分子與載體蛋白常見的偶聯(lián)方法有碳二亞胺法[9]、戊二醛法[6]、重氮化法[10]、混合酸酐法[7]、活性酯法[5]、物理法[11]等。根據(jù)小分子半抗原的結(jié)構(gòu)不同可選擇不同的偶聯(lián)方法：（1）通過碳二亞胺法、混合酸酐法和活性酯法，將小分子的羧基與載體蛋白的氨基進行偶聯(lián)[12]，如雌二醇[5]、頭孢噻呋鈉[9]。（2）通過重氮法、戊二醛法，將其與載體蛋白偶聯(lián)，如磺胺氯吡嗪鈉[10]、克倫特羅[6]。（3）在不破壞小分子結(jié)構(gòu)的情況下，利用離子之間的相互作用和疏水性，通過物理偶聯(lián)方式與蛋白質(zhì)結(jié)合形成完整抗原，如Liu等[13]制備的氨芐青霉素（AMP）人工抗原。為了突出小分子的結(jié)構(gòu)特征位點，無論采用哪種偶聯(lián)方法，小分子與蛋白質(zhì)之間都有一定長度的連接臂。該結(jié)構(gòu)的存在有利于產(chǎn)生針對目標小分子的抗體，且小分子與蛋白質(zhì)的摩爾比通常為15:1～20:1[14]。

1.1.2 完全抗原純化與鑒定 偶聯(lián)反應產(chǎn)物中包含半抗原與蛋白的偶聯(lián)物、未反應的半抗原、游離的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)自身聚合物，所以要對反應產(chǎn)物進行純化，以獲得純度較高的人工抗原。常用的純化方法有離心、透析和層析。除此之外，還要對人工合成的抗原進行鑒定，判定其結(jié)合情況。常用的抗原鑒定方法有動物免疫法[15]、電泳法[16]、光譜法[17]、質(zhì)譜法[18]等。

1.2 單抗制備

用來制備單抗的動物主要有小鼠、大鼠和兔。動物種類的選擇取決于所使用的骨髓瘤細胞類型。用于雜交瘤技術(shù)的小鼠骨髓瘤細胞系一般來源于BALB/c 小鼠，而大鼠骨髓瘤細胞系一般來源于LOU/c 大鼠，因此BALB/c 小鼠、LOU/c 大鼠是雜交瘤生產(chǎn)最常用的免疫動物。兔單抗是Katherine等[19]于1995 年首次在轉(zhuǎn)基因兔中成功制得骨髓瘤樣腫瘤后，又經(jīng)Pytela 等[20]不斷改進最終開始生產(chǎn)的。實驗室常選擇新西蘭大白兔或日本單耳白家兔用于兔單抗制備。比起鼠單抗，兔單抗具有諸多優(yōu)點：兔抗血清中的抗體親合力通常較高，并且與鼠抗血清相比，還可識別更多的表位；兔單抗能識別許多不能引起小鼠明顯免疫效果的抗原；此外，兔的脾臟更大，不僅可以將其用于更多的融合試驗，還可大大提高高通量篩選融合細胞的可能性。

免疫方案應根據(jù)抗原性質(zhì)不同而定，選擇合適的免疫方案有利于提高細胞融合的成功率，并獲得高質(zhì)量抗體。免疫方案包括的因素有很多，如抗原性質(zhì)、純度、數(shù)量以及間隔時間、免疫途徑、免疫次數(shù)、佐劑選擇等。免疫間隔時間應當適宜，因為抗原刺激的時間間隔對再次引起的免疫應答水平起決定性作用。若間隔過短，則應答效果降低。這是因為初次應答產(chǎn)生的抗體水平依舊很高，可與再次刺激的抗原相結(jié)合，形成抗原-抗體復合物而被迅速清除[21]；免疫過于頻繁，還可造成免疫原過量，使機體產(chǎn)生免疫耐受。若間隔太長，則應答效果也會降低。這是因為初次免疫后產(chǎn)生的抗體先呈對數(shù)增值，到達頂峰后就會激活機體的抑制作用，抗體增長速度開始下降，若此時對動物加強免疫則產(chǎn)生的抗體水平較低。常用的獸用免疫佐劑[22]包括油佐劑、蜂膠佐劑、脂質(zhì)體佐劑、藥物類佐劑、微生物成分及其產(chǎn)物佐劑、鋁膠佐劑。常用的免疫途徑包括皮下、肌內(nèi)、靜脈和腹腔注射等。綜合考慮免疫操作方便程度與抗體效價等因素，實驗室操作普遍采用皮下注射[23]。

應用雜交瘤技術(shù)制備目的小分子藥物的單抗，通常選擇6～8 周齡的BALB/c 小鼠，一般需要免疫4 次，免疫時通常加入弗式佐劑，免疫間隔時間一般為14 d 左右，每次免疫后7 d 檢測效價，若第3次免疫后測定效價在1:10 000 以上則可以進行細胞融合。取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞用化學融合劑（聚乙二醇）[15]、物理方法（電刺激）[24]或者生物方法（仙臺病毒）[25]促使這兩種細胞融合，再用HAT 培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)，得到融合的雜交瘤細胞，用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）篩選出能分泌目標抗體的陽性雜交瘤細胞并進行培養(yǎng)并克隆。采用紫外分光光度法[26]、SDS-PAGE 電泳法[18]（或結(jié)合薄層掃描分析[27]）、ELISA[28]和Western Blot[29]等方法測定純化率、回收率以及免疫活性，以鑒定純化抗體。

2 在獸藥殘留檢測中的應用

ELISA與膠體金免疫層析法（gold immunochromatographic assay，GICA）是目前應用最廣泛的基于單抗的獸藥殘留檢測方法。目前，基于單抗制備的獸藥殘留ELISA 檢測試劑盒、膠體金檢測試紙條等被廣泛使用，其準確度和精密度都符合國家要求；多數(shù)產(chǎn)品在研制的過程中不僅對其檢測限、特異性進行了驗證，同時選取一定的樣品基質(zhì)進行了檢測，均取得較優(yōu)的檢測效果。但有一些檢測方法或許是因為基質(zhì)效應等問題，有一定的適用范圍，不能用于所有的樣品檢測。

2.1 抗生素類

Burkin 等[30]用離子載體抗生素鹽霉素（SAL）與BSA 的結(jié)合物作為免疫原免疫家兔，從而產(chǎn)生了能夠緊密識別SAL（100%）及其結(jié)構(gòu)類似物NAR（96.5%）的多克隆抗體，基于此建立了一種檢測雞肉、雞蛋、牛奶中鹽霉素的ELISA 方法。該方法對于SAL 及其甲基衍生物納拉辛（NAR）的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.55 ng/mL 和0.57 ng/mL。值得注意的是此研究第一次報道了通過使用有機溶劑進行特殊的樣品預處理，可使牛奶中的基質(zhì)效應基本消除，平均回收率從32%提高到93%，并闡明該現(xiàn)象與牛奶中的Na+和K+有關(guān)。同時也對雞肉與雞蛋進行了預處理，發(fā)現(xiàn)一種簡單的緩沖液提取法足以使雞肉中的回收率高達87%～110%。對于雞蛋，用乙腈（ACN）處理勻漿隨后蒸發(fā)溶劑，可消除蛋液中的基質(zhì)效應使回收率達67%～108%。

阿維菌素類藥物（AVMs）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類新的大環(huán)內(nèi)酯類抗寄生蟲藥物，包括阿維菌素（AVM）、伊維菌素（IVM）、依普利霉素（EPR）和?，斁兀‥MA）等。Ni 等[31]選擇AVM 的C4-OH 作為偶聯(lián)位點與載體蛋白KLH 偶聯(lián)制備免疫原，以突出顯示屬于免疫活性部分的AVM 的非糖部分，使AVM 的抗原決定簇遠離C4-OH，并最大程度地突出AVMs 的共同結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：制備的單抗具有廣譜特異性，所建立的間接競爭ELISA（ic-ELISA）方法對豬肉、肝臟、腎臟、牛肉和牛奶樣品中的AVMs 的交叉反應率分別為IVM（100%）、AVM（141.8%）、EPR（51.2%）和EMA（48.7%）。該方法對各種基質(zhì)樣品中AVMs 的檢測限和定量限分別為0.5～5.4 μg/L和1.0～10.3 μg/L，方法回收率在78.1%～110.5%的范圍內(nèi)，變異系數(shù)低于14%。該方法制備的廣譜特異性單抗及簡單的樣品制備方法，有利于實現(xiàn)AVMs 殘留的高通量分析。

Guo 等[32]分別應用克林霉素（CLIN）、林可霉素（LIN）和吡利霉素（PIR）免疫小鼠，選出免疫效果最好的小鼠制備單抗并建立了GICA。該方法可在15 min 內(nèi)用肉眼對試紙條結(jié)果進行半定量評估，磷酸鹽緩沖液中的LOD 分別為CLIN（1 ng/mL）、LIN（10 ng/mL）和PIR（25 ng/mL），此外在牛奶、雞蛋、牛肉和蜂蜜樣品中的CLIN、LIN 和PIR 的檢測限均可以滿足檢測要求。

2.2 化學合成抗菌藥

王宇等[33]以氟甲喹（FLU）為原料建立了基于最佳異源包被（FLU-OVA）的ELISA。該方法的IC50為26.3 μg/L，檢測限為4.0 μg/L，定量檢測范圍為8.0～114.0 μg/L（IC20—IC80），且與其他喹諾酮類藥物及其結(jié)構(gòu)類似物幾乎沒有交叉反應，特異性高。楊熠等[17]使用活性脂法，把恩諾沙星與載體蛋白OVA 進行偶聯(lián)制備免疫原并制備了特異性的卵黃抗體，用ic-ELISA 確定包被原質(zhì)量濃度為38 ng/mL，卵黃抗體的稀釋倍數(shù)為1:64 000，方法的靈敏度（IC50）為18.207 ng/mL，LOD 為4.323 ng/mL，檢測范圍為7.350～45.102 ng/mL。與以往報道的方法相比，該方法較為靈敏，易操作，檢測范圍相對適宜。Lu 等[7]建立了可快速檢測鯰魚樣品中硝基呋喃代謝物（AMOZ）的ic-ELISA與膠體金免疫層析試紙條，ic-ELISA 方法IC50為0.049 ng/mL，膠體金免疫層析試紙條的cut-off 為0.1 μg/kg，與之前的研究相比，具有較低的cut-off（0.1 μg/kg）和LOD（0.009 μg/kg）。免疫層析檢測與ic-ELISA 檢測的結(jié)果相關(guān)性較高，這一點已由LC-MS 確認。因此，該檢測方法可作為檢測AMOZ 的現(xiàn)場篩查工具，具有較高的靈敏度。

2.3 激素類和β-受體激動劑類藥物

Wei 等[6]以戊二醛為交聯(lián)劑，使其兩個醛基分別結(jié)合微懸臂梁L-半胱氨酸的氨基與克倫特羅（CL）-OVA，一旦CL 抗體與CL-OVA 結(jié)合，微懸臂梁的表面應力就會發(fā)生變化從而發(fā)生偏轉(zhuǎn)。微懸臂梁免疫傳感器表面形成的免疫復合物越多，發(fā)生的偏轉(zhuǎn)反應越大，因此微懸臂梁偏轉(zhuǎn)反應程度與CL濃度呈正相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，該方法與沙丁胺醇、萊克多巴胺和多巴酚丁胺均無交叉反應。以豬肉為基質(zhì)樣本監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，該方法幾乎不受基質(zhì)干擾，檢測限低至1.0×10-2μg/L，表明所制備的免疫傳感器對檢測CL 具有較高的靈敏度。

Wang 等[28]以制得的抗氫化可的松（HDS）單抗建立了可檢測牛奶中HDS 的ic-ELISA 方法和免疫層析法。該方法的IC50為0.095 ng/mL，檢測限為0.013 ng/mL，線性檢測范圍為0.026～0.356 ng/mL，與HDS 類似物的交叉反應性＜5%。研究開發(fā)的ic-ELISA 和條帶分析法能夠快速、靈敏地檢測牛奶樣本中的HDS 殘留，其中免疫層析法在5～10 min 內(nèi)即可產(chǎn)生結(jié)果。

Yang 等[15]以己烯雌酚（DES）偶聯(lián)BSA 免疫小鼠制成高親和力、特異性單抗，建立了可檢測魚肉及豬肉中DES 殘留的ic-ELISA 方法。該方法靈敏度為0.49 μg/kg，檢測限為0.075 μg/kg，比色譜、液相等儀器分析更具成本效益，所需時間更短，并且易于專業(yè)人員操作。因此，其有可能成為檢測動物源性食品樣品中DES 殘留的快速篩查工具。

2.4 鎮(zhèn)靜劑類藥物

Shan 等[34]以小分子藥物氯硝西泮偶聯(lián)BSA作為免疫原，免疫小鼠制得單抗，并以此建立了可同時檢測豬樣品（肌肉、肝臟和腎臟）中氯硝西泮、氟硝西泮、硝西泮、地西泮和奧沙西泮等5 種苯二氮卓類藥物的間接ELISA 方法。該方法不僅廣譜而且檢測限低至0.2～1.5 ng/mL。Wang 等[35]利用制備的地西泮簇特異性單抗，建立了可同時檢測7 種苯二氮卓類藥物的ic-ELISA 方法，交叉反應率從高到低依次為去甲西泮（140%）、地西泮（100%）、硝西泮（49%）、替馬西泮（32%）、奧沙西泮（17%）、艾司唑侖（7.5%）和阿普唑侖（2.4%）。該方法的IC50為8.9 ng/mL，且不需要復雜的樣品制備和清洗，確保了更大的檢測量，并滿足了苯二氮卓殘留分析的要求。孫文佳等[36]首次報道了基于氯丙嗪（CPZ）建立的間接競爭化學發(fā)光酶免疫檢測方法。該方法的IC50為0.12 μg/L，檢測限為0.02 μg/L，線性范圍為0.02～24.78 μg/L，以豬肉為基質(zhì)檢測的回收率為87.4%～105.6%；與其他結(jié)構(gòu)類似物沒有明顯交叉反應，具有較高的靈敏度和較好的穩(wěn)定性。劉偉[37]等第一次制備了氯丙嗪（CP）的單抗，并建立了對應的ic-ELISA 法。該方法的IC50為0.73 ng/mL，明顯優(yōu)于之前文獻報道的ELISA 法（IC50為20 ng/mL）。

3 展望

近年來小分子化合物檢測方法的研究日趨多樣化。在單抗科技蓬勃發(fā)展的同時，也促進了商品化免疫試劑盒的普及，以單抗為基礎的食品檢驗系統(tǒng)將在國際市場中占有日益重要的地位。雖然ELISA 與GICA 被廣泛使用，但這些方法在實際檢測中有一定的局限性：高度特異性的單殘留檢驗產(chǎn)品通常只能檢出一種靶標化合物，而在實際工作中往往偏向于需要快速檢出多種藥物殘留；基于GICA 的多殘留檢驗產(chǎn)品也均限于單個檢測線的多殘留檢驗。因此，此類快速檢驗的產(chǎn)品往往無法精確界定、量化，且僅限于對幾種藥物的檢測，僅適用于對樣品的初篩。

很多學者認為ELISA法與GICA法簡單、快速、靈敏且檢測產(chǎn)品攜帶方便，是現(xiàn)場即時篩查的一種理想手段[38]。依前文所述，該方法雖然優(yōu)點居多，但其實現(xiàn)快速、準確呈現(xiàn)結(jié)果需基于對樣品進行一定的前處理，而最簡單的前處理方法也需要對樣品進行離心、稀釋、過濾等操作，檢測復雜樣品時則前處理會更加復雜，因此其便捷僅僅建立在對藥物的測定環(huán)節(jié)。ELISA 法與GICA 法在實際操作中較易出現(xiàn)假陽性，這也給實際操作帶來了困擾。傳統(tǒng)的具有一條檢測線的膠體金免疫層析產(chǎn)品，只可以定性檢測樣品中的一種藥物，或者對樣品中的某種藥物進行半定量。雖然可以通過在同一層析膜上組合多條單一顏色檢測線來改善其檢測范圍和定量精度[39]，但由于檢測線與樣品墊距離的延長，不僅反應時間被延長，還存在更多無法預估的干擾[40]。

研究新型的免疫分析技術(shù)，可提高檢驗敏感度、穩(wěn)定性、特異性、便捷性和檢測通量。例如，通過研究納米材料聚集實現(xiàn)免疫層析試紙條（ICTS）的信號放大。因為單個納米材料發(fā)光強度是有限的，為了增強檢測信號強度，研究者開始探索將納米材料聚集在一起來實現(xiàn)信號增強的目的。Yao等[41]將納米金材料分別標記抗體和抗抗體，使其在試紙條上形成納米金-抗體-二抗-納米金復合物進而實現(xiàn)了納米金材料的聚集。該方法對17β-雌二醇的檢測限為0.5 ng/mL，和傳統(tǒng)方法相比，靈敏度提高了3 倍。Yin 等[42]通過納米金材料的聚集實現(xiàn)了對食品樣品（豬肉、蝦和雞蛋）中的呋喃唑酮代謝物檢測，檢測限低至0.6 ng/mL。

為進一步探索單抗在獸藥殘留檢測中的應用，結(jié)合采用表面增強拉曼光譜（SERS）技術(shù)和金標檢測試紙（LFA）實現(xiàn)超靈敏檢測[43]，采用微流控免疫分析芯片技術(shù)聯(lián)合ELISA 的原理實現(xiàn)高通量檢測[44]等。諸多研究將為基于單抗的免疫分析方法在獸藥殘留檢測中的應用提供新思路。